LWE e RK são suportados pelo National Institutes of Health bolsas R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03 dos EUA. MPT foi apoiado por uma Sociedade Bolsa de Investigação Pós-Americana de Câncer (PF-10-057-01-MPC). Os conselhos e conhecimento do Dr. Matthew Lyman e Dr. Oren Kobiler foram fundamentais para projetar a configuração do microscópio e métodos de imagem de células vivas. Também agradecer a Neal Barlow e Brian T. Kain da Nikon Instruments para sua assistência técnica na aquisição, instalação e performance do microscópio.

Seção 1 - Condições de Controle Ambiental para microscopia de fluorescência de células ao vivo <ol><li> 30 min antes de cada experiência de imagem conectar e começar o aquecimento do estágio de microscópio de topo incubadora. <ol><li> Ligue o microscópio, as fontes de luz transmitida e epifluorescência e controles de hardware automatizados. Abra o software de controle de microscópio, NIS Elements, para conectar-se ao microscópio e começar a arrefecer a câmera EM-CCD. </li><li> Anexar Lens mais quente para objetivo apropriado (60X ou imersão em óleo 100X) Nota:. Selecione lente objetiva baseada no tipo de experimento. O 100X contraste de interferência diferencial (DIC) é o melhor para o rastreamento de conjuntos virion transporte anterógrados enquanto o objetivo fase de 60X é adequado para visualizar propagação anterógrada. Menor ampliação, os objetivos de imersão não-petrolíferos não necessitam de uma lente mais quentes como eles não fazem contato direto com a amostra. </li><li> Anexar fase top incubadora para o palco motorizado de mi<html> croscope. Garantir a inserção adequada que irá realizar a amostra está em vigor. Coloque a linha de ar humidificado a partir do controlo da incubadora para a porta de entrada na fase superior da incubadora. </li><li> Ligue incubadora e lente controles mais quentes e ajustar as configurações de temperatura para condições previamente verificados específicas para o objetivo e amostra a ser trabalhada (ver discussão). </li><li> Abra a válvula de controle sobre a 5% CO 2/95% tanque atmosférico para fornecer ar complementada CO 2 para o estágio superior incubadora. O caudal deve ser entre 60 e 80 mL de gás por minuto. Taxas mais rápidas irá resultar em extensa desidratação da amostra, apesar de a câmara de umidificação. </li></ol></li><li> Adicione o óleo de lente para lente objetiva e coloque imediatamente a cultura que vai ser trabalhada na fase de topo incubadora. </li><li> Permitir o equilíbrio da temperatura da cultura para um mínimo de 10 min. Uma hora é a preferida, especialmente durante a noite para imagiologia descrito na Seção 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Seção 2 - imagens em tempo real de Virion Transport Protocol Eventos Anterógrada <ol><li> Seis a oito horas antes da imagiologia, infectar uma lamela mm de fundo do prato maduros, neurónios SCG dissociadas com 1 x 10 6 unidades formadoras de placa do vírus de interesse 35 (Ver Quadro 1, por exemplo, vírus), utilizando o método descrito em Taylor et ai. 2012a 11. Se testar mais de um vírus, off-set inoculações por 30-60 min para permitir a imagem de amostras seqüenciais em horários semelhantes após a infecção. </li><li> Insira prato em fase top incubadora por um período mínimo de 10 min antes de executar qualquer experimento. Enquanto a temperatura se equilibra, o plano focal está mudando e vai impactar negativamente os experimentos com imagens. </li><li> Usando a luz transmitida e da ocular do microscópio, encontrar um corpo celular neuronal que tem uma extensão axonal claramente isolado. Como alternativa, use a iluminação fluorescente apropriado para encontrar uma