Os autores particularmente gostaria de agradecer às seguintes pessoas por suas contribuições técnicas e intelectuais para o desenvolvimento desses métodos através dos anos: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science e PTI Pesquisa) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), e Maria Waugh (Dartmouth Medical School). Eles também gostaria de agradecer a classe Bowdoin de 2006 dos Cursos Anuais em Métodos de Investigação e Aplicações da citometria de fluxo, o que gerou os dados mostrados na Figura 2. Citometria de fluxo foi realizada em Citometria de Roswell Park Cancer Institute de Fluxo de Laboratório, que foi criada em parte por doações de equipamentos do Programa de Instrumento NIH Compartilhada, e recebe o apoio do Núcleo Grant (5 P30 CA016056-29) do NacionalInstituto do Câncer do Roswell Park Cancer Institute, e no Citometria de Fluxo Abramson Cancer Center e Laboratório Célula de Recursos Classificação da Universidade da Pensilvânia, que foi criada em parte por doações de equipamentos do Programa de Instrumento NIH Compartilhada, e recebe o apoio do NIH # 2P30 CA016520 do Instituto Nacional do Câncer. O trabalho mostrado nas Figuras 3 e 5 também foi apoiado em parte pela concessão SBIR EB00228 do National Institutes of Biomedical Imaging e Bioengenharia (NIBIB) atribuído à PTI Research, Inc.

1. Rotulagem de membrana geral com PKH26 Dye Rastreamento celular (Ref. 25; Figura 1) <ol><li> Use a técnica estéril para as etapas 1,1-1,9. Prepara ~ 10 7 células mononucleares de sangue periférico ou linfócitos (hPBMC, hPBL) e utilizando o método padrão do laboratório com a adição de uma centrifugação final 300 xg para minimizar a contaminação das plaquetas. Ressuspender as células em 10 7 / ml em HBSS + 1% BSA e colocar em gelo, reservando-se uma alíquota de 500 ul (5x10 6 células) para uso no Passo 2. </li><li> Coloque 5x10 6 células (500 ul) de uma 12 75 milímetros tubo cónico de polipropileno x. Lavar uma vez com 3,5 ml de HBSS. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando não mais do que 15-25 ul de fluido residual, mas tomando cuidado para não remover as células. Utilizar este tubo para preparar uma suspensão de células de 2 x no Passo 1.4. </li><li> Durante a lavagem das células no passo 1.2, adicionar 0,5 ml de diluente de veículo rotulagem C (a partir do kit PKH26GL) para um tubo de 12 75 milímetros x de polipropileno cónico. Utilize este tubo para prepsão uma solução PKH26 2x no Passo 1.5. </li><li> Adicionar 0,5 ml de veículo Diluente C rotulagem para o sedimento de células lavado a partir do Passo 1.2 e aspirar e dispensar 3-4 vezes para se obter uma suspensão de células individuais (2x células). Evitar a formação de bolhas e excesso de mistura, o que pode reduzir a viabilidade das células e recuperação. </li><li> Imediatamente após a preparação da suspensão de células de 2 x no Passo 1.4, preparar uma solução de (4 ^ M) 2x corante por adição de 2,0 ul de estoque de 1,0 mM PKH26 corante em etanol (a partir do kit PKH26GL) para o tubo de Diluente C preparado na Fase 1.3 e vortex para dispersar uniformemente. </li><li> Imediatamente após a preparação da solução de corante em 2x Passo 1.5, rapidamente pipetar a suspensão de células a partir do Passo 2 x 1,4 na solução de corante 2x e simultaneamente aspirar e dispensar 3-4 vezes para dispersar completamente as células em corante Não:. Adicionar 1,0 mM corante directamente células; despejar as células 2x 2x em corante, ou adicionar células para 2x 2x corante enquanto vórtex. Devido a coloração é quase instantânea, tais métodos produzem menosintensidades uniformes do que o método recomendado (Figura 2). </li><li> Após 1 min, adicionar 1,0 ml de soro inactivado pelo calor ou HBSS BSA 5% para parar a absorção do corante nas membranas celulares. A não utilização de proteína suficiente arrisca-se a formação de agregados de corantes, que podem pelete com as células, durante os passos de lavagem e causar rotulagem não intencional de outras células presentes em uma experiência. Se o meio com 10% de soro inactivado de calor (CM) ou HBSS + 1% BSA é para ser usado como reagente de paragem, realizar a coloração de um tubo de polipropileno de 15 ml e adicionar, pelo menos, 5,0 ml de reagente de paragem para assegurar a adsorção de todos unincorporated corante. </li><li> Centrifugar as células marcadas por 5 min @ ~ 400 x g. