Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, que faz parte do Roteiro NIH para Pesquisa Médica, através de concessão de número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. gostaria de agradecer a NSF para uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação.

1. Pré-processamento de preparação dos tecidos <ol class="lalpha"><li> Antes de utilizar este protocolo, é preciso ter já decelularizado o tecido de escolha. Para este exemplo, suína fresca e as amostras de pericárdio humanos são decelularizado usando lavagens hipotônica e hipertônica em água deionizada (DI) e dodecil sulfato de sódio (SDS). </li><li> Especificamente, primeiro lave o pericárdio suíno em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em tampão fosfato salino (PBS) por 24 horas, seguido de água a 5 horas DI enxaguar. Para pericárdio humano, primeiro lave em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em PBS durante 60-65 horas, seguido de uma noite DI enxaguar. Remova todas as amostras de sua solução final e enxaguar novamente sob execução DI água 1. </li><li> Para verificar decelularização, remover um pequeno pedaço fresco, congelá-lo em outubro médio de congelamento, e demorar 10 secções de tecido mM cada 100 mm em toda a amostra para exame através de análise histológica, conforme relatado anteriormente 34-36. </li><li> Use hematoxilina e eosina (H &amp; E) as manchas de examinar o tecido para a ausência de núcleos. Pode-se também usar um Hoescht fluorescentes 33342 mancha (1,0 mcg / mL) para DNA para verificar a H &amp; resultados E; brevemente, corrigir as seções, hidratar e enxaguar em água, mancha por 10 minutos e depois enxágüe bem e armazenar no escuro. Alternativamente, pode-se usar um kit como o sangue Dneasy Qiagen e kit de tecidos, que é projetado para quantificar o conteúdo de DNA total de uma amostra. </li></ol> 2. Preparação de ECM injetável <ol class="lalpha"><li> Liofilização <ol class="lroman"><li> Após preparação adequada, congelar as amostras decelularizado com nitrogênio líquido ou por meio do armazenamento a -80 ° C. Lyophilize as amostras até que esteja completamente seco. Dependendo do seu sistema e do conteúdo de água das suas amostras, isso pode demorar de 12 a 72 horas. </li></ol></li><li> Moagem <ol class="lroman"><li> Uma vez completamente seca, um moinho Wiley Mini é usado para moer o ECM seco em um pó fino. Escolha o tamanho da peneira adequada para seus propósitos, aqui, a malha calibre 40 é usado. Uma vez que a maioria da amostra veio através do filtro, remova a jarra de coleta com o pó ECM moído. Se houver apenas uma pequena amostra, o resto da amostra pode ser extraído da fábrica em uma variedade de maneiras, aqui, um Q-ponta é usada para remover a ECM preso atrás das lâminas estacionárias do moinho. </li><li> Certifique-se sempre que a usina está limpo e livre de detritos. Também é importante certificar-se que tanto a usina e sua amostra são totalmente seca; toda a umidade fará com que o ECM para agregar e se aglutinarem, evitando moagem de sucesso. A ECM pode pegar a umidade do ar e assim deve ir diretamente do liofilizador à fábrica. </li></ol></li><li> Digestão <ol class="lroman"><li> Para formar a ECM injetável, o pó é digerido pepsina. O seguinte protocolo foi modificado a partir Freyetes, et al. (2). </li><li> É importante manter como um produto estéril possível, já que serão injetados in vivo e contaminação podem causar complicações. Assim, use frascos estéreis e pesar colheres e filtrar todas as soluções antes de usar. Um passo após moagem e liofilização, antes da digestão também irá ajudar a manter a esterilidade. </li><li> Pesar a quantidade desejada de pó ECM em um frasco de cintilação apropriado. Para volumes totais menores que 1 mL, recomenda-se utilizar um frasco de 2 ml e para volumes maiores, um frasco de 20 mL. Isso garante que há bastante líquido no fundo do frasco para misturar de forma eficaz. </li><li> Pesar a quantidade desejada de pepsina em um frasco de cintilação. Adicionar 0,1 M HCl de modo que a pepsina é a uma concentração de 1 mg / mL. Certifique-se que a pepsina é totalmente dissolvido (sem partículas) antes de usar este pode ser acelerada por vórtex a solução de pepsina. </li><li> Adicione a solução de pepsina / HCl para o frasco de cintilação com o pó ECM para que o MEC está em uma