Os estudos foram financiados pelo Wellcome Trust e UK Meningite. HBMEC linhagem de células foi fornecido pelo Dr. KS Kim. Imagem confocal e microscopia eletrônica foram realizados na Unidade de BioImaging Wolfson, da Universidade de Bristol. Gostaríamos também de agradecer ao senhor Alan Leard, Dr. Mark Jepson (University of Bristol), eo Sr. Alan Tilley (PerkinElmer) por sua ajuda e conselhos.

1. Imunofluorescência Protocolo Infecção semeadura, e coloração imuno- Os procedimentos a seguir exigem de segurança adequado nível de cultura de tecidos e instalações de laboratório de microbiologia. DIA 1 A. Preparação de células-alvo para a infecção <ol><li> HBMECs semente na confluência de 50% (~ 1.5x10 4 células / cm 2) em lamínulas (16 mm de diâmetro) colocados em uma placa de 12 poços (3,8 centímetros área de crescimento de 2 / poço). Meio de crescimento: RPMI 1640 suplementado com inativado pelo calor de 15% (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM de glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 1% (v / v) MEM aminoácidos não essenciais ácidos solução e 1% MEM solução vitaminas. </li><li> Cultura durante a noite (O / N) a 37 ° C, em 5% incubadora de CO 2. </li></ol> B. cultura bacteriana <ol><li> Crescer a tensão de interesse S / N (16-18 h) no meio de infusão por exemplo, necessários Brain Heart (BHI) placas de ágar suplementado com sangue de cavalo de 10% aquecida a 37 ° C em atmosfera de 5% CO 2 4. </li></ol> DIA 2 A. Preparação da suspensão (N. meningitidis) bacteriana <ol><li> Usando um loop cultura de 10 L, fazer uma suspensão da cultura durante a noite bacteriana em 2 mL PBSB (PBS com cálcio e magnésio). </li><li> Permitir grandes agregados bacterianos para resolver deixando a suspensão em repouso por 5 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Sem perturbar o sedimento, transferir o top 1 mL da suspensão (stock inóculo) em um tubo estéril. </li><li> Para calcular o número de bactérias no inóculo de ações, adicionar alíquotas (20-50 mL) para tubos contendo 1mL de volumes SDS 1% em NaOH 0,1 M e misture suavemente para solubilizar. </li><li> Medir o teor de ácidos nucleicos da solução através da determinação da absorbância a 260nm (A260). Em nossas mãos, A260 de 1 corresponde a 5x10 8 unidades formadoras de colônias / ml (ufc / mL). Isto pode ser verificado através da preparação de uma série de diluições do inóculo de ações em PBSB, chapeamento de fora em placas de ágar e contando colônias após S / N incubação. </li><li> Diluir uma alíquota do inóculo ações no meio infecção [(M199 suplementado com 2% decomplemented (56 ° C, 30min) normal de soro humano (NHS)] para obter a densidade requerida bacteriana na infecção de células-alvo. <ol><li> Em nosso laboratório, uma relação de infecção de 200-300 bactérias por célula-alvo é utilizada rotineiramente. </li></ol></li></ol> B. Infecção Cultura de Células <ol><li> Lavar as lamelas com células-alvo cultivadas 3 vezes com meio de Hank para remover qualquer traço de antibióticos. </li><li> Infectar as células com preparada suspensões bacterianas (descrito acima) por 3 horas a 8 horas a 37 ° C, em 5% CO 2. </li><li> No final do período de infecção, lave as células três vezes com PBS e fixar em 500 mL de paraformaldeído a 2% (PFA) por 30-45 min em temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. <ol><li> Fixação paraformaldeído na concentração e tempo mostrado acima foi considerada adequada para a preservação da morfologia bacteriana e celular. </li></ol></li><li> Após a lavagem off paraformaldeído, permeabilise as células paraformaldeído fixa, incubando em 0,1% Triton X-100 diluído em PBS por 10 min. </li><li> Lavar as amostras 3 vezes com PBS. </li><li> Proceder à coloração imuno-ou, alternativamente, deixar amostras em 500 mL de 1% BSA / PBST O / N a 4 ° C. </li></ol> DIA 3 Imuno-coloração Coloração de bactérias intracelulares e α-actinina podem ser realizadas sequencialmente ou simultaneamente com o uso de apropriados anticorpos primário e secundário como se segue; todos os procedimentos podem ser realizados em 12-lamelas. <ol><li> Bloquear a lamínulas contendo as células permeabilised com 500 mL de 3% BSA / PBST (PBS contendo 0,05% Triton X-100) por 30-60 min em temperatura ambiente </li><li> Após a lavagem com PBS, a transferência de cada lamela