célula que expressa detecvalores da tabela de proteínas fluorescentes. É importante para limitar a exposição da amostra a iluminação fluorescente, neste passo e nos passos subsequentes, devido a dano celular induzido por luz e branqueamento de proteínas fluorescentes. </li><li> Atenuar iluminação de fluorescência para reduzir a intensidade da luz de excitação para a qual as células são expostas. Envolver luz atenuando densidade neutra (ND) filtros no caminho de luz de iluminação de fluorescência. Para filmes com duração superior a 1 min, de um mínimo de ND4 deve ser usado para evitar foto-branqueamento de proteínas fluorescentes e grande foto-dano dos axónios. Estruturas altamente fluorescentes geralmente pode ser visualizado com um ND8 filtro no lugar. </li><li> Usando o software do microscópio (Figura 2 e uma carta do filme 1A), exibir o percurso da luz para o EM-câmara CCD. </li><li> Determinar tempos e condições óptimas de imagem para cada canal fluorescente. <ol><li> Inicie uma janela de imagem ao vivo usando o botão &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Determinar as configurações de exposição da câmera ideal para cada proteína fluorescente. Não exceder 300 ms por canal como aberrações dinâmicas de virion estruturas em movimento rápido irá ocorrer. Utilize o ganho EM da câmara para um ajuste de 300 (fabricante sugeriu ganho máximo), para minimizar o tempo de exposição e aumentar a detecção de sinais escuros. Tempos de exposição correta deve produzir uma imagem com baixa intensidade de fundo e sinais específicos elevados. </li></ol></li><li> Depois de definir posições e encontrar uma região bem definida de axónios, o software deve ser configurado para realizar a aquisição da imagem automatizado. Impedir que a janela de imagens ao vivo para impedir o branqueamento da amostra. <ol><li> No software NIS Elements, selecione o 6D - Definir / Executar aplicativo Experiência do &quot;Aplicativos&quot; no menu suspenso. </li><li> Na janela de aquisição da ND, clique na guia Tempo que irá determinar a freqüência de aquisição de imagem. Definir o intervalo para &quot;nenhum atraso&quot; ea duração de 5 min. Thsoftware e, em seguida, adquirir quadros de imagem com a maior freqüência possível, com duração de 5 min. </li><li> Selecione a aba &quot;Lambda&quot;, que permite a seleção das configurações de hardware pré-definidos utilizados para aquisição de imagem fluorescente múltipla. Clique na primeira caixa e na queda subsequente menu para selecionar uma configuração de hardware apropriado. Repita o procedimento para todas as proteínas fluorescentes a ser trabalhada. </li><li> Verifique se as guias para &quot;Posições XY&quot;, &quot;Z-série&quot; e &quot;Imagem Large&quot; é de-selecionado. </li><li> Acima das guias, selecione a opção &quot;Save to File&quot; para salvar automaticamente as imagens para o disco rígido durante a aquisição. Configurar o local eo nome do arquivo de saída do experimento. Tal como são realizados experimentos sequenciais, o software adiciona um número sequencial no final do nome do ficheiro designado. </li><li> Uma vez que todas as abas foram selecionados. Iniciar o experimento, clicando no botão &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Otimizar a taxa de aquisição de imagens através de configurações de exposição e imagtamanho e. Usando uma pequena região da área de imagem, capaz, muitas vezes, acelerar as taxas de aquisição de quadros. Definir a região de interesse utilizando a ferramenta da ROI NIS-Elements, seleccionando uma área entre 25% e 50% da área total da imagem. Alternativamente, os tempos de exposição mais curtos vai aumentar as taxas de aquisição de quadros, mas