concentração de 10 mg / mL. </li><li> Mexa solução continuamente por 60-65 horas, periodicamente, raspando as laterais do frasco com uma colher ou espátula pesar. </li></ol></li><li> Ajuste de pH <ol class="lroman"><li> Esta etapa é realizada para trazer o material da matriz líquido para pH fisiológico e para inativar a pepsina, mantendo-o de clivagem da ECM mais. Novamente, certifique-se de usar as soluções feitas com água filtrada Millipore. </li><li> 1 M NaOH é adicionado a 1 / 10 do volume original. Teste o pH neste ponto e adicione pequenas quantidades (2-10 L) de NaOH ou HCl tal que o pH desejado (7,4) é atingido. Mantenha o controle de todas as pequenas quantidades adicionadas para a neutralização ou removidas para testes de pH. Uma vez que a solução foi neutralizada, adicione PBS 10x de ser 1 / 10 do volume final (09/01 o volume atual). Determinar a concentração do ECM injetáveis ​​e em seguida, adicione 1x PBS para alcançar desejado co finaisncentration, aqui 6 mg / mL. </li><li> Caracterização da ECM injetável pode ser feito via SDS-PAGE, Ensaio GAG Blyscan colorimétrico, e espectroscopia de massa. </li><li> Neste ponto, o material da matriz pode ser injetado in vivo para formar um andaime para engenharia de tecidos do miocárdio. </li></ol></li><li> Biotina-Labeling <ol class="lroman"><li> A ECM pode ser marcado com biotina antes da injeção para fácil visualização da ECM injetado. </li><li> Prepare uma solução 10mM de Biotina e adicionar à ECM injetável na proporção de 0.3mg/mg. O ECM deve estar na concentração desejada para a injecção. Se injetar em uma concentração de 6 mg / mL, adicionar 40 mL Biotina por 1 mL de ECM. Antes da injecção, mantenha a solução biotina-ECM no gelo por pelo menos 1 hora. </li></ol></li><li> Todas as etapas de processamento pode ser realizado à temperatura ambiente. Para manter a matriz injetável de gelificação, o passo de ajuste de pH pode ser feito em gelo. </li></ol> 3. Miocárdio Injeções <ol class="lalpha"><li> Preparação da injecção <ol class="lroman"><li> Para as fêmeas (225-250 g) usado aqui, 75 injeções mL de pH 7,4 ECM injetável foram preparadas em 0,1 mL seringas derrubado com 30 agulhas. Se ratos machos (375-400 g) foram utilizados, 90 mL pode ser injetado. </li><li> Todos os materiais cirúrgicos devem ser esterilizados antes da cirurgia, aqui usamos um pacote autoclavado cirúrgica que contém todas as ferramentas necessárias. </li></ol></li><li> No dia da cirurgia, um Harlan ratos Sprague-Dawley anestesiados com isoflurano é de 5%, intubados, utilizando um otoscópio, e depois mantida em 2,5% de isoflurano durante todo o procedimento. </li><li> Adicionar pomada lágrima artificial para os olhos do animal para se proteger contra o ressecamento e cabelo. Administrar 3 ml de solução de Ringer Lactato para hidratação durante a cirurgia. Isto deve ser feito através de injecção subcutânea na área abdominal inferior. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e suavemente para baixo fita membros. Use tesouras para remover os pêlos no abdômen e cabelos vácuo livre antes da lavagem. </li><li> Fazer uma série de pequenas injeções (aproximadamente 50 mL cada) de lidocaína a 2% ao longo de uma diagonal do processo zyphoid para a parte inferior direita do abdômen. Em seguida, esfregue três vezes com betadine, começando no meio e se movendo para fora. Repita com etanol 70%. Cobrir o animal com uma cortina cirúrgica com uma janela de pré-fabricados circular; segura com pinças, se necessário. </li><li> Usando um bisturi n º 10 faça uma incisão de 3-4 cm a partir do processo xifóide até o lado inferior do lado direito do abdômen. Localize apêndice xifóide e dissecar verticalmente para baixo através do músculo para a direita, tomando cuidado para evitar o grande navio à direita. Depois de ter dissecado através do músculo, use uma tesoura para cortar lateralmente através do músculo, expondo o diafragma. Ter cuidado para evitar o fígado. </li><li> Usando um comprimento de 36 polegadas de sutura 3-0 Vicrile e um par de hemostats, agulha de uma unidade através do processo zyphoid e puxe o fio no meio. Fita adesiva nas extremidades da sutura em conjunto e corrigir isso para um ponto acima e atrás do animal, essencialmente, o levantamento do zyphoid cima e expondo o diafragma. Com outro comprimento de 36 polegadas de sutura 