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem remover células. Lava-se a pelete duas vezes com 4 ml de BSA ou HBSS CM +1%, dispersar o sedimento bem antes de nova centrifugação. Para minimizar o extravasamento de corante adsorvido nas paredes do tubo e maximizar a eficiência de lavagem, transferir as células para um tubo de polipropileno de fresco após o first ressuspensão. Nota: as células coradas adequadamente irá apresentar uma coloração distinta rosa no pellet. </li><li> Ressuspender o sedimento de células lavado em 1,0 ml de BSA% HBSS 1. Contar as células, determinar a recuperação de células, e ajustar o volume para dar uma concentração final de 10 7 / ml. Com aspiração cuidadosa, a recuperação de células deve ser ≥ 85%. Se a recuperação de celular é &lt;70%, determinar a causa antes de prosseguir. Retirar uma alíquota de 150 ul (1.5x10 6 células) e colocar em gelo para uso no Passo 2. </li></ol> 2. Preparação de controles configuração do instrumento e Ensaio (Tabela 1) <ol><li> Alíquota de 50 ul (5x10 5) de células não coradas a partir da suspensão de células guardadas em Passo 1.1 em cada um de cinco tubos de 1,8 ml de Eppendorf: 1, 3, 4, 5, e 7. Alíquota de 50 ul (5x10 5) de células PKH26 pos do Passo 1,9 em cada um dos três tubos: 2, 6 e 8. </li><li> Adicionar 10 uL de IgG bloco (100 ug / tubo de IgG, ver tabela de reagentes) para tubos de 1-8e incubar durante 10 min à temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Adicionar uma quantidade saturante do anticorpo (s) indicado na Tabela 1 para tubos 4, 5, 7, e 8, e incubar todos os tubos de amostras (1-8) durante 30 min à temperatura ambiente e protegida da luz. </li><li> Adicionar 1,5 ml de HBSS BSA 1%, para todas as amostras, sedimentar as células por centrifugação (5 min a 400 xg) e lava-se uma vez com 1,5 ml de HBSS + 1% de BSA, com aspiração cuidadosa para evitar a perda de células. </li><li> Ressuspender a cada amostra em 500 uL de HBSS BSA 1%. Se necessário para amostras a serem analisadas em seu citómetro, transferir para um tubo de 12 mm x 75 fundo redondo. Adicionar 10 ul de 100 ug / ml 7-AAD diária estoque de trabalho (ver tabela de reagentes) para tubos de 3, 6, 7 e 8, como indicado na Tabela 1. Incubar em gelo durante 30 min, antes da utilização na instalação de citometria de fluxo e verificação de coloração (Passo 3). </li></ol> 3. Instalação de citometria de fluxo e verificação de coloração <ol><li> Verifique se o fluxo cytomeTer está funcionando adequadamente, utilizando procedimentos estabelecidos pelo laboratório de controle de qualidade diário. Verificar que os sinais podem ser facilmente detectado em cada janela espectral a ser usado, e que as respostas do detector são linearmente proporcional à intensidade de sinal na janela a ser usada para a monitorização da proliferação 14. </li><li> Adquirir FSC vs SSC dados para Tubo 1 usando escalas de exibição lineares. Ajustar a amplificação de cada detector de tal forma que a população de linfócitos cai no quadrante inferior esquerdo do gráfico de pontos, não está fora de escala, em qualquer um dos parâmetros, e não é interrompido por thresholding. Coletar dados ungated FSC vs SSC para todas as amostras em Passos 3,3-3,7. </li><li> Aquisição de dados para Tubo 1, utilizando nenhuma compensação de cor e escalas logarítmicas de exibição para todos os quatro detectores de fluorescência. Ajuste de alta tensão de cada detector (HV) para colocar a autofluorescência de linfócitos não coradas em escala com poucos / sem células acumulando no primeiro canal. Definir um limite de análise para cada histogramacorrespondente a mais brilhante de 2% das células não coradas. </li><li> Usando nenhuma compensação de cor e as configurações de alta tensão estabelecido em Passos 3.2 e 3.3, a aquisição de dados para Tubo 2, coletando FSC, SSC e sinais em todos os quatro detectores de fluorescência. Para o detector usado para monitorizar a fluorescência PKH26, verificar se todas as células PKH26 pos aparecem na escala como um único pico simétrico na 3 ª década rd -4, com poucas células em / no último canal. Se houver múltiplos picos ou forma do pico é enviesada, repetir o passo 1, com especial atenção para o sal de minimização e técnica de mistura (Figura 2). Se necessário, ajustar a concentração de corante. </li><li> Usando as configurações estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubo 3, coletando FSC, SSC e sinais em todas as quatro detectores de fluorescência. Para o detector usado para monitorizar a fluorescência 7-AAD, verificar que as células-7-AAD pos cair acima do limite de 2% estabelecido no Passo 3.3 (ou seja, que as células não viáveis ​​são bem resolvidosa partir de células viáveis ​​7-AAD neg). </li><li> Usando as configurações estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubo 4, coletando