Esta pesquisa foi suportada por uma concessão de Descoberta a AAW das Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada.

1. Pré-requisitos para análises biomecânicas Locomotion Antes de embarcar em compra de equipamentos caros locomotor análise e planejamento de experimentos onde cinemática e / ou avaliação locomotor cinética será executada, é imperativo que o pesquisador se familiarizar com os aspectos técnicos e práticos de análises biomecânicas, sensório-motor comportamento, o condicionamento operante de animais e manipulação / armazenamento / gerenciamento de grandes quantidades de dados digitalizados. Embora estes pré-requisitos parecer óbvio para muitos, é só depois de embarcar estes tipos de experimentos onde os estagiários perceber as complexidades técnicas e práticas de realizar análise detalhada relativamente locomotor. Os autores recomendam que os experimentadores se matricular em um curso de lidar com a biomecânica introdutória, estar familiarizado com ou contratar alguém familiarizado com uma linguagem de programação necessários para o gerenciamento de dados, e de igual importância, interagindo gastar um tempo considerável, manuseio e trabalho com animais de laboratório. Para a compreensão da análise de locomoção e sensório-motor análise comportamental das neurociências, os pesquisadores são referidas várias referências importantes (ver 1, 4-7). 2. Aparelho Teste cinemática e cinética Um aparelho de teste de cinemática e cinética, útil para a coleta de dados bilateral, é composto dos seguintes componentes (ver &quot;Tabela de Reagentes e equipamentos específicos&quot; para mais detalhes): <ul><li> Sala silenciosa e suficientemente porte (não necessariamente à prova de som, apesar de localizado em uma área de baixo tráfego) </li><li> Rádio para o fornecimento de &quot;ruído&quot; de fundo para limitar os ruídos distraem de fora da sala para animais </li><li> Plexiglass transparente, fechado, pista de superfície plana (180 cm de comprimento X 20 cm de largura X 60 cm de altura) com um buraco quadrado (11 cm X 11 cm) localizada no centro da pista equidistante de ambos os lados </li><li> Pedaço de plexi-glass (10,5 cm X 10,5 cm) </li><li> Fita dupla face adesiva scotch </li><li> Fita adesiva 3M reflexiva para os marcadores de pele </li><li> Furos para a criação de marcadores </li><li> Isofluorano aparelho de anestesia necessária para os animais anestesiar para fazer a barba antes da colocação de marcadores de pele </li><li> Cheerios para o movimento encorajador do animal ao longo do comprimento da pista </li><li> AMTI HE6X6 forceplate </li><li> Vicon sistema Motus personalizado (computador, software, etc) </li><li> 4 câmeras de vídeo (pelo menos 60 Hz de amostragem) e tripés com cabos conector apropriado </li><li> 4 luzes câmera montada halogênio fornece iluminação ideal para a iluminação do assunto animais e os marcadores reflexivos </li><li> Quadro de calibração tamanho adequado ou o volume necessário para Vicon sistema Motus para calibrar x, y, z posições em medidas de distância significativa </li></ul> 3. Treinamento de animais Antes da coleta de dados, cada animal deve ser treinado para atravessar um flat-superfície da pista, em anexo. Ao receber de um fornecedor ratos adequados com animais, os animais devem ser aclimatados ao seu novo lar para uma semana. Durante este período de aclimatação, cheerios várias são colocados diariamente na gaiola do rato. Os animais são alimentos restritos a suas necessidades de energia de manutenção para prevenir a obesidade e assegurar a motivação para realizar esta tarefa. A partir daí, cada animal é tratado pelo experimentador por 10-15 minutos por dia durante 1 semana. Durante este mesmo período de tempo, cada animal é colocado na pista com cheerios localizados em cada extremidade. Uma vez que o animal torna-se familiarizado com o ambiente, eles vão começar a comer o cheerios. Uma vez que o animal está confortável e cheerios comer dentro da pista, o pesquisador deve, então, operantly condição do animal para executar o comprimento da pista por uma recompensa de alimentos. Isto é conseguido lançando cheerio ¼ para a extremidade oposta da pista onde o rato está posicionado. Uma vez que o rato come essa cheerio, outro cheerio ¼ é colocado no outro extremo da pista. Isto é feito por 15-20 minutos por dia até que o rato de forma consistente (&gt; 90% de lançamentos) se move ao longo da pista a uma velocidade constante (ou seja, sem iniciar, parar, explorar, ou sem mudança da marcha) para comer a cheerio sem galopante / delimitadora . O rato deve ser apenas empregando uma marcha trote. Mais de condicionamento dos animais a esta tarefa pode levar a animais a galope e delimitadora esses andamentos são indicativos dos animais que viajam&gt; 90 cm / s. Delimitadora e galopante gaits, biomecanicamente, são mais difíceis de interpretar para uma variedade de razões (por exemplo, levar a perna critérios de inclusão, etc). Em nossa experiência, uma vez que ratos consistentemente empregar galopante ou delimitadora andaduras, é difícil, senão impossível para tê-los usar uma marcha de trote, enquanto locomoting na pista. Velocidades&gt; 90 cm / s raramente são vistos depois que um animal sofreu com lesões no sistema nervoso periférico ou central. Tempo para alcançar a formação de sucesso é variavel entre as linhagens e sexos de ratos. Wistar, Lewis, Long-Evans e Sprague-Dawley cepas são capazes de atravessar a pista de forma consistente dentro de 2 semanas desde o início do treinamento 8. Em nossa experiência, Fischer (F-344) ratos tendem a levar mais de 4-6 semanas para aprender esta tarefa 8. 