diminui a qualidade do sinal (ver discussão). </li></ol></li></ol> Seção 3 - Overnight Time-lapso de anterógrada Espalhe Eventos <ol><li> Quatro horas antes da imagem, infectar uma cultura neuronal compartimentada construído em um 35 milímetros μ-Dish. Inocular os corpos celulares neuronais com 1 x 10 6 unidades formadoras de placa do vírus de interesse (ver Tabela 1, por exemplo, vírus), utilizando o método descrito em Taylor et ai. 2012b 12. </li><li> Delicadamente, coloque prato de cultura para o estágio superior incubadora. Assegurar a posição do objectivo é definido para o lado do prato. Lentamente traga o objetivo em foco, assegurandoção o objetivo não empurrar para dentro da amostra. Uma vez que o campo de foco tem sido identificado, o objectivo de mover lentamente para o centro do prato, perto da barreira interna demarking o lado interno do compartimento de axónios. Durante o movimento, assegurar a profundidade do foco é mantido e evitar que empurra para cima na amostra. Deflexão da superfície de plástico por objetivo danificar os axônios e plástico. </li><li> Adicionar cerca de 2 ml de água morna (~ 37 ° C), salino tamponado com fosfato ao prato de cultura fora do anel de teflon. Isto envolve a cultura neuronal com um anel de PBS para minimizar a desidratação da amostra e proporcionar o isolamento térmico. </li><li> Permitir que a temperatura atinja o equilíbrio durante um mínimo de 1 hora antes de se iniciar a aquisição de imagem automatizado (3.8). Passos 3,5 através de 3.7 pode ser configurado durante este tempo. </li><li> Restringir a intensidade da iluminação ao nível mais baixo possível, envolvendo todos os filtros de densidade neutra. Isso permitirá que a aquisição da imagem freqüente over longos períodos de tempo sem excessiva foto-dano. Reduzir a iluminação irá resultar em sinal baixo, exigindo exposições mais longas (ver discussão). </li><li> Use as configurações de exposição históricos ou anteriores experimental set-up gerar um prato paralelo de células epiteliais infectadas expressar as proteínas fluorescentes alvo para estabelecer as configurações de exposição como descrito na Seção 2.5. </li><li> Depois de definir a exposição para os canais necessários, é hora de configurar o software para aquisição de imagem automatizado. Impedir que a janela de imagem ao vivo para limitar amostra de branqueamento. <ol><li> Em software Elements (Figura 2 e filme suplementar 2), selecione a 6D - Definir / Executar aplicativo Experiência do &quot;Aplicativos&quot; no menu suspenso para abrir a janela de aquisição da ND. </li><li> Na janela Acquisition ND, clique na guia Hora. Definir o intervalo para &quot;5 min&quot;. Defina a duração de 20 horas. O campo lacetes será automaticamente calculado para o número de repetições do program irá executar. </li><li> Selecione a aba &quot;Lambda&quot;. Clique na primeira caixa e na queda subsequente menu selecione a configuração lambda apropriado para contraste de fase. Repita o procedimento para as posições posteriores, selecionando as configurações apropriadas para cada proteína fluorescente a ser trabalhada. </li><li> Selecione a opção &quot;Imagem Grande&quot; guia, que determina os parâmetros de múltiplas imagens sejam combinadas em um único campo de visão maior. A área de bom tamanho é composto por 5 x 2 imagens usando um 7% de sobreposição de costura. Isto irá permitir que o número máximo de células por posição a ser visualizados sem afetar a frequência de aquisição de imagem. Além disso, desmarque a caixa de seleção &quot;Shutter Fechar atividade durante o movimento Stage&quot;. Esta opção aumenta a velocidade de aquisição, por não fechar persianas entre imagens. </li><li> Seleccione