Agradecemos Laurie Destroismaisons e Sarah Peyrard para excelente suporte técnico e Dr.Alexandre Prat para o acesso ao citômetro de fluxo. Gostaríamos também de agradecer o Dr. Timothy Miller, por sua contribuição em relação à remoção da mielina dos preparativos. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa (CIHR) Neuromuscular Parceria de Pesquisa em Saúde, Fundação Canadense para Inovação, Sociedade ALS do Canadá, a Fundação para a Pesquisa Frick ALS, Fundação CHUM e Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Ambos CVV e NA são estudiosos de Pesquisa do Fonds de la Recherche en Santé du Québec e CIHR novos pesquisadores. SP é apoiado pela Tim Noël Studentship da Sociedade ALS do Canadá.

Os animais utilizados neste estudo foram tratados em estrita conformidade com um protocolo (N08001CVsr), aprovado pelo du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Comitê Institucional Centre de Recherche para a Protecção dos Animais, que segue padrões nacionais indicados pela Canadian Conselho on Animal Care (CCAC). Prepare todos os reagentes necessários para realizar esse protocolo (Tabela 1). Todos os outros detalhes sobre equipamentos, suprimentos e fornecedores podem ser encontrados na lista de materiais. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tabela 1 Composições de buffer. 1 Coleção de Rat Medula Espinhal <ol><li> Profundamente anestesiar o rato (Sprague Dawley) com 4% isoflorane. Verifique anaesthetization pela falta de reflexo sobre beliscar of the pata dianteira. Eutanásia do rato por decapitação com uma guilhotina. Este método é o preferido da eutanásia sobre os outros, o que poderia distorcer a medula espinhal. </li><li> Cortar a pele do para trás para expor a coluna vertebral. Corte a coluna vertebral com tesoura osso logo acima do osso pélvico. Visualize a abertura da coluna vertebral. </li><li> Inserir uma seringa de 10 ml, com uma ponta de pipeta de 200 uL (ligado através de fusão ligeiramente mais de chama), cheio com salina tamponada com fosfato (PBS), para a coluna vertebral. </li><li> Lave a espinal medula por meio da aplicação de uma quantidade de pressão para o êmbolo. </li><li> Se houver sangue na medula espinhal, lavar com PBS, antes de prosseguir para o próximo passo. NOTA: Este método também foi validado para o cérebro e fígado. Se estes tecidos incluindo, recolher metade do cérebro do rato sacrificados e um pedaço de fígado, em igual peso para a medula espinhal. Todas as outras medidas idênticas. </li></ol> 2 Isolamento de Medula Espinhal Mitochondria (Adaptado de Vande Velde et al. 4) <ol><li> Recolhe toda a medula espinhal e lugar intacto em 5 ml homogeneizador de vidro com 5 volumes (~ 3,25 mL) Tampão de homogeneização (HB). Para a recuperação ideal de mitocôndrias isoladas, realizar todas as etapas no gelo ou em câmara fria. Homogeneizar o tecido com a mão até que não haja grandes pedaços de tecido permanecem, cerca de oito cursos. Coloque homogeneizado em duas (2 ml) ou três (1,7 ml) tubos de microcentrífuga. Centrífuga 1300 xg durante 10 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Recuperar sobrenadante e colocar em um tubo de ultracentrífuga 5 ml. Adicionar 750 mL (~ 0,5 volumes) HB ao tubo de microcentrífuga contendo sedimento e ressuspender cuidadosamente o sedimento. Repita os passos de centrifugação e ressuspensão mais duas vezes. Piscina todos os sobrenadantes (S1a e s1b) para o mesmo tubo de 5 mL ultracentrífuga acima. Este passo serve para remover pequenos fragmentos. </li><li> Centrífuga reunidas S1 usando uma ultracentrífuga equipado com uma podridão balde oscilanteou e centrifugar a 17000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Manter o sobrenadante (S2) para posterior processamento, se a fracção citosólica é de interesse (por exemplo, por análise de Western blot). Ressuspender o sedimento (P2), a fracção mitocondrial em bruto, em 4 ml de HB + 50 mM de KCl. Centrífuga 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet gentilmente (P3) em 800 mL HB. NOTA: As mitocôndrias são lavadas com KCl HB + 50 mM para remover quaisquer contaminantes mitocôndrias-associados não-específicos. </li><li> Em um novo tubo de 5 ml de ultracentrífuga, adicionar exactamente 800 ul do sedimento ressuspenso (P3). </li><li> A este tubo adicionar, 200 ul de iodixanol (meio de gradiente de densidade), criando deste modo uma concentração final de 12% de iodixanol. Misture o conteúdo do tubo com cuidado, mas completamente via pipeta com um P1000. A adição de iodixanol primeiro, e em seguida sedimento ressuspenso (P3) pode ser preferível para facilitar a mistura completa. Centrifugar em um ultracentrifuge equipado com um rotor basculante a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> NOTA: O fígado não contêm mielina e, portanto, este passo não é necessário se somente o fígado está sendo processado. No entanto, se o fígado está a ser processado em simultâneo com a mitocôndria do SNC, é recomendado para o tratamento de todos os tecidos de forma igual. </li><li> Aspirar a camada de mielina na parte superior do tubo e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Pellet pode estar solto. Ressuspender o sedimento em 4 ml de HB. Centrifugar novamente a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 4 ml HB. Voltar a centrifugar e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento final (P7) em 100-200 ul HB e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Este exemplo contém mitocôndrias isoladas. </li><li> Vá para a quantificação de proteínas. Diluir as amostras da curva padrão e em 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS) para assegurar a solubilização adequada das mitocôndrias during quantificação da proteína. </li></ol> 3. imunomarcação de mitocôndrias isoladas de Citometria de Fluxo <ol><li> Para cada