FSC, SSC e sinais em todas as quatro detectores de fluorescência. Verificar se as células CD8 pos são bem resolvido a partir de células não coradas (isto é, acima do limite de queda de 2% estabelecido no passo 3.3 para o detector de FITC). Repetir com o tubo 5 e verificar que as células CD8 pos são bem resolvido a partir de células não coradas (ie queda acima do limite de 2% estabelecido no passo 3.3 para o detector APC). </li><li> Configurações usando estabelecidas no Passo 3.3, adquirir dados para Tubos 6, 7 e 8, a coleta FSC, SSC e sinais em todos os quatro detectores de fluorescência. </li><li> Use os arquivos de lista de modo coletados para Tubos 1-5 e seu software de compensação de cor para estabelecer uma cor sobrepõem matriz para cada fluorocromo nos detectores sendo usados ​​para monitorar os três fluorocromos outros. Aplicar esta matriz para o arquivo modo de lista por Amostra 6 e verificar que a presença de PKH26 laboratórioEling não altera a capacidade de detectar 7-AAD células pos. </li><li> Aplicar a cor sobrepõem matriz do Passo 3.8 para o modo de lista de arquivo para a amostra 7 e verificar se: a) três subpopulações bem resolvidos (CD3 CD4 neg neg pos, CD3 CD4 neg pos e CD3 CD4 pos) podem ser identificados com um FITC versus APC gráfico de pontos, e b) a presença de anti-CD3-FITC e anti-CD4-APC não altera a capacidade de detectar a 7-AAD células pos. Se a presença de anti-CD3-FITC altera o limite superior de 2% para os dados recolhidos no detector de PKH26, reajustar o limite, conforme necessário. </li><li> Aplique a cor matriz sobreposição de Passo 3,8 para o arquivo modo de lista para a amostra 8. Se a presença de PKH26 rotulagem altera o limite de 2% para a FITC, 7-AAD ou detectores APC dos estabelecidos utilizando o controlo autofluorescência na etapa 3.3, reajustar o limite (s), se necessário utilizando tubo 7 da Tabela 1, e verificar se ele ainda é possível distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, e CD3 CD4 células neg neg usando o limite ajustado (s). </li></ol> 4. Seleção proliferação Modelo de Monitoramento Divisão celular por diluição de corante <ol><li> Determinar o espaçamento entre as gerações, que é dependente do número de canais e décadas logarítmicas no citómetro. Para instrumentos digitais, esse valor, tipicamente de 4 ou 5 décadas, é determinada pelo número de recipientes em que o processador de sinal digital. Em instrumentos analógicos, onde o número de décadas raramente é um número inteiro, modelagem precisa requer o número preciso de décadas de ser experimentalmente determinados. Para fazer isto, os dados a partir de uma mistura de grânulos calibrados fluorescentes com fabricantes-atribuídos intensidades relativas são obtidas nas mesmas configurações de detectores de alta tensão usados ​​na experiência. A posição dos picos do grânulo permite a calibração da escala logarítmica em termos de intfaixa ensity por década log. Especificamente, isto é feito através da representação gráfica do número de canal para cada tipo de grânulo contra o log do fabricante valor atribuído. A inclinação de uma linha de melhor ajuste linear para os valores de dados do grânulo dá o número de unidades de intensidade relativa por canal. Multiplicado pelo número de canais, tal valor será então o número de log de ​​décadas para a escala total, a partir do qual o número de canais que correspondem a uma diminuição de duas vezes na intensidade (isto é, o espaçamento entre a geração filha) pode ser calculado 14. </li><li> Decidir se deseja usar um espaçamento fixo entre as gerações ou para permitir o espaçamento entre a flutuar. Uma configuração (fixo) Standard usará o valor do espaçamento geracional determinado no passo 4.5 a atribuir a localização de cada geração, e é geralmente usado quando o histograma não tem picos distintos. A configuração permite que cada posição do flutuador pico de gerações a ser determinada pela forma do histograma e é normalmente utilizado quando distinguishablpicos de e geracionais são evidentes. </li><li> Decida se usar uma largura de pico fixo para todas as gerações ou uma largura flutuante. A largura fixa utiliza o SD calculada para a amostra de controlo não estimulado para modelar todas as gerações e é tipicamente escolhida quando a amostra não tem picos distinguíveis gerações. A largura flutuante permite que o programa de forma independente variar a DP para cada geração e é melhor usado com picos distintos de gerações. </li><li> Executar um programa que contém um módulo de análise de proliferação (aqui ModFit versão LT 3.3). Carregar o ficheiro estimulada PKH26 pos