o separador &quot;XY Posições&quot;, para identificar múltiplas posições que será sequencialmente fotografada em paralelo durante o decorrer do filme durante a noite. Seleccione posições que definem o centro de point para cada área de imagem grande. Seleccione 6-8 posições da imagem da amostra. A área boa imagem terão pequenos aglomerados de células em estreita aposição de axônios claramente definidos. As células não devem ser empilhados em cima uns dos outros e axónio agregação deve ser minimizada. O ponto de focagem é o núcleo da célula. Posicionar o objectivo de tal modo que um envelope nuclear é visto claramente definida, para a maioria das células. </li><li> Verifique se o separador &quot;Z-series&quot; está desmarcada. </li><li> Configurar o recurso de auto-save, como descrito acima na Seção 2.6.5. </li><li> Testar a exposição e configurações de posição, clicando em &quot;um laço do tempo&quot;. Avaliar as imagens resultantes para iluminação transmitida luz, foco e enquadramento. Se o foco mudou, reinicie o foco para cada posição na aba XY. Espere 10 minutos e repita essa etapa até que o foco é estável. </li><li> Após todos os ajustes foram verificados e testados, iniciar o experimento automatizado, clicando no botão &quot;Run Now&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Seção 4 - Processamento de Imagem e Exportação Data Export <ol><li> Conjuntos de dados obtidos durante a imagem ao vivo de células de eventos de transporte ou propagação devem ser exportados a partir do software NIS Elements em tipos de arquivo comumente usados ​​para posterior utilização em apresentações e publicações (Supplemental Filme 3). Para exportar filmes nd2 abrir o arquivo apropriado cru. No NIS Elements e selecione o ponto de vista &quot;componente split&quot; para visualizar os canais fluorescentes desejados. Reproduzir o arquivo em uma velocidade adequada; 5 quadros por segundo é um bom ponto de partida para a visualização de-transporte rápido. </li><li> Inclua um timestamp para representar um relógio em tempo real durante a reprodução do filme. Botão direito do mouse sobre a imagem e selecione, Adicionar ND-informação. Um contador digital irá aparecer no canto superior esquerdo. <ol><li> Edite o carimbo de tempo para exibir informações. Botão direito do mouse em cima do balcão e selecione Editar ND-informação. No subseqüente janela pop-up, edite o texto para refletir a imaginaçãong parâmetros que são importantes. Editar fonte, cor e tamanho para maior clareza. </li></ol></li><li> Vá para o menu &quot;Editar&quot; e encontrar &quot;Criar visão instantânea&quot; ou pressione a tecla &quot;x&quot;. Este comando abre a janela &quot;visão instantânea&quot;. Selecione &quot;aplicam-se a todos os frames&quot; para gerar um 8-bit, RGB, arquivo de exportação-pronto contendo os canais fluorescentes de todo o filme. </li><li> Salvar como um arquivo. Avi para compatibilidade cross-platform. Defina a taxa de reprodução em 200 milissegundos por quadro. Os arquivos. Avi gerados pelo NIS Elements pode ser ainda mais comprimida com outro software de conversão para o tipo de arquivo desejado. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

O objetivo de imagens de células vivas é observar processos biológicos como eles ocorrem sem alteração significativa pelo ato de observação. Este objetivo é alcançado por meio da otimização de três variáveis: o controle ambiental, a velocidade de processamento de imagens e iluminação de fluorescência. Estas variáveis ​​inter-dependentes deve ser equilibrada para alcançar condições de imagem viáveis. Os protocolos apresentados utilizam condições específicas para produzir os resultados represen...

