Gostaríamos de agradecer as Dras. Ping Jun Zhu e Susumu Koyama por sua ajuda durante a configuração inicial da técnica, e Dr. Veronica Alvarez para a assistência na formatação do manuscrito escrito. Este estudo foi financiado pela Divisão de Pesquisa Clínica e Biomédica intramuros da NIAAA.

1. Preparando Chama-Sealed micropipeta de vidro <ol><li> Usando vidro microeletrodo, puxe uma micropipeta de patch-clamp padrão em um Flaming-Brown ou equivalente micropipeta extrator (diâmetro da ponta ~ 2 mm). Micropipeta lugar ponta na chama de um bico de Bunsen por aproximadamente 2 segundos até se formar uma bola fundida com um diâmetro de 200-300 mM. </li><li> Lugar chama-selado pipeta de patch para titular em um micromanipulador, que pode ser rapidamente vibrou lado a lado (distância de viagem 100-200 mm) usando um bimorph piezoelétrico, relé, ou dispositivo equivalente eficaz. </li></ol> 2. Preparar fatias de cérebro de P1-P21 ratos ou camundongos <ol><li> Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) com a seguinte composição (em mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, e 10 D-glicose. Solução de bolha com 95% de oxigênio / 5% CO 2 gás para ~ 15 min, em seguida, adicione 2 mM CaCl 2 e 1 mM MgCl 2. </li><li> Corte fatias de cérebro: <ol><li> Anestesiar animais com halotano ou isoflurano. Decapitar animais - remove cérebro - o cérebro bloco na orientação desejada (coronal, parassagital, transversal, etc) para incluir as regiões de interesse. </li><li> Apor o cérebro bloqueou a fase de um cortador de cérebros vibrando submerso em ACSF - cérebro seção de 250-400 mM espessura - fatias lugar em ACSF aeradas com carbogênio em um &quot;pré-incubação&quot; câmara de compensação que permite fluido / exposição de gás em todas as superfícies - permitir fatias para equilibrar neste meio de pelo menos uma hora. </li></ol></li></ol> 3. Vibrodissociation <ol><li> Preencher uma 35 milímetros de diâmetro, com placa de cultura HEPES-solução salina com a seguinte composição (mM): 150 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 D-glicose com pH ajustado para 7,4 com NaOH e osmolaridade ajustada a ~ 300 mOsm usando sacarose. Placas de cultura podem ser pratos suspensão, placas de cultura de padrão celular, placas de cultura com inserções lamela de vidro, pratos ou revestido com, por exemplo, poli-L-lisina, dependendo da necessidade de adesão de célula mais forte para o fundo do prato. </li><li> Coloque a fatia na placa de cultura e visualizar com um estereoscópio dissecar a 250 x. Segure fatia para o fundo usando um fio de platina dobrada (0,5 mm de diâmetro) colocados sobre a superfície superior da fatia de agir como um peso. </li><li> Posição da ponta da micropipeta chama-selada na superfície fatia na região do cérebro desejado. Micromanipulador ativar a vibrar a ponta lateralmente em 30/10 Hz, com a distância excursão ~ 100 mm. Usando o micromanipulador, mova a ponta mais profunda no tecido fatia de tal forma que ele passa a fatia inteira dentro de ~ 30 seg. Repita essa etapa conforme necessário para maximizar o número de neurônios isolados obtidos a partir de uma dada região do cérebro. </li><li> Retire a ponta da fatia - pegar a fatia com uma pinça e agite-o suavemente, enquanto ainda em solução - em seguida, remova completamente fatia e descartar. </li><li> Permitir que as células dissociadas de resolver e aderir ao fundo prato para pelo menos 10 min. </li></ol> 4. Gravação eletrofisiológicas <ol><li> Coloque o prato contendo neurônios no palco de um microscópio invertido e visualizar com 10 a 63 x x objetivo. Olhe para os neurônios com uma membrana de patente suave, não blebbing, e um núcleo detectável, mas não de grandes dimensões. Se óptica de contraste de fase são usados, procure fase brilhante com uma cor amarelada neurônios tinge, não muito azul. Superfuse células com solução extracelular contendo sais desejado, nutrientes, antagonistas do receptor, etc (o nosso padrão é o soro fisiológico HEPES-buffered mencionados acima (seção 3.1)), muitas vezes suplementado com 5 mM de 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] quinoxalina M-7-sulfonamida dissódico (NBQX), e 25-100 ácido D-2-amino-5-phosphonopentanoic (AP5) para bloquear os receptores ionotrópicos de glutamato que permite o isolamento de GABA rápido A iPSCs receptor mediada por 1,2. </li><li> Puxe uma micropipeta de patch padrão usando um extrator Flaming-Brown ou equivalente. Pipeta resistência de ponta deve ser 2-4 mohms (dependendo do tamanho da