Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Inovação Eagles (Ordem Fraternal de Eagles) e pela Fundação Mayo.

** Este protocolo de vídeo é baseado em uma publicação associada 1: alta sensibilidade de detecção e análise quantitativa dos nativos interações proteína-proteína e complexos multiprotein por citometria de fluxo. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE da ciência 2007 (389): PL2, 05 de junho de 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Clique aqui para ver esta publicação</a> . Antes de iniciar, preparar o seguinte stock Soluções aquosas: <table><tbody><tr><td> MES tampão de acoplamento: </td><td> Armazenar a 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Têmpera / Bloqueio / Storage (SBQ) Buffer: </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Tampão FCM: </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Prepare imediatamente antes da utilização: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Dissolver 50 mg / mL em pó EDAC MES tampão de acoplamento </td></tr><tr><td> Digitonina solução (2% w / v): </td><td> Dissolva o pó digitonina em dH 2 O por aquecimento a 95 ° C por 5min, em seguida de resfriamento em gelo </td></tr><tr><td> Tampão de Lise: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Solução digitonina </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inibidores da Protease </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Manter no gelo </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Acoplamento de mAb de Contas <ol><li> Determinar a concentração de contas do estoque adquirido por diluindo em PBS e contando com um hemocitômetro. Comece com uma diluição de 1:10000 de contas para a contagem. </li><li> Pipetar 18 x 10 6 contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Lavar as contas 2 a 3 vezes em 0,5-1,0 mL de buffer Coupling MES, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 50 mL de buffer Coupling MES. </li><li> Ativar os grupos carboxila nas contas de adição de 20 mL de recém-preparados EDAC-MES. </li><li> Misture delicadamente por 15 min a 25 ° C por manualmente pipetando para cima e para baixo. </li><li> Lave as contas ativadas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas ativadas em 50 mL de PBS. </li><li> Adicionar 50 mL do mAb IP (a concentração de ações 0,2-1,0 mg / mL) à solução ativada talão. </li><li> Misture por 3 a 4 horas a 25 ° C, colocando o tubo em um shaker vibrando. Agitar o suficiente para impedir que a resolução das esferas no fundo do tubo. </li><li> Lavar mAb-coupled contas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 100 mL de buffer SBQ. Estes podem ser armazenados a 4 ° C. </li><li> Suspendendo as contas assim, diluir 1:200-1:10,000 em PBS e contar com um hemocitômetro. A concentração deve ser medido para cada lote preparativa, de modo que o número de contas utilizadas em cada experimento IP ou pull-down pode ser controlada com precisão. </li></ol> 2. Pós-nuclear Preparação Lysate e Ip O método de lise e as condições de lise vai depender do tipo de célula e interações proteína-proteína em análise. Uma série de protocolos existem e podem ser modificados para sua aplicação. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 &#39;pequena&#39; células, como linfócitos, ou 5 x 10 6 &#39;grande&#39; células, como macrófagos ou células tumorais, em 100 mL de buffer Lysis fresco em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 20min no gelo. Escala o volume de lise, conforme necessário. </li><li> Para remover núcleos e restos celulares insolúveis, centrifugar o lisado em 20.000 g por 10 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante e descartar o pellet. </li><li> Adicionar 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-coupled contas ao lisado clarificado, pipetagem cuidadosamente para misturar. O volume mínimo que usamos pararealizar um único IP está a 5 mL. </li><li> Coloque em uma roda giratória verticais 4 horas durante a noite em uma sala fria. Definir a velocidade suficiente para impedir as contas de liquidação. É aceitável que o líquido de baixo volume de IPs para permanecer no fundo do tubo durante