Este trabalho é apoiado pelo Conselho Australiano de Pesquisa (ARC DP0988227) eo Biomedical Science Research Initiative Grant da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O Amplificador de patch clamp equipamento EPC 8 foi financiado pelo Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O equipamento Instrutech LIH 8 8 Sistema de Aquisição de Dados foi comprado com os fundos de Rebecca L. Cooper Foundation e do Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários perspicazes.

1. Geral Configuração e Preparação Tissue <ol><li> Mantenha o mouse na escuridão por 30 min (visam reduzir o seu nível de stress). Enquanto espera, se preparar uma solução de L extracelular. Primeiro dissolver 1,9 g de bicarbonato de sódio em meio litro de água Milli-Q. O seu pH é mantido a 7,4 por borbulhamento com 95% de O2 e 5% de CO 2. Cinco minutos mais tarde, dissolver 8,8 g de Ames Médio em 100 ml de água Milli-Q, adicionar à solução de bicarbonato de sódio, superior até 1 I com água Milli-Q e misturar bem. Manter esta solução carboxygenated para o resto da experiência. </li><li> Tome 250 ml da carboxygenated Ames Médio e configurar o sistema de reperfusão líquido no eletrofisiológico set-up. Manter a solução carboxygenated. </li><li> Uniformemente esfregaço de uma fina camada de gordura de vácuo na parte inferior da câmara de perfusão. Selá-lo com uma lamínula e verifique se ele é hermético. Pegue uma pequena quantidade de graxa (~ 2 mm de diâmetro) e coloque-o na parte superior eextremidades inferiores da câmara. Estas bolas realizará a grade (armação de platina amarrados com fio dental) no lugar e impedi-lo pressionando muito difícil na retina. Fixe a câmara para a plataforma e alinhar as duas aberturas. </li><li> O animal é primeiro anestesiados com isoflurano durante 2 min, e depois sacrificados por deslocamento cervical. Remover rapidamente os olhos com um par de pequenas tesouras (lâminas curvas), lave com líquido extracelular carboxygenated em um pequeno recipiente e coloque em um prato de Petri cheia de líquido extracelular carboxygenated. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, fazer um furo de inserção na córnea (~ 2 mm a partir da borda) utilizando uma agulha de calibre 19. Repetir para o outro olho. Este importante passo deve ser rápido para permitir a oxigenação da retina tanto. Remover uma córnea com um pequeno par de tesouras iris cortando paralelamente à sua borda. Em seguida, remova a íris e lente com um par de pinças finas. Repetir para o outro olho. Transferir um copo de olho em um copo contendocarboxygenated solução extracelular. </li><li> Com uma lâmina de bisturi, cortar um copo ocular para metade, para poder nivelar o conjunto de montagem e para obter duas montagens por inteiro retina. Separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar, utilizando uma sonda de dissecação sem corte ou puxando-a suavemente. Uma vez separado, a retina é bastante transparente. Observe a superfície convexa é o lado do fotorreceptores. A superfície côncava é de células do gânglio lateral e pode colar-se a si mesmo devido à presença de humor vítreo pegajoso. </li><li> Com um par de uma pinça fina, segure a borda do tecido isolada perto da retina a ora serrata e agarrar ora serrata com outro par de uma pinça fina, puxe-o para o centro da retina. Este é um processo delicado e pode demorar algumas tentativas. Se for bem sucedido, ora serrata, corpo ciliar e humor vítreo são removidas por este processo, e a curvatura da retina é reduzida (isto é, mais planas). </li><li> Apare as bordas e, em seguida, transferi-lo para o percâmara de fusão com as células ganglionares para cima. Segurar o tecido no seu lugar por colocação da grelha para as esferas de gordura. Colocar o tecido restante com a outra taça dos olhos para uso posterior. Procedimentos semelhantes para dissecção da retina são descritos em Middleton e Protti 16 e Pottek et al. 17. </li><li> Monte a câmara de gravação sob um microscópio vertical. Configurar imediatamente a perfusão contínua da retina com uma solução extracelular carboxygenated (35,5 ° C) a uma taxa de 3-5 ml / min. Certifique-se o eletrodo de aterramento está no lugar. </li><li> Ligado ao microscópio é uma câmara digital, permitindo a visualização do tecido. O conjunto se senta por cima de uma mesa de ar (absorção de choque) e dentro de uma gaiola Faraday (blocos de campos elétricos estáticos e não-estáticos externos). </li><li> Ligue a fonte de luz (infravermelha,&gt; 850 nm) e com uma objectiva de 40x, trazer o seu foco para os corpos celulares de células ganglionares. Encontre a área central do conjunto de montagem para recording. </li><li> Descongelar um frasco congelado de K + solução baseada