3-0 Vicrile, unidade de uma agulha através do músculo mais próximo ao apêndice xifóide e, novamente, puxe através de e fixar as extremidades para outro ponto à direita da mesa cirúrgica, totalmente expondo a cavidade cirúrgica. </li><li> Neste ponto, você deve ser capaz de ver o coração através do diafragma. Usando um pequeno par de dente micropinças rato, pegue o centro do diafragma, puxe-o para você e fazer uma pequena incisão com uma tesoura sem corte. É extremamente importante o uso de tesoura muito contundente para evitar picar os pulmões. Uma vez que este buraco tenha sido feito, os pulmões será recolhido, permitindo que você faça uma incisão 2-3 cm verticalmente através do diafragma para visualizar o coração. </li><li> Inserir um de 3 polegadas Q tip-à esquerda da cavidade para empurrar os pulmões para fora do caminho. Use uma pinça toalha para proteger a Q-ponta no lugar. Usar outro Q-ponta para mover o pulmão direito para fora do caminho, a fim de localizar o saco pericárdico. Usando um par de micropinças e um par de fórceps grande serrilhada, rasgam o saco pericárdico, expondo o ápice do coração. Se o animal já havia sido submetida a um procedimento de infarto, o pericárdio já estará ausente. </li><li> Agarre o ápice do coração com o micropinças dente de rato e injetar o material da matriz líquido de um terço do caminho para cima a partir do ápice. Inserir a agulha, paralelamente à superfície epicárdica e injetar com a borda chanfrada da agulha para a esquerda. Certifique-se de evitar a grande veia cardíaca. Aguarde alguns segundos antes de remover a agulha. Você deverá ver um branqueamento do tecido no local da injeção. </li><li> Limpar o sangue na cavidade e retire o grampo toalha e Q-ponta que estava segurando o pulmão direito. Use microhemostats curvas eo ratodente micropinças para fechar o diafragma. Faça um nó inicial e, em seguida, use a pinça serrilhada e microhemostats para fechar o diafragma com uma sutura contínua e uma agulha cónica. Antes de fechar totalmente, insira PE160 tubulação de sucção e usar uma seringa de 10 mL para evacuar a cavidade torácica como a sutura é apertada. </li><li> Quando devidamente evacuado e fechado, o diafragma deve ser côncavo. Um diafragma convexa indica que ainda há ar na cavidade. </li><li> Neste ponto, o isoflurano pode ser girado para baixo a 1%. </li><li> Retire ambos os 3-0 suturas Vicrile segurando a cavidade aberta. Use água estéril para hidratar o músculo, enxugando o excesso de distância com um Q-ponta ou gaze estéril. Use um novo comprimento de 3-0 sutura para fechar a camada muscular com sutura intermitente. </li><li> Neste ponto, o isoflurano pode ser desligado. </li><li> Limpe a área com água estéril e grampos usar para fechar a pele. Se grampos vai interferir com o estudo, 5-0 sutura prolina também pode ser usado. Nesse caso, use um reverso corte agulha (RC) para fechar a pele com suturas intermitente. Em ambos os casos, spot cola cirúrgica sobre a incisão fechada. </li><li> Usar um Q-ponta para ungir o local da incisão com uma pomada antibiótica tripla. </li><li> Permitir que o animal se recuperar em oxigênio a 100%. </li><li> Quando os animais começa a respirar em torno do ventilador, remova o tubo da traqueia. </li><li> Uma vez que os animais são esternal, administrar uma injecção subcutânea de 0,05 mg / kg de cloridrato de buprenorfina e devolvê-los à sua gaiola em uma toalha estéril. </li><li> Os animais devem receber pós-operatório de observação e cuidado. </li><li> Nos pontos de tempo de interesse, os animais são sacrificados e os corações removidos para análise. Seções transversais curto eixo são tomadas e podem ser corados com hematoxilina e eosina (H &amp; E) para análise de tecido grosseiro. Em pontos de curto espaço de tempo, a região injetada aparecerá como uma rede, rosa fibroso que se espalhou intersticialmente. Em momentos posteriores, observa-se um afluxo de células e uma degradação da matriz eventual injetado após 2-3 semanas. Se o ECM foi marcado com biotina antes de injetar, pode ser mais diretamente visualizados através da coloração da biotina com a HRP-conjugado estreptavidina. Coloração imuno-histoquímica pode ser usado para identificar células específicas ou estruturas na região da injeção, aqui os slides foram co-marcadas com um isolectin FITC-conjugada que se liga