do conjunto de dados a ser analisada (por exemplo, uma cultura estimulada hr 96 de PKH26 células pos contracorados como para tubo 8 na Tabela 1). </li><li> Seleccionar os parâmetros para análise, neste caso, PKH26 (585/42) fechada sobre viável (7-AAD neg) linfócitos CD3 pos e FSC vs SSC a excluir detritos pequenos e grandes agregados (Figura 3). Na definiçãoestas regiões o cuidado de incluir a área de dispersão de alta frente, onde explosões são normalmente encontrados e note que CD3 expressão pode ser modulada para baixo em culturas estimuladas. </li><li> Criar um modelo de proliferação nova usando o Assistente Proliferação. Usando o arquivo de dados aberto (guia Iniciar), carregar o arquivo de controle não estimulado PKH26 pos e definir a localização do canal de pico na distribuição dos pais corresponde a células não divididas. </li><li> Analisar o arquivo para o controle não estimulado pos PKH26, observando os valores de posição de pico dos pais e largura (desvio padrão). Se uma largura de pico fixo (SD) é desejado, verifique Bloqueio SD. </li><li> Carregar o PKH26 neg controle (por exemplo, uma cultura de 96 horas de células PKH26 neg contracorados como para tubo 7 na Tabela 1). Ajuste o número de gerações, definindo o canal de pico para a geração de mais obtuso acima do neg PKH26 controle. Isso determina a number de gerações filha da modelo com precisão se encaixam e é tipicamente 6-9 gerações. </li><li> Abra o ficheiro de dados para a amostra estimulada (por exemplo, uma cultura estimulada hr 96 de PKH26 células pos contracorados como para tubo 8 na Tabela 1) e confirmam que as regiões para a posição de pico parental e o SD como definido no Passo 4,7 permanecem inalteradas. Se o espaçamento fixo de gerações é desejada, selecione a opção do modelo padrão, caso contrário, selecione a opção flutuante. </li><li> Analisar cada ficheiro experimental no conjunto de dados, utilizando o mesmo modelo definido no passo 4.9. Pequenos ajustes para a posição de pico parental pode ser necessário para o ajuste melhor, tal como definido no plano visual e pelo reduzido valor de qui-quadrado (RCS). </li><li> Gravar as métricas de proliferação desejadas resultantes do melhor ajuste para cada arquivo experimental no conjunto de dados. Para uma descrição abrangente de métricas possíveis ver ref. 22. </li></ol>

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	<li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A., Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PKH+Membrane+Intercalating+Dyes+to+Monitor+Cell+Trafficking+and+Function.">Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function.</a> Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. , 302-352 (2000).</li><li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+2007:+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications.">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li><li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+lymphocyte+proliferation,+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data.">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking,+Persistence,+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8++T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques.">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li><li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties.">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li><li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy.">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li><li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content.">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fourni&#233;, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells.">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li><li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen.">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li><li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells.">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li><li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+(GM-CSF).">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li><li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellVue+Claret,+a+New+Far-Red+Dye,+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation.">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells:+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation.">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li><li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation.">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li><li>Wallace, P. K., Tario, J. D., Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., , ., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry:+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution.">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li><li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients:+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival.">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry.">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. e