intracelular (300 ul, pH = 7,4) contendo (em mM) de K-gluconato: 140, HEPES ácido: 10, MgCl 2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0,4 e EGTA: 10. Todos os reagentes adquiridos da Sigma-Aldrich. </li></ol> 2. Corpos celulares patching de células ganglionares da retina <ol><li> Primeiro fogo polir as extremidades dos tubos de vidro de borosilicato capilar, em seguida, retirá-los com um puxador de microeletrodos de vidro com duas etapas de aquecimento (resistência: 5-8 mohms). </li><li> Adiciona-se 3 ul de Amarelo Lúcifer (concentração final de 0,2%) para a solução intracelular, misturar bem e centrifugar. Ainda, a transferência da parte superior de 85% da solução numa seringa de 1 ml, ligá-lo a uma unidade mM ilter f 0,22, em seguida, para uma agulha hipodérmica L reutilizável 30. Leve à geladeira. </li><li> Fixe a pipeta de vidro, de tamanho semelhante ponta como aqueles usados ​​para as gravações, no seu suporte e movê-lo ao microscópio utilizando um micromanipulator. Abaixo de uma objectiva de 40x, diminuir lentamente a pipeta até que ela faça uma covinha na superfície da membrana limitante interna. Avançar cuidadosamente a pipeta para a frente até que ele apanha uma pequena quantidade de tecido, e em seguida movê-lo para cima e / ou lateralmente para rasgar de um pequeno orifício para expor os corpos celulares das células ganglionares. Quanto menor o furo, maior o grau de integridade da rede da retina é mantida. Se desejado, sulforrodamina 101 (SR101, 0,5-1 uM) podem ser adicionados ao meio extracelular para rotular os neurónios danificados por meio de microscopia de fluorescência 15. </li><li> Encha uma pipeta limpa com 8-10 ml de solução intracelular. Inseri-lo no suporte ligado ao palco cabeça do amplificador e certifique-se o eletrodo de cloreto de prata clorada está submerso. Descartar se a sujeira e / ou bolhas de ar é / está presente. </li><li> Ligue todos os equipamentos. Usamos um EPC 8 remendo amplificador braçadeira controlado por PatchMaster para conseguir gravações de célula inteira em con braçadeira de tensãofiguração. Note-se que outros amplificadores que permitem gravações de aperto actuais no modo rápido também podem ser usados. Aplicar e manter uma pressão positiva na solução da pipeta. Seleccionar uma célula com um corpo da célula grande, então o mais provável é uma célula de um gânglio da célula em vez de amacrina deslocada ou uma célula da glia. Lentamente, abaixe a ponta da pipeta de modo a fazer-se uma pequena ondulação na superfície da membrana, parar e libertar a pressão. Reduzir imediatamente o potencial de realização de - 60 mV. Uma vez que um gigaseal (GÊ) é atingido entre eles, sugar delicadamente para romper a membrana para obter uma configuração de fixação de membranas de células inteiras. Este procedimento é um passo delicado, se demasiada pressão negativa é aplicada, em seguida, a ligação torna-se frágil, se for demasiado pequeno, a membrana continua intacta. </li><li> Ao longo do tempo, Lucifer Yellow vai encher a célula, permitindo a visualização da morfologia das células. Se estável, este set-up deve durar 30 minutos ou mais. </li></ol> 3. Gravações das células ganglionares Usando Dynamic braçadeira <ol><li> Em primeiro lugar, a um teste de corrente e tensão (a partir de - 75 a + 35 mV cada 10 mV) é executado utilizando PatchMaster. Proceder a exames posteriores somente se uma grande corrente de Na + (&gt; 1 nA) está presente. Observe que, em uma rara ocasião em que uma célula amacrine deslocados é remendado, nesse caso, não vai responder com trens de potenciais de ação para injeções atuais subseqüentes. </li><li> Abra o LabVIEW e executar o programa personalizado Neuroakuma escrito, em seguida, coloque a condutância várias formas de onda. Definir o número de repetição a 8 (6-8 para fins estatísticos). Definir potencial de reversão de condutâncias excitatórios e inibitórios em 0 e - 75 mV, respectivamente. Selecione um par correspondente de condutâncias excitatórios e inibitórios para o teste. Traço condutância excitatório (em verde) e trace condutância inibitória (em vermelho) aparecerá na parte inferior do painel. </li><li> Volte para PatchMaster, selecione o modo de fixação atual e mudar imediatamente o amplificador para o modo pinça de corrente &#39;CC + Comm FAST&#39;. Este modo permite a accurately acompanhar as rápidas mudanças no potencial da membrana. Se uma boa vedação entre a membrana ea pipeta é mantida, pouco / não é necessária uma compensação, caso contrário, a gravação não vai durar muito. Em Neuroakuma, pressione o botão &quot;record&quot;. A resposta celular (geralmente com uma explosão fásica de potenciais de acção, a Figura 1A) aparece no painel superior. Injectar