às células endoteliais e verde fluorescente e um anticorpo anti-actina de músculo liso com um secundário Alexafluor anticorpo que relata o SMCs em vermelho. </li></ol> 4. Resultados representante Caracterização prévia de materiais de matriz preparada desta forma demonstrado a retenção de uma variedade de macromoléculas. Especificamente, as proteínas fibrosas e múltiplas glicoproteínas foram identificados através de espectrometria de massa (Tabela 1). Se os materiais de matriz processados ​​de acordo com este protocolo são encontrados para já não contêm uma matriz complexa de macromoléculas, pode ser que o protocolo decelularização empregada é muito dura. Depois de completamente liofilizado, a seca pericárdico ECM parece muito dura, papel amassado. Outros tipos de tecido vai se assemelham a embalagem amendoins. Se bem moído, a ECM deve cair pela peneira e ser coletadas no frasco na parte inferior. Se houver umidade deixada na amostra, o MEC vai se aglutinarem e ficar preso na câmara de moagem. Após a digestão, a solução de ECM deve ser uma cor leitosa e completamente livre de partículas visíveis. Também será ligeiramente mais viscoso do que o HCl sozinho. Se o MEC não digerir bem, ainda haverá grandes partículas no frasco, alternativamente, a ECM pode falhar para fora da solução. Após ajuste de pH, não há nenhuma mudança visível na solução, ea ECM ainda é um líquido turvo homogênea. Se ele começa a gel, a viscosidade aumenta e vai ser difícil ou impossível extrair o material para uma seringa. Se isso acontecer, execute o passo de ajuste de pH no gelo, com pré-refrigerados soluções. Uma vez que as injeções foram preparadas, mantê-los no gelo até o uso. Se a injecção for bem sucedida, a região em torno da ponta da agulha whitens e um bolo pequeno é visível. Se isso não for observado, a injeção pode ter ido para a câmara, em vez de na parede. Quando o animal até a sutura após a injeção, fechando o cuidado do diafragma é o passo mais importante. Se feito corretamente, o diafragma será apertado contra os pulmões e aparecerá côncavo. Se houver alguma fica ar dentro dos pulmões, o diafragma permanecerá convexo, ou ter uma área onde os balões para fora. Ao examinar a histologia da região de injeção em um ponto de início do tempo (30 minutos a 4 horas após a injecção), deve-se ver uma área, rosa fibroso que é desprovido de células este é o material da matriz remontado pós-injeção (Figura 2) . A rede muitas vezes se espalha intersticialmente e pode estar presente durante todo muitas seções. Um possvel explicação para ver apenas uma área muito pequena da matriz de gel é que uma parte da injeção intramural errou o alvo e foi injetado na câmara de LV ou vazou do local da injeção. Além disso, dependendo do tempo de gelificação, a difusão intersticial pode variar. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) resultados. (A) padrão de peso molecular. (B) Rat colágeno tipo I de cauda (2,5 mg / mL) em comparação com o ser humano solubilizados (C) e (D) suína pericárdico ECM (7 mg / mL). Observe a presença de colágeno, assim como várias outras proteínas e peptídeos nas amostras da matriz de pericárdio. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Componentes ECM identificado com espectroscopia de massa. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 injeções do Miocárdio:. Gelificação em vivo. H &amp; E mancha de humanos (A) e suínos (B) injeções matriz de pericárdio que têm gelled in vivo após 45 minutos. Setas indicam a localização da matriz, manchado leve rosa do que o miocárdio. Barra de escala é 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Infiltração de células Vascular. Manchas fluorescentes para os navios no ser humano injetado (AC) e géis suína (DF) matriz em duas semanas. Células endoteliais são marcadas de verde (A, D), enquanto as células do músculo liso são rotulados vermelha (B, E). Imagens fundidas são mostrados em C e F. bar escala é 100 mm. As linhas brancas pontilhadas indicam a área de injeção de matriz, como determinado pelo H &amp; E a análise de uma seção próxima. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Células-tronco dentro da matriz região da injeção. A Hoescht mancha de núcleos (azul) e c-kit (verde) identifica células-tronco em humanos (A) e suínos (B) as regiões de injeção matriz. Barra de escala é 50 mm.