de um novo poço seco na placa de 12 poços. </li><li> Adicionar os anticorpos primários contra bactérias e α-actinina; oitenta a 100 mL de anticorpos por lamela é suficiente se adicionado cuidadosamente para cobrir a superfície da lamela. Incubar por 1h em temperatura ambiente. <ol><li> Usamos anti-soro de coelho policlonais contra Neisseria meningitidis (laboratório-raise) e anticorpo monoclonal (mAb) contra α-actinina (Abcam) simultaneamente. Em alguns experimentos, no lugar do anti α-actinina, mAbs contra actina ou vimentina foram utilizados (Sigma). </li></ol></li><li> No final da incubação, adicionar 200 mL de PBS para o bem, levante a lamela e colocar em um novo poço de PBS contendo 500 mL. </li><li> Após 5 min, retire PBS por pipetagem e adicione PBS fresco. Repita duas vezes. Transferência de lamínulas para umpoço seco novo. </li><li> Adicionar os anticorpos adequados secundário conjugado com fluorocromos diferentes diluído em BSA 1% / PBST; incubar a RT por 1h no escuro. <ol><li> Para a detecção bacteriana, utilizou-se anti-Ig de coelho conjugada à TRITC e para a detecção da proteína α-actinina e outros do citoesqueleto, usamos anti-rato conjugado com ou Ig FITC (Sigma) ou Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> No final da incubação, lavar como nos passos 4 e 5. </li><li> Contra mancha com 0,6 mg / mL em PBS DAPI (DNA da mancha) por 5 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar com PBS. </li><li> Monte lamínulas (células virada para baixo) em lâminas com uma gota de meio de montagem (e, g. Mowiol ou Vectashield) </li><li> Loja no escuro a 4 ° C. </li><li> As amostras estão prontas para a observação ao microscópio. </li></ol> 2. Microscopia Confocal Scanning Laser (CLSM) Para observar e captar imagens de bactérias intracelulares e elementos do citoesqueleto, nós usamos amostras immunolabelled e imagens captadas com uma Leica SP5-AOBS microscópio laser confocal anexado a uma Leica DM i6000 microscópio invertido de epifluorescência. Todas as imagens foram coletadas utilizando um 63x NA 1,4 objetivo de imersão em óleo e processar com o software Leica. CLSM procedimento: <ol><li> Para iniciar o procedimento CLSM, adicione uma gota de óleo de imersão para o objectivo e colocar a lâmina da amostra, lamela voltada para baixo, no palco microscópio. </li><li> Definir o microscópio para um modo visual e encontrar a área de interesse usando as peças olhos do microscópio. </li><li> Usando o software Leica, selecione o modo de aquisição xyz. </li><li> Selecione o formato de 512 x 512 (tamanho do quadro). Para estudos colocalisation, maior a resolução, mais precisa a imagem, tendo presente o limite de resolução do microscópio. Em seguida, selecione o modo bidirecional X, que irá aumentar a velocidade de digitalização e ajudar a reduzir a foto-branqueamento. </li><li> Configurar seqüencial configurações de digitalização. Clique em &quot;seq&quot; função e escolher um dos modos de digitalização. Usamos &quot;entre linhas&quot; mode. </li><li> Selecione a laser vigas de acordo com os fluorocromos conjugado com os anticorpos secundários: 405 nm para o DAPI (azul), 488 nm para Alexa Fluor 488 (verde) e 561 nm para TRITC (vermelho). Ativar tubo fotomultiplicador (PMT) 1, 2 e 3, respectivamente. Ajustar as configurações de PMT para detectar o comprimento de onda de emissão correta. </li><li> Configurar superior (&quot;begin&quot;) e inferior (&quot;end&quot;) de z-stacks ou série. Em seguida, defina a necessária &quot;tamanho z-passo&quot;. <ol><li> Neisseria meningitidis é um diplococos (Figura 1G) e uma vez que cada coccus tem um diâmetro aproximado de 0,5 m, o tamanho do z-passo de 0,20 mM foi escolhido para aumentar a probabilidade de digitalização de cada coccus pelo menos duas vezes. Ele também está dentro do tamanho do passo para a melhor resolução de 0,1 - 0,2 mm. </li></ol></li><li> Definir os parâmetros de digitalização final, selecionando uma média de linha de 3 para melhorar a relação sinal-ruído. </li><li> Ao clicar em &quot;start&quot; imagens duplas ou triplas manchadas são obtidos através de varredura seqüencial em comprimentos de onda diferentes para eliminar cross-talk entre cromóforos diferentes. </li><li> Para uma indicação de colocalisation de dois fluorocromos, selecione a opção &quot;overlay&quot; função