corrente para dentro da célula com baixa escala de condutâncias em primeiro lugar, se pouca / nenhuma resposta é observada, aumentar em pequenos incrementos até que se produza uma resposta forte. Injecção de excesso de corrente pode matar a célula. Uma vez que os testes forem concluídos, selecione um novo par de condutância formas de onda, repita o procedimento acima para todos os pares de condutâncias fisiológicas e artificial. As correntes fisiológicas (I) injectados em tempo real são baseadas em: I (t) = L exc (t) x (V m (t) - V iva) + L inh (t) x (V m (t) - V INH) </li></ol> Condutância (G IN NS) poderia ser synaptic ou artificial. Excitatórios e inibitórios condutância sináptica formas de onda foram coletados a partir de experiências anteriores realizadas por Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen e Salomão (resultados não publicados), em resposta a diferentes estímulos visuais em condições de controle e na presença de tetrodotoxina (TTX, um M) . Condutância onda artificial foram modelados usando uma função alfa. V m (em mV) é o potencial da membrana registado. Exc G e L inh representar condutâncias excitatórios e inibitórios, respectivamente, enquanto exc V e V inh representam os potenciais de inversão de condutâncias excitatórios e inibitórios, respectivamente. Horário t em ms. Taxa de amostragem é de 40 kHz. I I 0 = s (t / α) e-aT A equação acima é uma função alfa (I 0 = corrente máxima, 1 / α = tempo de pico (seg -1) de corrente). O tempo de subida e tempo de decaimento do sinápticaatual é ditada por α 4. A condutância permaneceu inalterada, enquanto excitatório a latência da condutância inibitória foi modificado, reduzindo o seu atraso em relação ao início da excitação (Figura 2D). <ol start="4"><li> Após a gravação, retirar cuidadosamente a pipeta de modo que o corpo da célula permanece intacta. Imediatamente fixar o tecido em paraformaldeído a 4% durante 30 minutos, seguido por três lavagens de 10 min com 0,1 M de tampão de fosfato. Refrigerar e realizar a coloração de anticorpos no dia seguinte, ou no prazo de uma semana. </li></ol> 4. Coloração de anticorpos contra Lúcifer amarelo enchido células ganglionares da retina <ol><li> Coloração de anticorpos contra células ganglionares Lucifer Yellow cheias à temperatura ambiente (o anticorpo primário anti-IgG de coelho Amarelo Lúcifer (= diluição de 1:10.000) durante cinco dias, no sexto dia, a coloração durante a noite com secundário de cabra anti-IgG de coelho (diluição 1:500 = )). Molhe montar a retina em fluorescentes mídia Preservando. Cubra escorregar e selar com prego polish. </li><li> Tome imagens confocais da morfologia celular utilizando um Spec II microscópio confocal Leica (Figura 1B). A presença de um axónio permite a confirmação das células ganglionares. </li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li><li>Johnson, D., Wu, S. M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).</li><li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina.">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li><li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research.">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li><li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons.">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li><li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices.">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li><li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons:+a+dynamic+clamp+study.">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li><li>Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+for+improving+dynamic+clamp+performance.+In:+Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series.">Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series.</a> Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).</li><li>Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation.">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li><li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+technique:+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering.">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique.">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li><li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells.">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li><li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

Todos os procedimentos foram aprovados pela primeira vez pelo Comitê de Ética do Cuidado Animal da Universidade de Sydney, e depois executadas de acordo com as diretrizes do Código brasileiro de Prática para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos (National Health and Medical Research Council da Austrália ).