4. Posição conjunta Marcação Forelimb análise cinemática não é confiável devido ao artefato pele circulação impostas pela colocação de marcadores sobre a pele forelimbs que é exacerbado em espécies, como ratos, que têm uma postura agachada 9. Em vez disso, a cinemática dos membros anteriores devem ser alcançados com x-ray cinematografia ou fluoroscopia 10-13. Como tal, membro traseiras colocação marcador conjunta posição só é aqui descrito. Antes da coleta de dados, cada rato tem de ser anestesiado pelo menos 24 horas antes da coleta de dados utilizando um anestésico inalatório apropriado (por exemplo, isofluorano, 1,5-2% marcados num vaporizor de precisão) e administrados em oxigênio através de máscara facial, e anatômicas topográficas chave marcos devem ser marcados. Dada a brevidade do processo, e porque os agentes de ação prolongada anestésico não são usados, a utilização de um dispositivo de aquecimento de animais não precisam ser usados ​​para manter a temperatura corporal do animal. Uma vez que o animal é anestesiado, nos membros posteriores e no dorso, ao nível das cristas ilíacas são raspadas. O animal é então colocado em decúbito esternal e seus membros posteriores são colocados em uma posição de pé aproximada usando espuma de empresa de embalagem para apoiá-lo. A pele que recobre as porções cranial maioria das cristas ilíacas, o trocânter maior do fêmur, a tuberosidade tibial lateral, a articulação do tarso, eo aspecto distal e lateral do 5 º metatarso é marcada com um marcador não-tóxico permanente. O animal é recuperado da anestesia. Para estudos temporais, anestesia periódica pode ser obrigado a raspar o hindlimbs assim autorizando a colocação de marcador subseqüente reflexivo (veja abaixo). Além disso, diariamente destaque dos marcos anatômicos previamente marcados (usando o marcador não-tóxico mesmo) será exigida como ratos lentamente vai remover os marcadores através de comportamento de limpeza natural. 5. Gravação de dados Todas as vistas de câmera são examinados para garantir que sua posição é apropriada e capturar o mesmo campo de visão. Cada câmera deve ser colocado em cerca de 60-80 graus um do outro. O campo de visão deve incluir a forceplate no centro e um comprimento de pista suficiente para capturar dois passos. O volume de calibração é colocado dentro da área pré-determinada da pista. Um único quadro do volume de calibração dentro da pista, a partir de cada uma das câmeras, é capturado. Todas as marcas calibrado ao longo do comprimento de cada um dos pólos são digitalizadas. Apenas uma vez um erro satisfatório na digitalização é realizado, o experimentador pode proceder à coleta de dados locomotor. Esta etapa de calibração é fundamental antes de coletar os dados. Se a calibração não é realizada com precisão, ou se a calibração não ocorre imediatamente antes de uma sessão de gravação, todos os dados resultantes serão imprecisos e inutilizável. Importante, se qualquer uma das câmeras são tocados ou movidos, é mais seguro assumir que a calibração do sistema precisa ser repetido. Imediatamente antes de colocar o animal na pista, seu peso é gravado e pré-fabricados cônicos marcadores reflexivo (usando fita reflexiva 3M, ver tabela) sejam respeitadas as marcas pré-determinado sentido feita sobre os marcos topográficos dos membros posteriores. Registro do peso do animal vai permitir a normalização retrospectiva das forças de reação do solo com o peso corporal - um aspecto importante se se deseja fazer comparações entre os grupos. Além disso, a medição do peso corporal facilita o monitoramento da saúde geral do animal para a duração do experimento. Colocação único marcador requer a manipulação de animais apropriados e não requer anestesia do animal. Se o adesivo na fita reflexiva é insuficiente para aderir à pele do animal, uma pequena quantidade de cola não tóxica (por exemplo, a 3M Adesivo Tissue VetBond) pode ser usado para facilitar a aderência do marcador no corpo do animal. Uma vez que os marcadores são colocados no hindlimbs, o experimentador deve ser posicionado confortavelmente perto do teclado do computador e ter em mão o marcador de eventos ligados através do sistema Motus Vicon. Usando o arquivo como um modelo calibrado, vários arquivos são feitas antes da gravação. Tipicamente, 25 a 30 arquivos precisam ser salvos. Cada arquivo deve ser nomeado de forma exclusiva. Cada arquivo irá representar registrado executar do animal a ser gravada. Vinte e cinco a 30 arquivos são necessários para garantir que um número suficiente de pistas reunião a velocidade critério de inclusão (ou seja, 60-90 cm / s) são coletados. Depois de um número suficiente de arquivos são criados o pesquisador pode iniciar a coleta de dados. O e-xperimenter deve levar o rato para transporte dentro da pista, jogando pedaços ¼ de cheerios em cada extremidade da pista. Com a coordenação cuidado e tempo, o marcador evento é disparado no início e apenas antes da conclusão do rato concluir com sucesso um passe longo da pista. Depois de examinar a força de reação do solo bruto rastreamento, e após a gravação se à esquerda ou à direita membros bater a plataforma de força, o arquivo é salvo e fechado. Igual número de visitas forceplate esquerdo e direito dos membros devem ser registrados. O processo de gravação dos dados de uma execução é repetido até que um número suficiente de roda foram registrados. 