A infecção do sistema nervoso periférico (SNP) por alphaherpes vírus tais como o vírus herpes simplex (HSV) -1, -2, e vírus da pseudo-raiva (PRV), envolve vários passos intrincados e altamente regulada durante o ciclo de vida viral. Transporte no interior dos neurônios PNS é fundamental durante os eventos de ambas infecção viral primária e posterior disseminação inter-host. Os mecanismos moleculares que modulam dois componentes do ciclo de vida viral, transporte dirigido de conjuntos virais longe de corpos celulares dentro dos axônios (transporte anterógrado) e subsequente transmissão de partículas virais em células suscetíveis (propagação anterógrada) são importantes para a compreensão herpesvírus patogênese. O transporte e saída de partículas virais nos neurônios depende de montagem de um maduro 1,2 virion infeccioso. Ensaios anteriormente fixos, incluindo imunofluorescência (IF) e microscopia eletrônica (ME), foram usados ​​para estudar o estado de montagem da partícula e protinterações ein associados ao transporte virion e propagação 3-6. No entanto, a natureza dinâmica do transporte de partículas virais e artefatos experimentais introduzidas pela fixação química confundiu a interpretação de imagens fixas 7,8. Recentemente, uma série de proteínas de fusão vírica fluorescentes têm sido descritos para o HSV e PRV, que tem impactos insignificantes sobre a função da proteína. Proteína Fluorescente Verde (GFP) e proteínas fluorescentes vermelhas (mCherry ou MRFP) fluoróforos são muitas vezes combinadas para permitir imagiologia de dois dos três componentes estruturais de um virião maduro: cápside, tegumento e glicoproteína 9-11. Ao vivo imagens de células de transporte anterógrado usando vírus de dupla-rotulados visualiza o estado de montagem de partículas virais durante o transporte. Fluoróforo similares expressando estirpes virais são utilizados para visualizar o número e diversidade de genomas virais seguintes propagação 12,13. As propriedades das proteínas fluorescentes (revisto em 14,15) ser de grande impactoa capacidade de visualizar conjuntos virais ou celulares. As propriedades intrínsecas da proteína fluorescente, incluindo a auto-interações e estabilidade, devem ser considerados ao projetar e testar novas fusões de proteínas para a preservação da funcionalidade do tipo selvagem. Em conjugação com proteínas de fusão fluorescentes, dois bem caracterizadas em sistemas de cultura de células in vitro são utilizados para imagiologia de células vivas de infecção pelo vírus do herpes: dissociado 16 e compartimentada 17 (Figura 1A), os gânglios do rato (SCG) neurónios cervicais superiores. Em ambos os sistemas, embrionário do SCG são dissecados, dissociadas de corpos de células individuais, e banhado por cultivo in vitro 18. Neurónios SCG são parte do sistema nervoso autonômico e podem ser facilmente cultivadas e diferenciadas por factor de crescimento neuronal (NGF) para um estado maduro polarizada ex vivo. SCG neurônios dissociados formar uma extensa rede de axônios que permite que fou a visualização de partículas virais como se submetem anterógrada transporte 6. Culturas SCG compartimentadas fornecer isolamento de fluidos do corpo celular neuronal (compartimento S) e terminais dos axônios distais (compartimento N) 19. Um certo número de protocolos detalhados para a construção e a utilização de neurónios em compartimentos utilizando original é de 20 ou 17 modificado Campenot câmaras foram publicados previamente. Isolamento fluídico permite a infecção seletiva de corpos celulares neuronais e detecção do vírus da progênie após o transporte de terminais axônio isoladas. Cultivar células epiteliais ao longo dos terminais antes da infecção proporciona células receptoras para a propagação de uma infecção viral. Há muitos elementos essenciais importantes para toda experimentação imagens de células vivas, mas o mais relevante para os nossos protocolos são: aquisição automatizada de imagem, iluminação fluorescente, a velocidade de processamento de imagens e controle ambiental. Para todos os experimentos com imagens, usamosinvertido, automatizado, iluminação microscópio de epifluorescência (Figura 1B). O microscópio é construído em torno da Nikon Eclipse Ti base e emprega um número de computadores sistemas motorizados controlados para reconfigurar rapidamente o microscópio durante a aquisição de imagem automatizado. Para a iluminação de fluorescência, usamos um amplo espectro da lâmpada de arco de mercúrio que podem ser atenuados com filtros de densidade neutra ao longo do percurso de iluminação. Filtros de excitação limitar o espectro de iluminação fluorescente e, quando combinados com espelhos dicróicos de multi-pass e filtros de emissão de fluorescência visualizar compostos fluorescentes específicos. Os filtros de excitação e de emissão são montados em