a rotação. </li></ol> 3. Sondagem da Bead-capturado Protein com fluorocromo-Anticorpos <ol><li> Lave as contas IP duas vezes em 0,2-1,0 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem. </li><li> Volte a suspender as contas em 100 FCM Buffer e alíquota 20 mL mL em cada um dos cinco ou mais tubos de 1,5 mL de microcentrífuga ou poços de uma placa de fundo da chaminé. </li><li> Adicionar fluorocromo-mAbs às amostras. Executar a FCM mancha de acordo com instruções do fornecedor ou de acordo com as concentrações de determinados empiricamente. Como ponto de partida, adicione 0,2-1 mL de solução anticorpo estoque (em 0,2-1,0 mg / mL) por tubo ou bem, e incubar por 40 min no gelo. </li><li> Lavar sondado contas em 1,5 ml tubos duas vezes em 1,0 mL de buffer FCM gelada, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem. Remova cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem, tendo o cuidado para não perturbar as contas. Por um prato de chaminé inferior, lave duas vezes com 0,2 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 1000g por 5 min a 4 ° C após cada lavagem. Um pipetador multicanal é útil para esta etapa. Para remover o sobrenadante de contas em um prato fundo da chaminé, &#39;filme&#39; da placa de uma vez, então, ainda de cabeça para baixo, blot qualquer pinga das bordas dos poços. O volume residual em cada poço, contendo as contas, serão cerca de 20 mL. </li><li> Volte a suspender as contas em 200 mL de buffer FCM por amostra. Transferência para tubos rotulados FACS. Amostras estão agora prontos para FCM. </li></ol> 4. FCM Aquisição As contas CML descritos neste protocolo são 3-5 m de diâmetro, aproximadamente metade do diâmetro de um linfócito do mouse quiescente. Portanto, pode ser necessário aumentar manualmente o Forward Scatter (FSC) ganho ampères e Side Scatter (SSC) de tensão para que a população de eventos talão de registrar em escala. Contas individuais IP devem formar uma única população bem agrupado. As configurações e portão deve ser ajustado para excluir doublets talão e detritos. <ol><li> Antes de contas correntes ou padrões de talão, remova o adaptador de contenção de gotículas que circunda a entrada da amostra em alguns citómetros. Permitir que o fluido bainha a escorrer entre as amostras, pois isso irá limpar a entrada e evitar contas de serem transitadas de uma amostra para outra. </li><li> Use contas sem rótulo, um controle negativo de fluorescência, e Partículas Calibração Rainbow (PCRs), um controle positivo de fluorescência, para ajustar as configurações de modo que ambos os extremos negativos e positivos de fluorescência aparecem simultaneamente no log escala de eixo-x. Isso garante que a fluorescência das amostras experimentais também será on-escala. Note-se que PCRs são menores do que as contas da CML, para FSC e SSC parâmetros, bem como a posição portão, pode precisar ser temporariamente alteradas para que a amostra. </li><li> Return to-grânulo unlabeled configurações vez de calibração com PCRs é completo. Se apenas uma sonda fluorescente por amostra é usada, nenhuma compensação de fluorescência é necessário. Em geral, complexos multiprotein sonda com um único fluorocromo-mAb por amostra FCM, e examinamos vários parceiros de interação através da coloração paralelo amostras talão com mAbs específicos para as subunidades diferentes. </li><li> Adquirir e salvar arquivos de fluorescência de dados. Análise pode ser realizada utilizando software citometria de fluxo, tais como CellQuest, programa FlowJo, ou cflow. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células IP FCM para TCR/CD3 complexo multiprotein. T a partir da estirpe camundongo BALB / c foram lisadas em digitonina 1%, eo lisado foi submetido a IP-FCM usando anti-CD3ε contas. Os complexos capturado contidas quantidades significativas de TCR-β (região roxo) e co-associados CD3-ε (verde), mas perto dos níveis de fundo (definida pela sonda imunoglobulina irrelevante, rosa trace) de outras proteínas, como Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marrom, laranja e vestígios azul, respectivamente). Veja resultados semelhantes publicados anteriormente 1-6.