6. Análise de Dados Após completar a coleta de dados para cinemática e as forças de reação do solo, cada execução de cada animal precisa de ser avaliado para a velocidade. Utilizando dois marcadores relativamente fixa (por exemplo, as asas do iliums) pode-se avaliar um ponto virtual entre os marcadores (feito antes ao criar um modelo de arquivo Vicon Motus). Antes de calcular a velocidade desse ponto &quot;virtual&quot;, os marcadores para os marcadores ilíaca deve ser digitalizado. Usando Vicon motus software, a velocidade deste ponto virtual no X-direção (direção horizontal do movimento) é calculado. Ao fazer isso, só é executado dentro de um determinado intervalo velocidades (determinado a priori) são utilizados nas análises finais. Descobrimos que os animais se deslocam entre 60-90 cm / s estão usando consistente gaits trote. Um mínimo de 10 provas (5 pistas onde o membro esquerdo faz contato com a plataforma de força e 5 pistas onde o membro direito faz contato com a plataforma de força) são obrigatórios. Uma vez que o executado aceitáveis ​​são identificados para cada animal, a digitalização dos marcadores pele restante deve ser completado. Para compensar artefato pele movimento sobre o joelho, a estimativa da posição do joelho é calculado usando triangulação (intersecção entre dois círculos cinemática 2D, ou intersecção entre duas esferas 3D cinemática), como foi descrito anteriormente. Ângulos do quadril, joelho e jarrete, velocidades e acelerações podem ser determinadas. Apoio e balanço vezes também pode ser avaliada, embora a sua precisão é limitada baseada na velocidade de amostragem das câmeras serem empregados. Estes e outros cálculos podem ser executados diretamente (ou seja, sem exportação) usando Vicon Motus KineCalc software, ou dados podem ser exportados como dados ASCII e analisados ​​utilizando rotinas personalizável no software, tais como MatLab. Dados chão força de reação é medida e amplificada pela plataforma de força AMTI e recolhidos em 1200 Hz por Vicon Motus. Como tal, uma vez que o chão força de reação de dados são coletados, uma adequada filtro digital é aplicado aos dados usando Motus Vicon. Dado que o experimentador já determinou a velocidade das viagens e identificou corre aceitável após digitalização marcadores apropriados, os dados de força de reação do solo que foi coletado, simultaneamente, como os dados de cinemática, podem ser analisados ​​usando Vicon Motus KineCalc diretamente, ou indiretamente usando algum outro software personalizável rotina. Uma variedade de variáveis ​​para as forças, em cada uma das três direções ortogonais, pode ser calculada. Essas variáveis ​​incluem pico de força, und área da curva (ie impulso), etc É importante ressaltar, no entanto, o pesquisador deve manter os dados dos membros direito e esquerdo para cada execução de cada animal em separado. Dados extraídos dos membros direita ou esquerda é feita a média para cada animal e usado como dados representativos para esse animal. Dados são então analisados ​​por procedimentos estatísticos apropriados. 7. Resultados representante Para representar a utilidade desta forma de análise locomotor, cinemática e forças de reação do solo foram determinados para os jovens, de meia-idade, e geriátrica ratas Wistar. A partir desta análise, relacionadas com a idade foram encontradas diferenças de ratas Wistar. Em particular, a análise do solo força de reação demonstra que ratos geriátricos reduziram forelimb capacidade de frenagem e tendem a usar suas patas traseiras mais para estabilização lateral em comparação com os outros grupos de animais (Figura 1). Análise cinemática não revelou nenhuma diferença significativa entre cada grupo, porém demonstra que a cinemática pode ser facilmente gravado a partir de praticamente qualquer idade de rato (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2138/2138fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 força de reação do solo rastreamento retirados os membros esquerdo da jovem. (4 meses de idade; n = 7), de meia-idade (13-14 meses de idade; n = 7), e geriátrica (24 meses de idade; n = 5) ratas Wistar. Membros direito foram semelhantes. É facilmente perceptível que os ratos geriátricos usar suas patas dianteiras para menos de frenagem (* = p &lt;0,05) em comparação com ratos jovens e de meia-idade, e ratos geriátricos tendem a usar suas patas traseiras mais para estabilização lateral em comparação com ratos jovens (**). Linhas sólidas representam a média, linhas pontilhadas representam a média + SE; tracejadalinhas representam a média SE. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2138/2138fig1.jpg">Clique aqui para ver uma figura maior.</a> <img src="/files/ftp_upload/2138/2138fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Figuras cinemática para o membro esquerdo de ratos jovens, de meia-idade e idosos. Figuras da vara representar o movimento médio da perna esquerda para cada um dos grupos. Não houve diferenças significativas entre os grupos de animais para ângulo da articulação durante o ciclo de passo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2138/2138fig2.jpg">Clique aqui para ver uma figura maior.</a>