de mesclar canais selecionados em uma única imagem, por exemplo, quando ambos Alexa 488 (verde) e TRITC (vermelho) fluorocromos colocalise, cor amarela irá aparecer na imagem sobreposta . </li><li> Compile z-pilhas ou séries com o &quot;máximo de projeção&quot; função para a construção de uma imagem 2D necessária para visualizar colocalisation possível. Análise mais detalhada da colocalisation podem ser obtidas através da análise de cada seção óptica. </li><li> Depois de adquirir o z-pilhas ou séries, processar os seus dados para obter uma imagem ortogonais para visualização da localização intracelular de vários elementos (Figura 1E). </li></ol> 3. Quantificação de Colocalisation Análises estatísticas das imagens microscópio de varredura confocal são realizados com software Volocity (Improvisação, PerkinElmer). Este software fornece uma ferramenta desenhada especificamente para a análise colocalisation como descrito por Manders et al. (1993) 5. Colocalisation no contexto de imagens de fluorescência digital pode ser descrito como a detecção de um sinal no mesmo voxel (volume pixel) local em cada canal. Os dois canais são formados por imagens de dois fluorocromos diferentes tomadas da área de mesma amostra (guia do usuário Volocity). Análises estatísticas são realizados com software Volocity (Improvisação, PerkinElmer), utilizando análise quantitativa Colocalisation descrito abaixo. Análise quantitativa Colocalisation <ol><li> Criar uma biblioteca com imagens CLSM usando software Volocity. </li><li> Selecione &quot;foco ampliado&quot; a partir da imagem na barra superior. Esta ferramenta irá compilar z-pilhas em uma imagem 2D a ser analisado. </li><li> Selecione &quot;co-localização&quot; ferramenta. Os dois canais a serem analisados ​​devem ter a mesma profundidade de cor. </li><li> Selecione a área que vai ser quantificados. Definir o limite para remover qualquer fundo. </li><li> Criar a saída colocalisation selecionando &quot;gerar co-localização&quot;. Colocalisation estatísticas são geradas para as regiões de interesse selecionadas anteriormente. </li><li> Coeficientes Manders selecionar &#39;R (coeficiente de sobreposição) e My (coeficiente colocalisation). <ol><li> Coeficientes Manders &quot;não são sensíveis à intensidade da coloração como eles são normalizados contra a intensidade total de pixels, assim eles podem ser empregados quando a coloração de um antígeno é mais forte que o outro. </li><li> Sobreposição R coeficiente de acordo com Manders 5,6 representa o verdadeiro grau de colocalisation, ou seja, o número de pixels que colocalise comparado com o número total de pixels. </li><li> Por outro lado, o coeficiente colocalisation, My, descreve a contribuição de fluorescência da fracção mais abundante (neste caso, α-actinina, verde) para a fracção menos abundante (neste caso, as bactérias, vermelho), ou seja, o número de pixels vermelhos que se sobrepõem com pixels verde em comparação com o número total de pixels vermelhos. </li><li> Coeficientes Manders &quot;variam entre 1 e 0, sendo 1 colocalisation alto, 0 não sendo, mas que pode ser expresso como porcentagem para facilitar a interpretação. </li></ol></li><li> Os valores das exportações estatísticas para um documento Excel para apresentação de dados. </li></ol> 4. Resultados representante Localização intracelular de Opc-expressando Neisseria meningitidis e α-actinina Imagem confocal de cérebro humano microvascular células endoteliais infectadas com Nm para 3 e 8 horas, como descrito acima colocalisation indicado de α-actinina e Nm que parecia ser menos frequentes em 3 experimentos infecção h (não mostrado), em comparação com as culturas infectadas por 8 h ( Figura 1 AF). A colocalisation demonstrável de α-actinina com Opc-expressando meningococos foi observado cada vez em&gt; 5 experimentos replicar. Análise estatística dos colocalisation usando várias imagens confocal foi realizada como descrito acima. No geral, em HBMEC infectados com Opc-expressando meningococos,&gt; sobreposição de 25% do verde (α-actinina) e (Nm) pixels vermelhos foi obtido (Figura 2B, Overlap coeficiente R). Em contraste com a α-actinina, experimentos em que a rotulagem de bactérias internalizadas e quer actina ou vimentina foi realizada, colocalisation ocasional foi observado com a actina, mas que com vimentina foi rara (Figura. 