PK Wallace recebeu reagentes pré-comerciais de células de monitoramento para avaliação da Life Technologies, Inc. e Biociências BD. AD Bantly e JS Moore receberam pré-comercial de células de rastreamento reagentes para avaliação da Life Technologies, Inc. e financiamento do PTI Research, Inc. para a pré-comercial caracterização de células CellVue vários rastreamento corantes. K. Muirhead é empregado por SciGro, Inc., que fornece serviços de consultoria para Phanos Technologies, Inc. (proprietário da PKH e corantes CellVue) e oferece suporte técnico de backup para Inc., Sigma-Aldrich e Molecular tecnologias de direcionamento (distribuidores desses corantes). Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Sigma-Aldrich.

Os métodos descritos aqui são aqueles encontrados em nossos laboratórios combinados a mais confiável dar ótimos resultados para a rotulagem hPBMC usando corantes membrana 13,16,18 e para fenotipagem subconjunto de linfócitos e proliferação de rastreamento usando membrana ou corantes proteína 2,11,13,16, 18. Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, a rotulagem uniforme brilhante é mais prontamente conseguido através da limitação da presença de sais fisiológicos e usando uma técnica de mistura que resulta na exposição rápida e homogénea de todas as células para a mesma concentração de corante. Por causa da coloração com corantes de membrana ocorre por divisão na bicamada lipídica, outras variáveis ​​que alteram a concentração de corante livre pode também ter impacto eficiência de marcação. Por exemplo, na etiquetagem de fundo redondo tubos de poliestireno resultados na lavagem menos eficiente de sais antes da ressuspensão em C Diluente e também da concentração de corante livre reduzida devido a tingir adsorção nas paredes do tubo, particularmentenas menores concentrações de corante. Ambos os factores tendem a dar mais amplas distribuições de coloração do que quando se faz a rotulagem utilizando tubos de polipropileno de fundo cónico (Figuras 3, 4 e resultados não publicados). Idade da amostra e tipo também pode afetar largura do pico, mesmo quando procedimentos de coloração otimizado são usados. Por exemplo, para os CV PKH26 pos linfócitos isolados a partir de sangue recentemente extraído gama 14-20% (Figura 3, Ref. 13 e resultados não publicados), enquanto que para os CV linfócitos isolados a partir de amostras de sangue 24 h de idade ou TRIMA pheresis gama filtros 25-30 % (Figura 4 e Ref. 18). Coloração uniformidade e a extensão em que as células não viáveis ​​podem ser excluídos da análise tanto afetar se picos filhas diferenciáveis ​​são evidentes no perfil de diluição de corante, que por sua vez afecta a escolha de um modelo de proliferação para ajustar os dados observados (Figuras 5 e 6 </strong&gt;). Embora ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) é usado aqui como um exemplo de software usado para gerar métricas como índice de proliferação e Freqüência Precursor (Figuras 3, 5 e 6, Tabela 3), outros pacotes de software também contém os módulos para analisar dados de proliferação. Estes incluem FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) e FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Todos esses programas usar um pelo não-linear análise quadrados para iterativamente encontrar o melhor ajuste para os dados brutos, alterando a posição, altura e SD (ou largura) de picos gaussianos representando gerações filha seqüenciais. Índice proliferativa (PI) e Freqüência Precursor (PF) são as medidas mais usadas de extensão da proliferação. PI, tal como definido pela ModFit, é uma medida do aumento no número de células durante o curso do ensaio, análogo ao &quot;índice de estimulação&quot; de um ensaio de incorporação de timidina. PF retorna a fracção de células na populat inicialíon que responderam ao estímulo de proliferação. Aconselha-se precaução, no entanto, ao ler a literatura desde a terminologia varia um pouco entre os pacotes de software (por exemplo, FlowJo e ModFit usam diferentes definições e cálculos para o que se entende por &quot;proliferação do Índice&quot;) 22. As questões críticas