Não há conflitos de interesse declarados.

O presente trabalho fornece metodologia para avaliar a locomoção contínua usando cinemática quantitativa e determinação força de reação do solo. Importante para qualquer pessoa interessada em empreender essa metodologia é uma sólida experiência em biomecânica da locomoção, comportamento animal sensório-motor, e gerenciamento de dados e manipulação. Embora a determinação força de cinemática e de reação do solo exige mais tempo e expertise, em comparação com outras formas de análise locomotor (medidas endpoint por exemplo, escalas de classificação ordinal), os dados obtidos é sensível, objetiva e quantitativa para uma variedade de 14-22 ortopédicos e neurológicos 1-3, 23-32 modelos de doença, em uma variedade de espécies. Nós fornecemos dados que descrevem diferenças na locomoção entre as idades diversas informações tensão pareados ratos que não poderia ser adquirida através de medidas simples e menos sensíveis. Além disso, análise cinemática e cinética de locomoção foi utilizado para descrever alterações locomotor em uma variedade de condições do sistema nervoso, onde outras formas de avaliação seria vencida. 8, 23-25, 27 O uso de medidas sensíveis se torna especialmente importante quando se avalia o potencial therapeutants para vários modelos de doença. Se um teste não é sensível o suficiente para discernir um efeito de um potencial therapeutant o pesquisador corre o risco de cometer um erro tipo II estatística (ou seja, concluir que não há efeito de um tratamento, quando na verdade houve um efeito). Além disso, como medidas de desfecho e os testes mais subjetiva que avaliam a locomoção, existe um potencial de viés. Avaliação cinemática e cinética é puramente objetiva, em que, desde que critério de inclusão / exclusão apropriados são feitos a priori, o pesquisador simplesmente recolhe, analisa e aplica estatísticas apropriadas aos dados (ou seja, não existe nenhum componente subjetivo para determinação de dados). Análise cinemática e cinética também proporciona a capacidade de ser usado para uma infinidade de espécies. Na verdade, a cinemática, determinação força de reação do solo, ou ambos têm sido usados ​​em uma variedade de espécies como elefantes 33-35, gado 36, 37-40 cavalos, cães 4, 41-45, 21 gatos, 46-49, vários roedores 3, 8, 50, 51, pássaros 4, 52-55, e peixes 56, 57 (esta lista não é de forma exaustiva). Na experiência dos autores, no entanto, o uso de ratos é problemático dado que os ratos não são fáceis de operantly condição para viajar ao longo de uma pista. Diante disso, os ratos não viajará a uma velocidade relativamente constante e, em vez da velocidade-up e slow-down ao atravessar a pista. Este comportamento pode provavelmente, em parte, ser superado pela execução ratos em esteira e filmando o locomoting animais na esteira. 58 Se o aparato experimental para a determinação força de reação do solo deveria ser modificado para o uso escada rolante, terra determinação força de reação seria provavelmente só ser facilmente obtidos para força vertical de reação do solo como a correia da escada rolante iria interferir com a frente-ré e medio-lateral determinação força. Ao todo, análise cinemática e cinética de locomoção é um método confiável, sensível e objetivo que pode ser empregada para diversos modelos de condições ortopédicas e neurológicas. Além disso, todo o equipamento tornou-se disponível para uso em roedores, negando assim qualquer motivo relacionado para a não realização deste tipo de análise comportamental sensório-motor.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low load miniature force platform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMTI</td>
<td>HE6X6</td>
<td>http://amti.biz/PDFDownloads/0908HE6x6.pdf</td>
</tr>
<tr>
<td>Vicon Motus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vicon</td>
<td>Vicon Motus software</td>
<td>http://www.vicon.com/applications/animal.html 