célula de destino), quando preenchido com uma Cl - - ​​solução baseada. </li><li> Estabelecer uma gravação de todo o celular de um neurônio visualizado usando técnicas eletrofisiológicas. </li><li> Registro espontâneo correntes pós-sináptico (sPSCs) usando uma lacuna livre de protocolo de aquisição de dados. Aplicar 0,2-1 mM tetrodotoxina e / ou Ca 2 + baixo - contendo solução extracelular para gravar em miniatura correntes pós-sináptico (mPSCs). </li><li> Soluções e agentes farmacológicos podem ser aplicados diretamente às células. Usamos superfusão locais de fundidos tubos quadrados com pontas de vidro com troca de solução que envolva o movimento lateral do tubo montado em um micromanipulador stepper-motor. Esta allofoi para a troca de solução em 10s a 100s de ms para conseguir mudanças rápidas no conteúdo molecular extracelular, a aplicação de agonistas do receptor, etc </li><li> Akaike e colegas desenvolveram técnicas para estimular a única boutons pré-sináptica 3,4. A micropipeta é colocado perto de um bouton visualizados e estímulo é dado (correntes estímulo negativo de mA 10/05, 0,1-0,2 ms de duração). IPSCs unitária são registrados, e métodos como o método de falhas pode ser usado para examinar as alterações na função pré-sináptica e pós-sináptica. </li></ol> 5. Terminais de imagem pré-sináptica <ol><li> Neurônios pós-sinápticos pode ser preenchido com diversos corantes através da pipeta patch. Neurônios também pode ser feita a partir de camundongos que expressam proteínas fluorescentes (PQ), tais como a proteína verde fluorescente (GFP) em populações celulares. </li><li> Terminais pré-sinápticos pode ser visualizado nos neurônios vibrodissociated feita a partir de camundongos que expressam PQ em populações interneurônio particular. Por exemplo, os camundongos expressando GFP impulsionada pela descarboxilase glutamato 65 (GAD65) somata promotor mostram verde e processos nas células do hipocampo e cesta interneurônios outros. Vibrodissociated neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo têm terminais GFP positivas axônio apposed aos seus somata e dendritos proximal (Figura 1A). Neurônios piramidais vibrodissociated de camundongos que expressam synaptopHlourin (a pH-sensíveis mutante GFP fundida à vesícula sináptica associada VAMP2 proteína) sob controle do promotor Thy1 também têm boutons FP-positivos que mostram que fluorescence anexado pH-sensíveis (Figura 1B). </li><li> Boutons pré-sináptico pode ser carregado com corantes de cálcio indicador e outras moléculas fluorescentes usando AM-esterificados compostos 5. A Figura 2 mostra um exemplo de carregamento com o corante indicador de cálcio-Fluo4-AM. Primeiro, M 1-2 AM-esterificados corante é aplicado aos neurônios a 37 ° por 10 min. Corante pode penetrar no meio intracelular, onde esterases decompor a molécula, produzindo corante, livre de células-impermeant e inextinguível. Esta abordagem carrega ambos os elementos pré e pós-sinápticos celular. Após o carregamento, as células são lavadas com HEPES-solução salina e mantidos a 37 ° para um adicional de 10 min. Antes de fazer uma GÊ selo com um eletrodo de pipeta de vidro, as células são lavadas 3 vezes com solução tampão externo. </li><li> Uma gravação de célula inteira é então estabelecida usando uma solução de corante livre intracelular. Depois de 2-5 minutos de gravação, o corante é removido na maior parte do neurônio pós-sináptico, permitindo a visualização de Fluo-4-carregados boutons sináptica. Esta técnica foi iniciada por Ye et al 5. </li><li> O boutons dye-carregado depois podem ser visualizadas usando uma ampliação alta, objetiva alta abertura numérica com um microscópio de uma câmera baseada ou multifotônica. Gravação de célula inteira e imagem simultânea de cálcio pode ser conseguido usando uma configuração como mostrado na Figura 3. As imagens do neurônio e boutons mostrado na Figura 2C foram capturados com um dispositivo acoplado multiplicando a carga do elétron (EMCCD) da câmera. O poder da fonte de luz para excitação foi atenuada para 1,2%, com um filtro de densidade neutra 1,0 e um filtro de íris ajustada para a saída de 12%. Transientes de cálcio do boutons verde pré-sináptico pode ser observado e gravadas em tempo real, e medidos offline. </li></ol> 6. Resultados representativos: Espontânea e atual Injection-Evocados disparo de neurônios Vibrodissociated Gravações de um típico vibrodissociated CA1 do hipocampo neurônio piramidal são mostrados na Figura 4A. Potenciais de ação espontâneos