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Use animal: Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as directrizes publicadas pela Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia, San Diego e da Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care.

Este método permite a geração de biologicamente derivada, andaimes injetável para a engenharia de tecidos do miocárdio. Embora estes métodos foram desenvolvidos inicialmente para a fabricação e testes in vivo de um gel matriz do miocárdio e apresentou aqui com um gel matriz de pericárdio, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido, desde que o tecido pode ser adequadamente descelularizados. Decelularização deve ser realizada e verificada antes da utilização destes métodos, como...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pepsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>p6887-1G</td>
<td>Lyophilized </td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>21217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutravidin-HRP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>21130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equipment: </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiley Mini Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>3383L10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Labconco Lyophilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco, Inc</td>
<td>7670520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products, L.P.</td>
<td>67618-154-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lactated Ringers Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>003966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KY Jelly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>28658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lidocaine, 2%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>17767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.</td>
<td>12496-0757-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Artificial tear ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>NC9860843</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triple antibiotic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19082795</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>60307-120-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Otoscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>008699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stop cock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>006245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-0 Vicrile suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>J327H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 Proline suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>s-1173</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reverse cutting (RC) needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8684G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microhemostats </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>13013-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat tooth microforceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11084-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>No. 10 scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10110-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blunt scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14108-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp, curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large, serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>1106-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE160 suction tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427430 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clippers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>21608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin staples/stapler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>PRR35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>General supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stir plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 M HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>1 M NaOH</td>
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<td>10x PBS</td>
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<td>1x PBS</td>
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<td>0.1 mL syringes</td>
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<td>10 mL syringe</td>
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<td>Q-tips</td>
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<td>Surgical glue</td>
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<td>Surgical drape</td>
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<td>Towel clamps</td>
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<td>Small hand-held vacuum </td>
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fabrication of biologically derived injectable materials for myocardial tissue engineering

Este protocolo fornece métodos para a preparação de um gel injetável matriz extracelular (ECM) para aplicações de engenharia de tecidos do miocárdio. Resumidamente, o tecido é decelularizado liofilizada, moída, enzimaticamente digerido, e então levadas ao pH fisiológico. A liofilização remove todo o conteúdo de água do tecido, resultando em ECM seco que podem ser moídos em um pó fino com um pequeno moinho. Depois da moagem, o pó ECM é digerida com pepsina para formar uma matriz de injetáveis. Após o ajuste para pH 7,4, o material da matriz líquido pode ser injetado no miocárdio. Resultados de ensaios de caracterização prévios mostraram que os géis matriz produzida a partir de decelularizado pericárdio e miocárdio conservar os componentes ECM nativa, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Dada a utilização deste material para engenharia de tecidos, na caracterização vivo é especialmente útil, aqui, um método para a realização de uma injeção intramural para o ventrículo esquerdo (VE) da parede livre é apresentado como um meio de analisar a resposta do hospedeiro ao gel matriz em um modelo animal de pequeno porte. Acesso à cavidade torácica é adquirida através do diafragma ea injeção é feita um pouco acima do ápice na parede livre do VE. O andaime biologicamente derivada pode ser visualizado por biotina rotulagem antes da injeção e, em seguida, coloração secções de tecido com um rabanete de cavalo conjugado com peroxidase neutravidin e visualização através de coloração diaminobenzidina (DAB). Análise da região de injeção também pode ser feito com coloração histológica e imuno-histoquímico. Desta forma, o gel previamente examinadas matriz de pericárdio e miocárdio foram mostrados a forma fibrosa, redes porosas e promover a formação de vasos na região da injeção.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato miocárdio<em&gt; In vivo</em&gt; São descritos.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

fabrication-biologically-derived-injectable-materials-for-myocardial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K visualizações.  University of California, San Diego. Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato miocárdio In vivo São descritos.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Bioengenharia

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabricação de Mecanicamente Tunable e Bioativos metal andaimes para aplicações biomédicas

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...