The force platform can be purchased as an integrated package with the Vicon Motus system.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vicon Motus KineCalc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vicon</td>
<td>Vicon Motus KineCalc software</td>
<td>http://www.vicon.com/applications/animal.html Proprietary software compatible with Vicon Motus data, thus enabling direct and customizable data calculations.
</td>
</tr>
<tr>
<td>Video Cameras</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vicon</td>
<td>Varies depending upon needs</td>
<td>http://www.vicon.com/applications/animal.html A minimum of 4 cameras are required for bilateral 2D or 3D imaging of hindlimb kinematics during rat locomotion. Cameras that sample at 60 Hz are sufficient for rats locomoting between 60 and 90 cm/s. High speed cameras will permit identification of very small, yet possibly important, differences in interlimb coordination.</td>
</tr>
<tr>
<td>Calibration volume or frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vicon</td>
<td>Custom</td>
<td>http://www.vicon.com/applications/animal.html An appropriate calibration volume must be purchased and used for calibrating the coordinates prior to performing videography each and every time of new data collection or if any of the cameras are moved. This dimensions of this calibration volume are based upon the field of view being examined.
</td>
</tr>
<tr>
<td>Reflective tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>NA</td>
<td>Can be purchased bulk through a 3M distributor or on an as-needed basis from VICON
 http://solutions.3m.com/en_US/?WT.mc_id=www.3m.com/us http://www.vicon.com/applications/animal.html</td>
</tr>
<tr>
<td>Cheerios</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>General Mills</td>
<td>Cheerios</td>
<td>http://www.cheerios.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue adhesive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can be purchased through a 3M distributor 
http://solutions.3m.com/en_US/?WT.mc_id=www.3m.com/us</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

kinematics and ground reaction force determination: a demonstration quantifying locomotor abilities of young adult, middle-aged, and geriatric rats