ultrapassagem pode ser observado em neurônios piramidais dissociada rato basolateral da amígdala, hipocampo e VTA 1,5. Durante a pinça de corrente-gravações de neurônios piramidais CA1, hiperpolarizantes injeção de corrente produz respostas tensão típica enquanto correntes despolarizantes de magnitude suficiente provocar potenciais de ação overshooting com o padrão de disparo típico atraso com moderada dos níveis actuais e potenciais não-acomodar ação em resposta a forte injeção de corrente ( Figura 4B). Espontânea e Miniature GABAérgica Inibitória Correntes pós-sinápticos em neurônios Vibrodissociated Durante a tensão de clamp gravações com uma solução de CsCl baseado intracelular, espontânea correntes sinápticas são observados (Figura 5A). Estes eventos são eliminados em solução contendo cálcio, baixa de 2,6, e na maioria dos tipos de neurônios são completamente bloqueada por antagonistas dos receptores GABA A, como bicuculina ou gabazine (Figura 5B, C), indicando que estes são sIPSCs mediada pela liberação de GABA e ativação deste subtipo de receptor ionotrópicos. No entanto, em neurônios principal de regiões do cérebro como a amígdala basolateral 2 ea área tegmental ventral 5,7, GABA Um bloqueio dos receptoresrevela EPSCs menor duração mediada pela ativação glutamatérgica da AMPA tipo de receptores. Curiosamente, a aplicação de TTX em concentrações que são específicos para o bloqueio da maioria da toxina sensível canais de sódio voltagem dependentes reduz a freqüência ea amplitude do sIPSCs observada em neurônios vibrodissociated de várias regiões do cérebro (Figura 6A) 2,4,7. Assim, a atividade dos canais de sódio participa na liberação de GABA na boutons beliscou-off sináptica. Ainda não está claro se full-blown potenciais de ação sódio ocorrem nesses terminais. É interessante notar que a resistência de entrada de um um terminal mM bem fechados axônio diâmetro é provável que seja assim para o intervalo GÊ. Assim, a abertura de até mesmo um pequeno número de canais de sódio pode ser suficiente para despolarizar terminais para ativar os canais de cálcio que medeiam a secreção de acoplamento excitação. Sobre o assunto destes canais de cálcio, as evidências sugerem que a N e P / Q-type canais de participação na liberação nos terminais GABAérgicos nos preparativos vibrodissociated CA1 do hipocampo de 8 e em outros lugares. Modulação e plasticidade de transmissão por uma série de neurotransmissores e receptores tem sido analisada através neurônios vibrodissociated 3,4,9. Os neurotransmissores demonstrado ter atividade moduladora tais adenosina, serotonina, GABA, os endocanabinóides, etc 2,6,10,11,12. Além disso, a curto prazo plasticidade sináptica, como endocanabinóide-dependente supressão induzida por despolarização de inibição (DSI) também tem sido descrito nesta preparação 2,11. Esses achados indicam que muitas formas de mediada pelo receptor e trans-sináptica sinalização por neuromoduladores endógenos estão intactas na preparação vibrodissociated. Transitórios de cálcio e liberação vesicular em Terminais Axon na preparação Vibrodissociated Usando o microscópio invertido equipado EMCCD descrever acima, temos examinado transientes de cálcio nos terminais pré-sinápticos na preparação neurônio bouton-vibrodissociated. A Figura 2 mostra o carregamento cela com AM-esterificados de diluição de corante Fluo-4 e posterior pós-sináptico em um neurônio CA1 do hipocampo piramidal. Transientes de cálcio espontânea são observados em alguns boutons dye-cheia mostrado como regiões de interesse (ROIs) na Figura 6B. Aplicação de 1 mM tetrodotoxina (TTX) elimina esses transientes espontânea, indicando que eles são mediados pela ativação de correntes de sódio voltagem dependentes que são ativados em boutons espontaneamente, levando ao aumento de cálcio subseqüentes. Aumentando KCl extracelular de 10 mm a 40 mm, com troca rápida solução produz um aumento de fluorescência medida em ROIs que correspondem a terminais pré-sinápticos (Figura 7A). Gravação simultânea do neurônio pós-sináptico é usado para monitorar sIPSCs e determinar se uma freqüência de eventos é aumentada pela alta-K + despolarização (Figura 7B). Para visualizar fusão das vesículas na boutons pré-sináptica, temos usaram camundongos expressando a synaptopHlourin construir sob o controle do promotor Thy1 (rotulado spH21 ratos). SynaptopHluorin em uma construção molecular em que pHlourin eclíptica (um mutante GFP com sensibilidade maior pH) 12 está ligada à proteína da membrana das vesículas