Aqui demonstramos a utilização de uma pinça dinâmico para avaliar a influência da proporção e temporização relativa de excitação e de inibição sobre a produção de células ganglionares da retina. Braçadeira dinâmica faz uso de simulações de computador para introduzir condutâncias sinápticas fisiologicamente gravados ou artificial em neurônios vivos. Esta metodologia proporciona uma ferramenta interactiva através da qual pode ser modificado condutâncias e injectado neurónios para se calcular a su...

A retina é um tecido neural quase transparente que reveste a parte de trás do olho. Muitos estudos utilizam a retina como modelo para investigar os primeiros passos de processamento visual e os mecanismos de sinalização sinápticos. Uma vez que a rede de retina na preparação de toda a montagem permanece intacta após a dissecação,, representa um sistema ideal para estudar interacções sinápticas como as suas respostas fisiológicas são muito semelhantes à condições in vivo. Assim, usando uma retina isolado as propriedades de seus neurônios pode ser estudado usando técnicas de patch clamp (por comentários sobre a técnica, ver 6,9,13). Identificação da contribuição exacta dos circuitos e de neurotransmissores na resposta a células ganglionares específicos, no entanto, é geralmente dificultado actuar como agentes farmacológicos em vários sites. Respostas fisiológicas de neurônios da retina à luz, a estímulos naturais, podem ser gravados com pipetas de vidro preenchidos com fluido intracelular. Usando cl remendotécnicas ampères, respostas neuronais à estimulação de luz pode ser registrado como flutuações potenciais de membrana (pinça de corrente) ou como correntes (braçadeira de tensão). Ao manter o potencial de membrana a voltagens diferentes e execução de uma análise de condutância a posteriori, é possível isolar entradas sinápticos excitatórios e inibitórios 5,12. Este tipo de experiências pode ser levada a cabo em meio de banho normal e na presença de diferentes agentes farmacológicos para isolar a contribuição de diferentes neurotransmissores e receptores para respostas neuronais. A riqueza de estudos de muitos laboratórios caracteriza a dependência da cravação de saída e entradas excitatórios e inibitórios em propriedades de estímulo, como o tamanho, o contraste, frequências espaciais e temporais, direção, orientação e outras variáveis ​​de estímulo. Embora essas abordagens experimentais fornecem informações sobre a relação entre a saída de pico e entradas sinápticas em função das propriedades de estímulo,interpretação da contribuição de tipos específicos de células e suas entradas sinápticas a excitabilidade das células não é simples. Isto é devido ao facto de as entradas geralmente estimulantes e inibidores variar com as propriedades de estímulo e, assim, não é possível avaliar com precisão o impacto que as alterações em qualquer destas entradas tem sobre spiking neuronal. Uma abordagem alternativa para contornar essas limitações é realizar gravações braçadeira dinâmicos, que permitem uma avaliação crítica da contribuição de entradas sinápticas individuais para cravação de saída. A técnica de fixação dinâmica permite que a injecção directa de corrente para dentro da célula e a quantidade de corrente injectada num dado tempo depende do potencial da membrana registado naquele momento 1,2,3 (para revisão, ver 7,14). É uma pinça de corrente modificado set-up onde um tempo real, a interacção entre o retorno rápido de células sob o equipamento de gravação e que compreende hardware especializado, softwaree um computador é alcançado. A quantidade de corrente injectada para dentro da célula é calculado de acordo. Assim, a vantagem deste método é que a célula pode ser estimulada com diferentes combinações de formas de onda de condutância, e da sua resposta vai imitar a activação dos receptores que medeiam as entradas sinápticas. Por exemplo, a comparação da resposta à injecção de condutâncias excitatórios e inibitórios para um pequeno