rodas, rápido filtro de comutação independentes que permitam a aquisição sequencial rápida de canais diferentes fluorescentes. A velocidade de aquisição de imagem é reforçada com uma câmera EM-CCD sensível e rápido, útil para a detecção de sinais de baixa intensidade e curta imagem leia vezes. O controle ambiental no microscope é conseguido com uma fase superior aquecida incubadora e um aquecedor de lente objectiva para manter as amostras a temperaturas elevadas, enquanto a 2 atmosfera humidificada e enriquecida em CO é passada para dentro da incubadora. O microscópio é mantido em uma sala escura, com temperatura ambiente mantida próxima a 25 ° C e luz fora minimizado com cortinas blackout em todas as janelas. Os protocolos seguintes descrevem a utilização deste sistema para o transporte de forma anterógrada e ensaios de propagação. Um certo número de alternativas existem para controlar as variáveis ​​de imagem de células vivas. O controlo das definições de microscopia pode ser efectuada manualmente ou através de sistemas automatizados dependentes software proprietário. Fluorescência de iluminação pode ser conseguida com halogéneo, as fontes de laser ou diodo emissor de luz. A velocidade de imagem é modificado a partir da velocidade de comutação do filtro e do tempo para visualizar o sinal com o sistema de detecção associado. Controlo ambiental pode ser alcançada com equipamento especializado na mifase croscope, cerco de todo ou parte do microscópio numa caixa aquecida e humidificada, ou por elevação da temperatura da sala onde a microscopia será executada. Cada uma dessas alternativas tem vantagens e desvantagens associadas ao custo e desempenho. No protocolo subsequente, que detalhe a utilização de imagem de células vivas para estudar anterógrado rápido transporte e propagação anterógrada alphaherpes de vírus através da utilização de estirpes virais recombinantes. Imagens de células vivas em tempo real visualiza capsídeo, tegumento e / ou glicoproteína co-localização em estruturas dinâmicas submetidos transporte dentro dos axônios 11. Imagem timelapse durante a noite de culturas neuronais compartimentadas visualiza saída virion axonal e infecção de células susceptíveis 12. Os protocolos aqui apresentados foram otimizados para uso com nosso sistema de imagem particular, mas são apresentados em termos gerais relativas aos quatro elementos de imagens de células vivas. Na discussão queserá mais detalhadamente alguns dos otimização que é necessária para a experimentação bem sucedida.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Os avanços nas técnicas de microscopia de fluorescência de células vivas, bem como a construção de estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes permitiram a visualização em tempo real de transporte e de propagação da infecção pelo vírus da alphaherpes de neurónios. A utilidade de novas proteínas de fusão fluorescentes a membrana viral, tegumento, cãpsides e, em conjunto com a imagem de células vivas, identificados conjuntos de partículas virais submetidos transporte dentro axónios. Ferramentas similares têm sido empregados com sucesso para a análise de célula-célula espalhados de partículas virais para quantificar o número ea diversidade de virions transmitidos entre as células. É importante ressaltar que as técnicas de imagens de células vivas de transporte anterógrado e propagação produzir uma riqueza de informações, incluindo velocidades de partículas de transporte, distribuição de partículas e análises temporais de localização de proteínas. Ao lado de técnicas genéticas virais clássicos, estas metodologias têm proporcionado uma visão críticaem questões importantes mecanicistas. Neste artigo vamos descrever em detalhes os métodos de imagem que foram desenvolvidos para responder a perguntas básicas de transporte de vírus alphaherpes e se espalhar.

Transporte anterógrada A aplicação deste protocolo a infecções de culturas dissociadas SCG com PRV 348, uma estirpe de PRV recombinante expressando GFP-US9 e proteínas de fusão de GM-mCherry membrana, facilitou a visualização do transporte anterógrada de viriões (Figura 3 e 4 do filme suplementar). A incorporação destas proteínas de fusão resulta em partículas virais em transportar a sua detecção em pontos lacrimais e das condições de imagem...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.

De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K visualizações.  Montana State University. Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Imagens ao vivo em tempo real da regeneração da glândula submandibular do camundongo

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor em destaque: Estudando as interações entre macrófagos e células epiteliais na regeneração da glândula salivar após lesão 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...