associadas (VAMP2) 13. Este arranjo situa o motivo pHlourin no lúmen da vesícula onde o ambiente relativamente ácidas sacia fluorescência. Após a fusão das vesículas este motivo é exposto ao ambiente mais neutro extracelular com conseqüente aumento da fluorescência em puncta que correspondem às vesículas / terminais pré-sinápticos. Vibrodissociation de neurônios do hipocampo de ratos spH21 permite a visualização de puncta fluorescentes do tamanho e da localização esperada para os terminais GABAérgicos (Figura 8A). Aplicação do alto-K + - contendo solução externa aumenta fluorescência nestes terminais, e este efeito é bloqueado na presença de uma solução externa em que o cálcio extracelular é reduzida para 0,2 mM (Figura 8B). Assim, o aumento despolarização induzida por fluorescência de excitação parece refletir-secreção de acoplamento em sinapses GABAérgicos na preparação neurônio-bouton. A capacidade de medir transientes de cálcio pré-sináptico e fusão das vesículas nos terminais do axônio da preparação neurônio-bouton nos permite examinar os efeitos de neuromoduladores, drogas de abuso e plasticidade sináptica nos mecanismos envolvidos na excitação pré-sináptica da secreção de acoplamento e exocitose / endocitose. Essas técnicas também podem ser combinadas com outras ferramentas moleculares e ratos geneticamente modificadas para examinar os papéis de proteínas específicas em função pré-sináptica e modulação / plasticidade. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vibrodissociated neurônios da região CA1 do hipocampo (A) imagem mesclada de um DICnd imagens de fluorescência verde de um camundongo GAD65. Imagem DIC é fundido para mostrar claramente a localização dos terminais verde (B) a imagem de fluorescência de um camundongo synaptophluorin (spH21). Barra de escala = 10 mM <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 O processo de cálcio indicador de carregamento: (A) de células inteiras é carregado com AM-esterificados corante; (B) de célula inteira de gravação dilui corante; (C) terminais são visualizadas como regiões de interesse (pontas de seta).. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Diagrama esquemático da montagem experimental para a gravação de célula inteira e imagem simultânea de cálcio nos terminais pré-sinápticos nos neurônios vibrodissociated. EMCCD = Taxa de multiplicação de elétrons acoplado dispositivo. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Representante mostrando formas de onda (A) os potenciais de ação espontânea de uma vibrodissociated CA1 neurônio e (B) as respostas de tensão de membrana para hiperpolarizantes despolarizantes e injeções de corrente em grampo corrente gravações de um neurônio CA1. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. (A) Representante formas de onda de iPSCs espontânea de um neurônio CA1 piramidal. (BC) A iPSCs foram bloqueados por qualquer gabazine (10 mM; B) ou bicuculina (20 mM; C). <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. TTX inibe a transmissão sináptica gabaérgica espontânea e elimina transientes de cálcio pré-sináptico na preparação vibrodissociated hipocampo. (A) A gravação de um neurônio vibrodissociated antes e durante a aplicação TTX. Nota a diminuição da freqüência e amplitude de sIPSCs. (B) transientes de cálcio observado em um terminal Fluo-4-carregado em um neurônio pré-sináptico vibrodissociated antes e durante a aplicação TTX. Observe a perda completa de transientes. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Indicador de imagem simultânea de cálcio e de gravação de célula inteira sIPSC mostrando efeitos de K + alta estimulação. (A) fluorescência medidos ao longo do tempo a partir de uma pré-sináptica bouton carregado com Fluo-dye 04:00. (B) o aumento simultâneo da freqüência e amplitude sIPSC durante a aplicação de alta + K. <img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Ca 2 + dependentes de alto-K + resposta em boutons pré-sináptica dos neurônios piramidais spH21 da região CA1 do hipocampo. (A) imagem de fluorescência de um neurônio vibrodissociated. (B) High-K + aplicação (indicada pela barra preta) resultou em um aumento sustentado da fluorescência na presença do nosso extracelular Ca 2 + normais solução contendo (2 mM Ca2 +). Nenhum aumento de fluorescência foi observada em baixas Ca 2 + extracelular (0,2 mM Ca 2 +). Dados no gráfico foram normalizados para os níveis pré-high-K + de fluorescência, e mostrar médio de resposta de 3 boutons.