Comportamento, em sua definição mais ampla, pode ser definida como a manifestação do motor de processos fisiológicos. Como tal, todos os comportamentos se manifestar através do sistema motor. Nos campos da neurociência e ortopedia, a locomoção é um comportamento comumente avaliados por uma variedade de modelos de doenças. Por exemplo, a recuperação locomotora após lesão traumática para o sistema nervoso é um dos comportamentos mais comumente avaliada 1-3. Apesar de locomoção pode ser avaliado usando uma variedade de medições de parâmetros (por exemplo, o tempo necessário para completar uma tarefa locomotora, etc), semiquantitativo medidas cinemáticas (por exemplo, escalas de classificação ordinal (por exemplo, Beattie e Bresnahan Basso locomotor (BBB) ​​escala de avaliação, etc)) e substituto medidas de comportamento (por exemplo, força muscular, velocidade de condução nervosa, etc), apenas cinética (medidas de força) e cinemática (medições de segmentos do corpo no espaço) fornecer uma descrição detalhada da estratégia pela qual um animal é capaz de locomover 1. Apesar de não novas medições, cinemática e cinética de roedores locomoting é agora mais acessíveis devido à disponibilidade de equipamentos comercialmente disponíveis, projetados para este fim. Importante, entretanto, os pesquisadores precisam estar muito familiarizado com a teoria de análises biomecânicas e compreender os benefícios e limitações dessas formas de análises antes de iniciar o que será um estudo relativamente trabalhoso. O presente trabalho tem como objetivo descrever um método para coleta de dados reação cinemática e de forças terrestres usando equipamentos disponíveis comercialmente. Detalhes dos equipamentos e aparelhos set-up, treinamento de pré-animais, critérios de inclusão e exclusão de corridas aceitável, e métodos para a coleta dos dados são descritos. Nós ilustrar a utilidade desta técnica de análise comportamental, ao descrever a cinemática e cinética de adultos tensão pareados jovens, de meia-idade, e ratos geriátricos.

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Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Locomoção geralmente é analisado como um resultado de comportamento em vários modelos de doença em áreas como neurociência e ortopedia. Este artigo tem a intenção de vídeo para descrever um método para coletar as forças de reação do solo e cinemática de ratos durante a locomoção irrestrita.

Cinemática e terra Determinação Força de Reacção: Uma demonstração Habilidades Locomotor Quantificação da Jovem Adulto, de meia-idade, e Rats Geriátrica

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

kinematics-ground-reaction-force-determination-demonstration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.6K visualizações.  Riverview, NB. Locomoção geralmente é analisado como um resultado de comportamento em vários modelos de doença em áreas como neurociência e ortopedia. Este artigo tem a intenção de vídeo para descrever um método para coletar as forças de reação do solo e cinemática de ratos durante a locomoção irrestrita.

Vídeo: Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Crescimento e Diferenciação de Adultos Hippocampal terra ártico Squirrel células-tronco neurais

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Neurociência

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Determinação rápida do limiar térmico nociceptivo em ratos diabéticos

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

A Metric Test for Assessing Spatial Working Memory in Adult Rats Following Traumatic Brain Injury

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of human studies, animal models provide suitable alternatives to test treatment methods, and to study the mechanisms and related complications of the condition. Experimental rodent models have historically been the most widely used due to their accessibility, low cost, reproducibility, and validated approaches. A metric test, which tests the ability to recall the placement of two objects at various distances and angles from one another, is a technique to study impairment in spatial working memory (SWM) after TBI. The significant advantages of metric tasks include the possibility of dynamic observation, low cost, reproducibility, relative ease of implementation, and low stress environment. Here, we present a metric test protocol to measure impairment of SWM in adult rats after TBI. This test provides a feasible way to evaluate physiology and pathophysiology of brain function more effectively.

Traumatic brain injury (TBI) is commonly associated with memory impairment. Here, we present a protocol to assess spatial working memory after TBI via a metric task. A metric test is a useful tool to study spatial working memory impairment after TBI.

Um teste métrico para avaliar a memória espacial de trabalho em ratos adultos após lesão cerebral traumática

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.