mistura de coloração para ser testado, pipeta 25 ug de mitocôndrias isoladas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Incluir uma amostra unstained em cada experimento; e para cada anticorpo, não se esqueça de incluir uma amostra para o controlo apropriado do isotipo. </li><li> Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender mitocôndrias isoladas em 50 uL Tampão de mitocôndrias (M Tampão) suplementado com 10% de ácido gordo livre de BSA durante 15 min a 4 ° C (passo de bloqueio). NOTA: Durante a rotulagem, realizar incubações em uma geladeira a 4 ° C. </li><li> Adicionar o anticorpo primário (anti-coelho MFN2, 20 ug por ml) para o tubo e incubar durante 30 min a 4 ° C. NOTA: Determinar a concentração ideal de cada anticorpo empiricamente por titulação. Devido à variabilidade da concentração e / ou purity, diferentes lotes do mesmo anticorpo do mesmo fabricante pode levar a resultados diferentes; Por conseguinte, a titulação é necessária para cada novo lote de anticorpo. </li><li> Lavar o anticorpo primário não ligado: Centrifugar a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em 200 ul M Tampão. Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL M Tampão. </li><li> Adicionar anticorpo secundário (de burro anti-IgG de coelho de ficoeritrina (PE), 0,5 mg por ml) para o tubo e incubar as amostras durante 30 min a 4 ° C, protegidos da luz. </li><li> Lavar o anticorpo secundário não ligado: Centrifugar a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul M Tampão. Centrifuga-se a 17000 xg durante 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul M Tampão. </li><li> Para garantir os eventos são de fato mitocôndria, mancha mitocôndrias isoladas com umacorante fluorescente específico para mitocôndrias 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Se a coloração de outros parâmetros funcionais (potencial transmembrana mitocondrial ou a produção de superóxido) é desejada, vá para a etapa 4 Se não, vá para a etapa 5 para aquisição. NOTA: É importante verificar que o espectro de emissão do anticorpo secundário é compatível com aquela dos corantes funcionais. Por exemplo, se a verificação de pureza mitocondrial com um corante comercial com propriedades espectrais semelhantes à potencial transmembrana com FITC e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), um anticorpo secundário seria viável aloficocianina (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Adicionar controlos compensações, por exemplo, uma amostra immunolabeled ou coradas com uma única fluoroforo, quando aplicável. </li><li> Transferir para um tubo de fluxo adequado para o carregamento citómetro. (Para facilitar o pequeno tamanho da amostra, um tubo de microtitulação é colocado dentro de 3 ml citômetro de fluxo tubo.) Manter as amostras em gelo e proceder imediatamente àcitometria de fluxo para a aquisição. </li></ol> 4. Assaying mitocondrial potencial transmembrana mitocondrial e Superoxide Produção por citometria de fluxo <ol><li> Verificar que as mitocôndrias isoladas têm um potencial transmembrana intacta por coloração com 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, no passo 3.8, durante 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Para comparação do potencial transmembranar entre as amostras e as populações, a utilização de concentrações inferior / não-extinção de TMRM (1 a 30 nM), pode ser mais adequado 6. <ol><li> Como controlo para a coloração TMRM, mancha mitocôndrias isoladas com 100 nM TMRM na presença de 100 ^ M de cianeto de carbonilo m-cloro-fenil hidrazina (CCCP), um desacoplador mitocondrial que despolarizará mitocôndrias. A concentração de CCCP necessária para despolarizar a mitocôndria pode ser menor se as concentrações mais baixas de corante são utilizados. </li></ol></li><li> Verifique se mitocôndrias isoladas produzir superóxido mitocondrial por Sãoaining com um indicador de superóxido mitocondrial 7 apropriado, também na etapa 3.8, durante 15 min à temperatura ambiente, protegida da luz. <ol><li> Como um controlo para a produção de superóxido mitocondrial, mancha mitocôndrias isoladas com o corante na presença de 10 uM antimicina A, um inibidor do complexo III da cadeia respiratória, que irá aumentar a produção de superóxido mitocondrial. </li></ol></li></ol> 5. Aquisição e Análise de immunolabeled mitocôndrias isoladas por citometria de fluxo <ol><li> Instrumento criado: tensões mudar de linear para o modo de log para facilitar a análise das mitocôndrias isoladas e definidas tensões (FSC: 450; SSC: 250). Certifique-se de que os eventos são recolhidos em modo de FSC-A (área) bem como FSC-W (largura) e FSC-H (altura), para ser capaz de excluir dupletos (isto é, dois eventos, que passam pelo detector, ao mesmo tempo ) na análise de recolha de pós-dados. Defina o número de eventos a serem coletados para 100.000. Adquirir controles de compensação, Se aplicável. </li><li> Aquisição de dados: Antes de aquisição de dados, evitar vórtex amostras. Em vez disso, misture batendo suavemente tubo. Inicialmente coletar eventos a uma pressão baixa, durante gating. Portão em população total. Ajustar tensões de histogramas em conformidade, normalmente o pico da amostra não corada irá corresponder à segunda década (10 2). Uma vez que portas estão estabelecidas, e as amostras estão sendo processados, a pressão pode ser ligado à alta. </li><li> Análise: Visualize doublets traçando FSC-W contra FSC. Identificar singlets e doublet. Portão em singlets. Selecione a população mitocondrial pela passagem em eventos que são marcadas positivamente com um corante mitocondrial seletivo. </li><li> Determine rotulagem fundo do controle isotipo. Utilizando o exemplo de controlo de isotipo, determinar a percentagem da população rotulagem mitocondrial positivo para anticorpo MFN2. </li></ol>