2B). Os dados também foram analisados ​​através do coeficiente de My, que leva em conta a abundância relativa de cada fracção. Minha é uma medida da frequência de ocorrência do sinal mais abundante (neste caso verde, α-actinina) cada vez que o sinal de menos abundante (neste caso vermelho, bactérias) ocorre. Esta medida mostra um nível impressionante de ocorrência de α-actinina nas imediações do meningococos internalizada (Figura 2A e C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopia confocal a laser para avaliar as interações intracelulares de N. meningitidis com α-actinina. AH. Monocamadas confluentes endoteliais cultivadas em lamínulas foram infectadas com o Opc-expressar (AF) N. meningitidis. Após 8 h, não aderente bactérias foram lavados, células fixas com paraformaldeído e permeabilised com 0,1% Triton X-100. Posteriormente, as bactérias e α-actinina foram coradas como descrito acima (α-actinina, verde, bactérias, vermelho). AC. Um campo mostrando imagens xy da localização Nm (A) ou α-actinina (B). A imagem sobreposta no (C) indica várias regiões em que a cor amarelo-laranja aparece sugerindo colocalisation. Setas em (A) e (B) mostram regiões onde um alto grau de α-actinina acumulação parece ter ocorrido em torno de bactérias. D. dissecção óptica de um colocalisation infectados monocamada HBMEC indicando cerca de bactérias intracelulares localizada na base de uma célula. Novamente, isso não é colocalisation devido à proximidade acidental de α-actinina, como o general mancha de α-actinina nesta região é baixa. E e F. As imagens tridimensionais de monocamadas infectadas HBMEC processados ​​como descrito acima. Uma vista oblíqua da superfície apical (E) mostra bactérias aderentes manchados de vermelho (seta vermelha), enquanto que várias bactérias localizada na superfície basal das células endoteliais (seta amarela) são distintamente laranja / cor amarela. Localização basal pode ser visto mais claramente em (F), que é um fim-on XZ seção transversal. G. A imagem do microscópio de elétrons negativamente manchada de N. meningitidis mostrando a suadiplococcal predominante de. Cada cocos é de aproximadamente 0,5 m de diâmetro. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localização e distribuição de α-actinina, actina e vimentina em células HBMEC. Monocamadas A. Infected de HBMEC foram tratados como descrito na legenda acima, mas além de α-actinina, algumas lamínulas foram utilizados para a detecção de actina ou vimentina por processo semelhante ao de α-actinina. Como acima, α-actinina concentrada em torno de várias bactérias internalizadas (setas brancas). Vimentina e actina não colocalise com bactérias a níveis apreciáveis. Bar representa 20 mM. B. &amp; C. Os valores para os coeficientes de R e My foram obtidos mais de três experimentos utilizando software Volocity como descrito acima.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A possibilidade de ligação de internalizada Opc-expressando Neisseria meningitidis para α-actinina foi explorado usando HBMEC pelo exame do colocalisation de bactérias e as proteínas do citoesqueleto em células infectadas depois de 3 e 8 h período de incubação. Por microscopia confocal, colocalisation de Neisseria meningitidis com α-actinina poderia ser demonstrada. Notadamente, embora as bactérias foram internalizadas em 3 h, houve colocalisation pouco com α-actinina neste ponto do tempo. Associação de bactérias com a proteína do citoesqueleto apareceu a exigir um período mais longo de residência intracelular como após 8 h período de infecção, um número significativo de bactérias tinha α-actinina aparentemente em estreita associação. Alfa-actinina é uma proteína multifuncional, e interações bacterianas com o elemento do citoesqueleto poderia ter influência significativa sobre a função das células-alvo, que é um assunto de estudos atuais. Quantificação de colocalisation como descrito acima exige uma preparação meticulosa espécime. Atenção especial deve ser dada à fixação da amostra, bloqueando diluições período e anticorpos. Para a melhor relação sinal-ruído, cada anticorpo primário e secundário devem ser titulados em experimentos preliminares para determinar a concentração ideal. Em nossa experiência, o Mowiol meio de montagem produzida melhores imagens.