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Vibrodissociation bem sucedida requer que as fatias contêm neurônios saudáveis ​​e que espaços intersticiais são flexíveis o suficiente para permitir que os neurônios para sair a fatia sem danos tóxicos. Assim, a técnica funciona perfeitamente no início idades pós-natal (P1-21), quando fatias saudável pode ser feita com material menos glial / interstiatial do que é encontrado em fatias do cérebro adulto. Em nossa experiência, no entanto, otimizando preparação fatia para a sobrevivência neuronal na fatia em si pode ser contraproducente para a técnica vibrodissociation. Considerando que rotineiramente preparar fatias na gravação situ usando ACSF modificada fria em que a sacarose foi substituída por grande parte do Na + extracelular e Ca 2 +, fatias preparado para vibrodissociation pode ser preparada (cortada por exemplo) em nosso ACSF gravação normal. Ao se preparar para a gravação fatias de neurônios individuais no fatias-se que, também, colocar fatias em ACSF normal em 35 ° C logo após a secção e deixá-los por 30-60 min a esta temperatura antes de devolvê-los à temperatura ambiente. No entanto, as fatias preparado para vibrodissociation são movidos imediatamente à temperatura ambiente logo após o corte. Estes procedimentos proporcionam um maior rendimento de neurônios saudáveis ​​após vibrodissociation, talvez devido à falta de tecido intersticial empresa que permite que os neurônios para ser mais facilmente abalada solto da fatia em si. Nós não temos exaustivamente examinadas as condições de preparação fatia, como nós rotineiramente obter neurônios suficientes para nossa gravação e experimentos com imagens em um determinado dia. É possível que modificações adicionais, tais como mudanças na espessura de corte ou procedimentos preincubaton, poderia ser feito para aumentar a produção de neurônios saudáveis. Tratamentos protease muito leves foram tentadas em um esforço para aumentar o rendimento das células e obter a técnica para trabalhar em animais mais velhos. No entanto, invariavelmente mesmo tratamento protease leve parece interromper a função sinapse. Assim, enquanto a combinação de protease e mecânica dissociação pode ainda ser encontrado a trabalhar, não tem se mostrado confiável nos neurônios do cérebro anterior até à data. Também deve ser observado o rendimento relativamente baixo de neurônios saudáveis ​​após vibrodissociation significa que a técnica é útil principalmente para estudar abundante subtipos neuronal, os neurônios, principalmente projeção. A disponibilidade de GFP-expressando ratos em que as pequenas subpopulações neuronais podem ser facilmente identificados aumenta a chance de estudar esses neurônios mais raros. No entanto, a menos que o rendimento neuronal pode ser melhorado substancialmente o acúmulo de dados sobre esses neurônios é susceptível de ser relativamente lento. Várias etapas provaram ser cruciais para o carregamento de sucesso de neurônios com cálcio-sensing corantes. Exposição a AM-esterificados corante é realizada a 37 ° C, e temos tido sucesso na tentativa de corante de carga a baixas temperaturas. A concentração dos corantes deve ser otimizada considerando tanto o tempo de carregamento e da temperatura, uma vez que parece que a maior concentração de corante carregamento diminui a concentração de cálcio no boutons pré-sináptica. Temos observado que o carregamento com concentrações mais altas diminui a freqüência ea amplitude da sIPSCs. Ao carregar sensível ao cálcio corantes em terminais pré-sinápticos de neurônios vibrodissociated, é preciso ter cuidado porque a capacidade de tamponamento do boutons pequena pré-sináptico pode ser diferente na soma e os tamanhos de boutons não são consistentes. Neurônio contendo os pratos são lavados com tampão HEPES solução externa seguintes dye-loading, eo tempo de recuperação após a lavagem é crucial. Além disso, para fazer uma boa vedação de toda a gravação de células, as células devem ser cuidadosamente lavados para se livrar de não-internalizado moléculas de corante da membrana externa celular. Além de usar os neurônios vibrodissociated para eletrofisiologia e viver imagens de células, técnicas imunocitoquímicas também pode ser aplicado a essas células 11,12. As células podem ser facilmente fixados e corados com uma variedade de anticorpos e marcadores de células outras. O uso dessas células fornece uma preparação limpa para a visualização de expressão da proteína em GABAérgica terminais pré-sinápticos. Utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes sob o controle de promotores específicos de neurônios GABAérgicos permite ao investigador identificar individuais terminais sinápticos na preparação do vibrodissociated (Figura 1). Marcadores fluorescentes de imagens deste tipo pode permitir medições morfológicas em terminais baseados em laser utilizando microscopia e técnicas mais recentes, como STED (Estimulação Microscopia Esgotamento Emission). Visualização com corantes que o relatório de ciclismo das vesículas sinápticas também é possível com esta preparação. Akaike e colegas de trabalho têm rotulado terminais GABAérgicos com o corante styryl, FM1-43 para visualizar terminais em células vivas 4. Também deve ser possível a realização de uma única célula da transcriptase reversa PCR para RNA no perfil de expressão vibrodissociatedneurônios. Esta técnica é rotineiramente aplicada a enzimaticamente-dissociada neurônios e os neurônios cultivados em cultura de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Vibrando Slicer Tissue </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Dish Cultura de células (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Pratos de vidro de fundo </td><td> Willco-prato </td><td> GWSB-5040-3522 Ou GWSB </td><td> 0,16-0,19 mm para espessura do vidro de imagens </td></tr><tr><td> Manipulator piezoelétrico </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Também pode usar relé, etc </td></tr><tr><td> SD9 Praça Pulso Stimulator </td><td> Grama Technologies </td><td> SD9K </td><td> Para desencadear manipulador piezoelétrico </td></tr><tr><td> Dissecando Stereoscope </td><td> Selvagens Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Também pode usar qualquer estereoscópio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Fina parede de vidro Capilares </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> TW-150F-4 </td><td> Para chama-selado de vidro micropipeta e micropipeta de patch </td></tr><tr><td> Seis Canal Perfusão Sistemas de Controle da Válvula </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 ou VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusão rápida passo </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido com 20-63x objetivos </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Camera </td><td> ANDOR Tecnologia </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Fonte de Luz de Fluorescência Iluminação </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicador de cálcio </td><td> Sondas moleculares </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

Dissociação mecânica dos neurônios do sistema nervoso central tem a vantagem de boutons pré-sináptica permanecer solidários com o neurônio isolado de interesse. Isto permite a análise da transmissão sináptica sob condições onde os ambientes extracelular e intracelular pós-sináptico pode ser bem controlada. A técnica de vibração baseado sem o uso de proteases, conhecido como vibrodissociation, é a técnica mais popular para isolamento mecânico. A micropipeta, com a ponta-fogo polido com a forma de uma pequena bola, é colocado em uma fatia do cérebro feito de um P1-P21 roedores. A micropipeta é vibrado paralela à superfície e uma fatia reduzida através da espessura de corte, resultando na libertação de neurônios isolados. Os neurônios isolados está pronto para o estudo dentro de alguns minutos de vibrodissociation. Esta técnica tem vantagens sobre o uso de culturas primárias neuronais, fatias de cérebro e neurônios isolados enzimaticamente incluindo: produção rápida de viáveis, os neurônios relativamente madura adequado para estudos eletrofisiológicos e de imagem; controle superior do ambiente extracelular livre da influência das células vizinhas; adequação para o bem-controlado experimentos farmacológicos utilizando a aplicação de drogas rápida e superfusão celular total; e melhorado o espaço clamp-in whole-cell recording em relação aos neurônios em fatia ou preparações de cultura de células. Esta preparação pode ser usado para examinar sináptica fisiologia, farmacologia, modulação e plasticidade. Imagens em tempo real de ambos os elementos pré e pós-sinápticos nas células que vivem e boutons também é possível usando neurônios vibrodissociated. Caracterização dos constituintes moleculares de elementos pré e pós-sinápticos também pode ser alcançado com abordagens imunológicas e de imagem-based.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K visualizações.  National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...