<ol>
	<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains.">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8++memory+versus+effector+development.">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li><li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and/or+calcium+store+depletion.">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li><li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes.">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li></ol>

Informações sobre interações proteína-proteína é altamente relevante para a análise de muitos processos celulares, tais como transdução de sinal, a maturação linhagem, progressão do ciclo celular, apoptose e cascatas. FCM-IP oferece uma maneira rápida, quantitativa e sensíveis para analisar a interação de proteínas e definir os membros de complexos multiprotein em sua conformação nativa. Esferas podem ser acoplados e incubadas com lisados ​​celulares em um dia e pode ser sondado e analisadas no dia seguinte. Um formato de placa de 96 poços permite um grande número de amostras a serem analisadas de uma só vez para a coleta de dados eficiente para fins estatísticos ou de triagem. Usando fluorescentes padrões talão, o número de proteínas capturados por cada talão pode ser estimada. Muito pouco material de origem é necessária para a captura e detecção, de forma limitada e amostras de analitos escassos ainda podem ser analisados ​​para múltiplas interações. Apesar de IP FCM-não requer engenharia genética, epítopo-tagging, desnaturação, ou in-vitro mistura de proteínas em um ambiente não-fisiológica, pode ser acoplado com estas e outras técnicas, tornando-se um instrumento valioso e acessível, com aplicabilidade a muitos sistemas biológicos. Solução de problemas: Muitos IP-FCM experimentos geram dados de interação de proteínas úteis na primeira vez que são tentados. Entretanto, a otimização da FCM-IP pode melhorar a conjugação de anticorpos para contas, captação de proteínas complexas, e sonda fluorescente vinculativo. A eficiência de conjugação de anticorpos IP pode ser determinada pela sondagem contas acoplado diretamente com um anticorpo anti-imunoglobulina. Se essa eficiência é baixa, aumentando a concentração de anticorpos durante a reação de acoplamento podem permitir mais anticorpos IP para anexar a cada esfera. Isto pode aumentar a capacidade de ligação do lote IP talão, resultando na captura avançada e detecção de analitos. Outros primário-amina contendo moléculas (por exemplo, Tris, albumina de soro bovino) não deve estar presente durante a reação de acoplamento, uma vez que estas possam competir com o mAb para talão de fixação, resultando em acoplamento mAb baixo. Se conjugação de mAb aos grânulos prova problemático por outros motivos, ao invés contas pode ser acoplado a avidina / estreptavidina, e anticorpos biotinilados pode, posteriormente, ser não-covalente e usado para immunprecipitation. Apesar de conjugação de anticorpos boa, a detecção inicial de talão associado fluorescência pode ser baixo. Captura, primeiro complexo em si pode ser baixa. Porque o IP-FCM depende da concentração de analitos, aumentando o número de células lisadas por volume de unidade de lise pode aumentar a captura e detecção do analito. Além disso, a captura pode ser aumentada pela diminuição do número de contas IP incubadas com o lisado, que distribui complexos capturado em contas de menos, e resulta em aumento de fluorescência média por talão quando sondada. Em segundo lugar, é possível que o acesso do anticorpo sonda para os complexos capturada é estericamente impedidas pelo anticorpo immunoprecipitating. Neste caso, o problema pode ser resolvido utilizando anticorpos diferentes para capturar e / ou sonda.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes</td>
<td>2-5000</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rainbow Calibration Particles</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spherotech, Inc.</td>
<td>RCP-30-5A</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-5287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce Sigma</td>
<td>22980 E-6383</td>
<td>Store at -20&deg;C under desiccating conditions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-2714</td>
<td> Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20&deg;C. Handle with gloves.</td>
</tr>
<tr>
<td>PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-408-230</td>
<td>For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ip-fcm:  immunoprecipitation detected by flow cytometry

Imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP-FCM) é um método eficiente para a detecção e quantificação de interações proteína-proteína. O princípio básico que se estende de ELISA sanduíche, onde o analito capturado primária pode ser detectado em conjunto com outras moléculas associadas fisicamente dentro de complexos multiprotein. O procedimento envolve o acoplamento covalente de microesferas de látex de poliestireno com immunoprecipitating anticorpos monoclonais (mAb) específico para uma proteína de interesse, incubando estas contas com lisados ​​celulares, sondagem complexos de proteína capturadas com fluorocromo-sondas, e análise de talão associado fluorescência por citometria de fluxo. FCM-IP é extremamente sensível, permite a análise de proteínas em sua nativa (não-desnaturado) do estado, e é passível de qualquer análise semi-quantitativa ou quantitativa. Como vantagens adicionais, IP-FCM não requer engenharia genética ou equipamentos especializados, além de um citômetro de fluxo, e pode ser facilmente adaptado para aplicações de alto rendimento.

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K visualizações.  Mayo Clinic. O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.