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M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

É cada vez mais evidente que as mitocôndrias são jogadores-chave na fisiologia normal e na doença. Enquanto imunotransferência pode determinar quais as proteínas são encontradas dentro da mitocôndria ou na superfície mitocondrial em uma determinada condição, este método relatórios sobre a média da totalidade da população. Este método não pode dar informações sobre abundância relativa de subpopulações mitocondriais ou subconjuntos. Embora tenha sido previamente assumido que todas as mitocôndrias s...

As mitocôndrias são organelas altamente dinâmicos que passam por vários ciclos de fissão e fusão, são transportados para locais de alta demanda energética e responder rapidamente a estímulos fisiológicos 1. Uma vez que é cada vez mais reconhecido que as mitocôndrias dentro de tecidos diferentes, mesmo diferentes compartimentos celulares, têm perfis funcionais distintos, são necessários novos métodos para identificar esses subconjuntos mitocondriais distintas. Microscopia fornece um meio pelo qual as mitocôndrias individuais pode ser visualizada e a presença de uma proteína com ou em mitocôndrias pode ser determinada por imunofluorescência 2. No entanto, a análise quantitativa por este método é de trabalho intensivo e é mais adequado para as experiências utilizando linhas de células imortalizadas ou primárias. O estudo das mitocôndrias indivíduo derivado de tecido é significativamente mais difícil, e a maioria dos métodos de não permitir a fácil identificação de subconjuntos mitocondriais concorrentemente com a avação da função mitocondrial 3. A fim de resolver este obstáculo, um novo método para immunolabel mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e, subsequentemente, analisadas por citometria de fluxo foi desenvolvido. Isto permite a rápida detecção e quantificação de proteínas localizadas na membrana mitocondrial externa, o que em comparação com a análise por microscopia, é muito menos trabalho intensivo e permite a análise de milhares de mitocôndrias em uma única amostra. Este ensaio pode ser aplicado para monitorizar o destino e a quantidade relativa de proteínas de membrana exterior mitocondrial que se pensa estar constitutivamente presente na mitocôndria, o recrutamento de proteínas à superfície mitocondrial, ou a detecção de proteínas mislocalized para a mitocôndria em condições patológicas. Além disso, a incorporação de corantes indicadores fluorescentes convencionais permite a avaliação simultânea de certos aspectos da função mitocondrial em mitocondrial distintasubpopulações.