ponto com a resposta à injecção de condutância excitatória para uma pequena mancha apenas fornece informação sobre os efeitos da inibição da resposta celular. Da mesma forma, outras combinações de condutâncias fisiologicamente gravados podem ser co-injetado para revelar como as mudanças nas condutâncias excitatórios e / ou inibitórios estímulo-dependente afeta a saída de pico. No nosso estudo, a técnica de fixação dinâmico é usado para demonstrar o impacto da amplitude relativa e de sincronização de entradas sinápticas nas propriedades de queima de células ganglionares da retina. Vários condutânciasobtidas a partir de experiências de controlo, em condições fisiológicas, ou na presença de agentes farmacológicos foram utilizados como entradas. Além disso, as condutâncias artificiais baseados em funções alfa também foram utilizados para investigar a forma como entradas sinápticas são integrados pelos neurónios. Assim, esta é uma técnica versátil, que permite que os vários tipos de condutância gerado ou fisiologicamente ou farmacologicamente computacionalmente para ser injectado na mesma célula ganglionar, para comparação de respostas a estas entradas podem ser feitas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

As células são os neurónios do gânglio da retina de saída e da sua actividade reflecte a integração de múltiplas entradas sinápticas neuronais decorrentes de circuitos específicos. Técnicas de patch clamp, na braçadeira de tensão e configurações de fixação atuais, são comumente usados ​​para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios e caracterizar suas entradas sinápticas. Embora a aplicação destas técnicas é altamente informativos, que representam várias limitações. Por exemplo, é difícil de quantificar a forma como as interacções precisas das entradas excitatórios e inibitórios determinar saída de resposta. Para resolver esse problema, usamos uma técnica de modificação actual braçadeira, braçadeira de dinâmica, também chamada de condutância braçadeira 1, 2, 3 e examinou o impacto dos insumos sinápticos excitatórios e inibitórios na excitabilidade neuronal. Esta técnica requer a injecção de corrente para dentro da célula e é dependente da realimentação em tempo real o seu potencial de membrana em que o tempo. O INJECTEd atual é calculado a partir predeterminados condutâncias sinápticos excitatórios e inibitórios, suas potencialidades e potencial reversão instantânea membrana da célula. Os detalhes sobre os procedimentos experimentais, as células de fixação adesivo para conseguir uma configuração de célula inteira e emprego da técnica de fixação dinâmico são ilustradas neste artigo de vídeo. Aqui, mostramos as respostas das células ganglionares da retina de rato a várias formas de onda de condutância obtidos a partir de experiências de controlo em condições fisiológicas, ou na presença de fármacos. Além disso, mostram o uso de condutâncias excitatórios e inibitórios artificiais gerados usando funções alfa para investigar as respostas das células.

A contribuição das diferentes fontes de entradas inibitórias para as respostas das células ganglionares é demonstrado através da aplicação de vários condutância formas de onda. Estas formas de onda foram obtidos com estímulos de luminância diferente, em condições normais e na presença de TTX, um bloqueador por voltagem canal de Na + que bloqueia acção potencial de geração de apenas um subconjunto dos interneurónios inibitórios da retina. Figura 2A mostra uma resposta repr...

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Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K visualizações.  University of Sydney. Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Vídeo: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Isolamento da retina de camundongos e tratamento com metanol para estudar células ganglionares da retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor em destaque: Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...