discutidas aqui para rotulagem e análise de proliferação de membrana com corantes também são encontradas ao utilizar corantes proteína. Por exemplo, uma atenção cuidadosa à técnica de mistura devem também ser observado, junto com a exclusão de células mortas / a morrer, a fim de se obter distribuições uniformes e picos filhas diferenciáveis ​​pelo uso CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. Escolha adequada de fluorocromos para fenotipagem e avaliação de viabilidade também é importante para evitar o excesso de sobreposição espectral e incapacidade de reconhecer as células de anticorpos positivos, principalmente com corantes emissores visíveis de proteína, como CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Reduzir a concentração de corante de rastreamento diminui os problemas de compensação, em canais adjacentes espectrais, mas também limita o número de divisões celulares, que podem ser monitorizados antes de intensidades de células filhas começam a sobrepor-se com autofluorescência. Em alternativa, a utilização de corantes de rastreamento de células novas, tais como o vermelho longínquo Claret emissor CellVue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ou emissor de violeta CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) pode reduzir os problemas de compensação (Figura 6). Finalmente, apesar de os corantes de membrana em geral, tendem a apresentar menor toxicidade 11,26, é possível ao longo do rótulo células com uma ou outra classe de corante. Por conseguinte, é sempre necessário verificar que a concentração de corante de rastreio utilizado não alterou a funcionalidade das células a serem rastreadas (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente ou equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comercialmente Comprada </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Cálcio e magnésio livre, sem vermelho de fenol </td></tr><tr><td> IgG humana fracção Cohn II e III, as globulinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De rato anti-CD4 humano-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De rato anti-CD4 humano-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; concentração saturante, tal como determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> De ratinho anti-humano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Concentração de saturação, conforme determinado por titulação de laboratório </td></tr><tr><td> CD3 de ratinho anti-humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida livre </td></tr><tr><td> CD28 de rato anti-humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida livre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 kit linker vermelho fluorescente de células que contém 10-3M PKH26 em EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT ou MINI26-1KT </td><td> Procedimentos da Etapa 1 também se aplicama kits contendo PKH67 ou corantes CellVue outros </td></tr><tr><td> CellVue Claret vermelho longínquo kit linker fluorescente de células que contém 10-3M Claret CellVue em EtOH e C Diluente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET 1KT ou MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Não fluorescente, clivados por esterases de membrana para formar amino-reactivo fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) </td></tr><tr><td> VIVO / MORTO Violeta fixável </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 12 x 75 mm cônico tubos de polipropileno e bonés </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Dá uma melhor eficiência membrana coloração corante (corante reduzido adsorção; menos perda de células durante a aspiração sobrenadante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm rounfundo d tubos de poliestireno </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Qualquer citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, e 7-AAD (ex. 488 nm,. In nm 520, 567 nm, e 655 nm, respectivamente) e APC ex. 633-640 nm; eles. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII Ciano </td><td> Qualquer citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, e 7-AAD (ex. 488 nm,. In nm 520, 567 nm, e 655 nm, respectivamente) e APC ex. 633-640 nm; eles. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratório Preparado </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, estoque concentrado </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml em PBS. Congelar em alíquotas e armazenar a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worrei estoque </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml em PBS; preparar diária de 1 estoque mg / ml congelado. </td></tr><tr><td> IgG bloco </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml de IgG humana fracção Cohn II e III, as globulinas + 10 mg / ml de BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Corantes de rastreamento de células fluorescentes, em combinação com a citometria de fluxo e de imagem, são poderosos instrumentos com os quais estudar as interacções e destinos de diferentes tipos de células, in vitro e in vivo. 1-5 Embora existem literalmente centenas de publicações usando tais corantes, alguns dos as aplicações de localização mais comumente encontrados celulares incluem a monitorização de: <ol><li> caule e quiescência das células progenitoras, proliferação e / ou diferenciação 6-8 </li><li> antígeno-driven transferência membrana 9 e / ou a proliferação de precursores de células e 3,4,10-18 </li><li> função das células imunes regulamentar e efetor 1,18-21. </li></ol> Corantes de rastreamento de células disponíveis comercialmente variam muito nas suas propriedades químicas e de fluorescência, mas a grande maioria da queda em uma de duas classes com base no seu mecanismo de marcação celular. &quot;Corantes de membrana&quot;, caracterizado por PKH26, são corantes altamente lipofílicos tpartição de chapéu de modo estável, mas de forma não covalente em membranas celulares 1,2,11. &quot;Proteína corantes&quot;, que se caracteriza por CFSE, são amino-corantes reactivos que formam ligações covalentes estáveis ​​com proteínas celulares 4,16,18. Cada classe tem suas próprias vantagens e limitações. A chave para seu uso bem sucedido, especialmente em estudos multicolor onde diversas tinturas e são usados ​​para controlar diferentes tipos de células, é, portanto, de entender as questões críticas permitindo o uso ideal de cada classe 2-4,16,18,24. Os protocolos incluídos aqui destacar três causas mais comuns de maus resultados ou variável ao usar celular de rastreamento de corantes. Estes são os seguintes: <ol><li> A falha em conseguir brilhante, rotulagem, uniforme reprodutível. Este é um ponto de partida necessário para qualquer estudo de rastreamento de celular, mas requer atenção a diferentes variáveis ​​ao utilizar corantes membrana que ao utilizar corantes ou reagentes de proteína de ligação de equilíbrio, tais como anticorpos. </li><li> Subótimas combinações fluorocromo umnd / ou falha para incluir controles de compensação críticas. Acompanhamento de fluorescência do corante é tipicamente 10 fevereiro - 10 março vezes mais brilhante que a fluorescência dos anticorpos. Por conseguinte, é essencial a fim de verificar que a presença de corante de rastreio não comprometa a capacidade de detectar outras sondas sendo usados. </li><li> A não obtenção de um bom ajuste com o software de modelagem de pico. Esse tipo de software permite a comparação quantitativa de respostas proliferativas em diferentes populações ou estímulos baseados na frequência precursor ou outras métricas. A obtenção de um bom ajuste, no entanto, requer a exclusão de morto / morrendo células que podem distorcer os perfis de diluição de corante e congruência dos pressupostos subjacentes ao modelo com características do perfil observado corante diluição. </li></ol> Os exemplos apresentados aqui ilustram como estas variáveis ​​podem afectar os resultados quando se utiliza membrana e / ou de corantes proteicos para monitorizar a proliferação das células.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

O sucesso no uso de corantes de rastreamento celulares para monitorar a função de células imunes e proliferação envolve várias etapas críticas. Descrevemos métodos para: 1) a obtenção de brilhante, uniforme, reprodutível etiqueta ing com corantes de membrana, 2) selecção de fluorocromos e condições de aquisição de dados, e 3) a escolha de um modelo para quantificar a proliferação de células com base na diluição de corante.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K visualizações.  Roswell Park Cancer Institute. O sucesso no uso de corantes de rastreamento celulares para monitorar a função de células imunes e proliferação envolve várias etapas críticas. Descrevemos métodos para: 1) a obtenção de brilhante, uniforme, reprodutível etiqueta ing com corantes de membrana, 2) selecção de fluorocromos e condições de aquisição de dados, e 3) a escolha de um modelo para quantificar a proliferação de células com base na diluição de corante.

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Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Biologia

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...