<table><tbody><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kontes Glass Co.&amp;nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparent, thin walled&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor and buckets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, density gradient medium</td></tr><tr><td>Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Must be fatty acid free for mitochondria</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&amp;nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>For sample acquisition by flow cytometry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &amp;micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Software used for analysis</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Métodos para detectar e monitorar os componentes proteína da membrana externa mitocondrial nos tecidos animais são vitais para estudar a fisiologia mitocondrial e fisiopatologia. Este protocolo descreve uma técnica em que as mitocôndrias isoladas de tecidos de roedores são immunolabeled e analisadas por citometria de fluxo. As mitocôndrias são isoladas a partir de medulas espinhais de roedores e submetido a um passo de enriquecimento rápido, de modo a remover a mielina, um contaminante de fracções mitocondriais preparadas a partir de tecido nervoso. Mitocôndrias isoladas são então marcadas com um anticorpo de escolha e um anticorpo secundário conjugado com fluorescência. Análise por citometria de fluxo, verifica a pureza relativa das preparações mitocondriais por coloração com um corante específico mitocondrial, seguido por detecção e quantificação de proteínas immunolabeled. Esta técnica é rápida, quantificável e de elevado rendimento, que permite a análise de centenas de milhares de mitocôndrias por amostra. É aplicável para avaliar novela proteins na superfície mitocondrial sob condições fisiológicas normais, bem como as proteínas que se podem tornar mislocalized para este organelo durante a patologia. Importante, este método pode ser acoplado a corantes indicadores fluorescentes para informar sobre certas actividades das subpopulações mitocondriais e é possível para as mitocôndrias do sistema nervoso central (cérebro e medula espinal), bem como o fígado.

As mitocôndrias derivadas de medulas espinais de rato pode ser immunolabeled com um anticorpo direcionado para Mitofusin2 (MFN2), uma proteína implicada na fusão da membrana externa da mitocôndria 8. A seguir ao isolamento e marcação com um anticorpo específico MFN2 e um anticorpo secundário conjugado com fluorescência, as mitocôndrias são processadas por citometria de fluxo (Figura 1). Após a aquisição de dados, as amostras são analisadas utilizando o software de análise de c...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

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15.4K visualizações.  Université de Montréal, CRCHUM.  Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais. 

Vídeo: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Bioquímica

Isolamento de locais de contato mitocondrial

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor em destaque: Revelando locais de contato mitocondrial e insights arquitetônicos 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Imunologia e Infecção

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Medicina

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biologia

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes, and mitochondrial DNA (mtDNA) copy number often feature in these processes. Human brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) recapitulate the brain&#39;s three-dimensional (3D) cytoarchitectural arrangement and offer the possibility to study disease mechanisms and screen new therapeutics in a complex human system. Here, we report a unique flow cytometry-based approach to measure multiple mitochondrial parameters in iPSC-derived cortical organoids. This report details a protocol for generating cortical brain organoids from iPSCs, single-cell dissociation of generated organoids, fixation, staining, and subsequent flow cytometric analysis to assess multiple mitochondrial parameters. Double staining with antibodies against the MRC complex subunit NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) or mitochondrial transcription factor A (TFAM) together with voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC 1) permits assessment of the amount of these proteins per mitochondrion. Since the quantity of TFAM corresponds to the amount of mtDNA, it provides an indirect estimation of the number of mtDNA copies per mitochondrial content. This entire procedure can be completed within a span of 2-3 h. Crucially, it allows for the concurrent quantification of multiple mitochondrial parameters, including both total and specific levels relative to the mitochondrial mass.

This protocol reports a unique method of using a streaming cytometer and multiple antibodies for simultaneous assessment of multiple mitochondrial functional parameters, including changes in mitochondrial volume, amounts of the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex subunits, and mitochondrial DNA (mtDNA) replication.

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, ...

Neurociência

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Resumo

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Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Medição de Mitophagy sensível pelo repórter fluorescentes Flow Cytometry usando o pH-dependente mt-Keima

Detectando e caracterizando a auto-montagem da proteína in vivo por citometria de fluxo