1. Microscopia Confocal Scanning Laser (CLSM): Leica SP5 confocal sistema de imagem: Este sistema, usando uma combinação de AOTF (acústico-óptico sintonizável filtro) e um AOBS (acústico-óptico divisor de feixe), simplifica a excitação com comprimentos de onda específicos. 2 Software: Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, na Alemanha. Volocity 5 Improvisação, PerkinElmer, EUA.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

A proteína Opc de Neisseria meningitidis (Nm, meningococo) é uma superfície expressa proteína integral de membrana externa, que pode atuar como uma adesina e um invasin eficaz para células epiteliais e endoteliais. Nós identificamos endotelial superfície localizada integrinas como receptores principais para OPC, um processo que requer Opc para ligar primeiro a ligantes de integrinas tais como vitronectina e através destes para a célula-expressa receptores 1. Este processo leva à invasão bacteriana de células endoteliais 2. Mais recentemente, observou-se uma interação de Opc com uma proteína encontrada em 100kDa lisados ​​de células inteiras de células humanas 3. Inicialmente observou essa interação quando as proteínas da célula hospedeira separados por eletroforese e apagou para nitrocelulose eram revestidas com Opc-expressando Nm. A interação foi direta e não envolvem moléculas intermediárias. Por espectrometria de massa, nós estabelecemos a identidade da proteína como α-actinina. Como nenhuma superfície expressa α-actinina foi encontrado em qualquer uma das oito linhas de células examinadas, e como interações Opc com células endoteliais na presença de chumbo sérico para a entrada de bactérias para dentro das células alvo, examinamos a possibilidade de as duas proteínas interagem intracelularmente. Para isso, cultivadas cérebro humano células endoteliais microvasculares (HBMECs) estavam infectados com Opc-expressando Nm por longos períodos e os locais de bactérias internalizadas e α-actinina foram examinados por microscopia confocal. Observou-se dependente do tempo de aumento de colocalisation Nm com a proteína do citoesqueleto, que foi considerável após um período de oito horas de internalização bacteriana. Além disso, o uso de software de imagem quantitativa permitiu-nos obter uma medida relativa da colocalisation de Nm com α-actinina e outras proteínas do citoesqueleto. Aqui apresentamos um protocolo para visualização e quantificação do colocalisation da bactéria com proteínas intracelulares após a entrada de bactérias em células endoteliais humanas, embora o procedimento também é aplicável a células epiteliais humanas.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), um patógeno respiratório gram negativas humana específica, pode ligar para a saúde humana α-actinina. Aqui apresentamos um protocolo para visualização de colocalisation da bactéria intracelular com α-actinina após a entrada de bactérias em células do cérebro humano microvascular endotelial (HBMECs).

Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K visualizações.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), um patógeno respiratório gram negativas humana específica, pode ligar para a saúde humana α-actinina. Aqui apresentamos um protocolo para visualização de colocalisation da bactéria intracelular com α-actinina após a entrada de bactérias em células do cérebro humano microvascular endotelial (HBMECs).

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Imunologia e Infecção

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Sondas de rastreio óptico do romance bactérias específicas no tecido de pulmão humano Ex Vivo por Endomicroscopy Laser Confocal

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...