O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos envolvidos na realização de esmagamento irreprodutível do nervo ciático, e fornecer um protocolo para a avaliação do comportamento motor após o trauma periférico. A seleção de uma poderosa e confiável bateria de teste comportamental é essencial para cobrir uma ampla gama de aspectos comportamentais, e depende do modelo animal usado e da questão da pesquisa científica. Este protocolo descreve em detalhes como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático e fornece uma bateria de teste comportamental para a avaliação de déficits motores em ratos, que inclui o teste de campo aberto, a análise da marcha catwalk, a tarefa de caminhada do feixe e a tarefa de caminhada de degraus da escada.
Os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais. Mantenha um ambiente estéril durante todo o procedimento cirúrgico. Coloque a mesa de cirurgia com o equipamento necessário.
Anestesia profundamente o rato em um armário fechado com isoflurane e raspe uma extensa área do membro traseiro direito. Em seguida, posicione o rato na máscara de anestesia e continue anestesia profunda com isoflurano. Conserte o tronco e os dois membros traseiros do rato com fita.
Coloque ambos os membros traseiros em uma posição simétrica e estendida e gire cada pata plana sobre a mesa de cirurgia. Desinfete a pele da área raspada com um antisséptico apropriado. Procure o entalhe ciático do íleo.
Faça uma incisão da pele do entalhe ciático na direção da pata com um bisturi. Se os membros traseiros estiverem fixos e a incisão da pele for realizada corretamente, pode-se ver uma cavidade no plano fascial entre o músculo glúteo máximo e o músculo fêmio femoral que se assemelha a uma linha branca. Insira fórceps hemostáticos super finos fechados na cavidade e espalhe os fórceps.
O avião fascial deve se abrir sem ferir nenhum tecido muscular. Coloque os retráteis do elástico sob os músculos para manter a incisão da pele aberta. Remova suavemente qualquer tecido circundante e vasos sanguíneos do nervo ciático até que o nervo esteja completamente exposto.
É importante não esticar ou puxar o nervo durante todo o procedimento. Esmague o nervo ciático com um grampo não serrilado com pressão constante e rápida utilizável. Para isso, abra o grampo, coloque o nervo sobre a mandíbula inferior do grampo e feche o grampo travando-o na primeira posição por 3 x 10 segundos.
Após a lesão da queda, reabra o grampo cuidadosamente. o local de esmagamento do nervo ciático parece translúcido. Remova os retratores do elástico.
Feche a incisão do avião fascial com uma sutura resorbável. Feche a incisão da pele com grampos de pele corporal. A atividade locomotor, bem como a atividade comportamental dos ratos podem ser analisadas por um teste de campo aberto.
A configuração do campo aberto, que deve ser localizado em um ambiente escuro e silencioso, consiste no sistema automatizado de rastreamento de vídeo, EthoVision XT, e uma arena com uma superfície preta resistente a riscos e limpa. Coloque a arena e a câmera na posição correta e configure o software EthoVision XT. Coloque o rato suavemente no meio da arena de testes.
Durante a gravação, o experimentador deve ficar longe do campo aberto configurado, a fim de evitar distrair o rato. Para a análise dos dados do teste de campo aberto, vá até a seção de análise na barra lateral esquerda e escolha Acompanhar a Visualização"sob a guia Resultados". Em seguida, exporte os parâmetros necessários para XL.Dentro do software, escolha uma série de variáveis de diferentes categorias para análise de dados.
Uma análise de marcha pelo sistema CatWalk XT pode ajudar a avaliar muitos parâmetros diferentes sobre as pegadas, postura e marcha dos modelos animais. Uma passarela de vidro é iluminada com luz verde e a luz espalhada pelas pegadas dos animais é capturada com uma câmera de vídeo de alta velocidade, que está localizada sob a passarela. Os sinais podem ser analisados com o software CatWalk XT.
O experimento tem que ser realizado em condições escuras. Comece configurando o sistema CatWalk XT. Escolha as configurações experimentais.
Coloque a câmera em posição e ajuste o foco. Configure as configurações de detecção. Configure as paredes do corredor do sistema CatWalk e certifique-se de que as paredes permaneçam paralelas à passarela.
Defina o comprimento da passarela e calibrar a passarela. Em seguida, tire uma imagem de fundo. Uma passarela limpa e vazia é necessária para a imagem de fundo.
O rato deve atravessar a passarela sem qualquer interrupção. De acordo com os critérios de execução definidos, três execuções compatíveis por rato são necessárias para análise de dados. Treine animais por pelo menos oito dias antes de começar com o experimento real.
O CatWalk deve ser realizado pelo menos uma vez por semana, com 6 a 10 corridas para garantir um desempenho contínuo da tarefa. Para análise de dados, apenas avalie as corridas compatíveis. Classifique as impressões da pata automaticamente com o software CatWalk XT.
Revise manualmente as etiquetas de impressão da pata. Corrija as etiquetas de impressão da pata errada, adicione etiquetas de impressões de patas não detectadas e exclua qualquer ruído e etiquetas erradas. Os resultados numéricos exibidos em uma folha XL, mostrando uma série de parâmetros básicos.
Para obter informações mais detalhadas sobre cada pegada, classifique os dedo dos dedo das patas traseiras. Esta análise requer o módulo de medição de pegada interativa. Ajuste os marcadores para a análise da pegada manualmente.
Analise cada impressão da pata traseira nas três corridas compatíveis. Desenhe uma linha do centro do primeiro dedo do dedo para o centro do quinto dedo do dedo para medir a propagação do dedo do dedo. Desenhe uma linha do centro do segundo dedo para o centro do quarto dedo para medir o spread intermediário do dedo do dedo.
Desenhe uma linha do centro do terceiro dedo do pé até o calcanhar da pata traseira para medir o comprimento manual de impressão. Revise os resultados numéricos das medidas de pegada interativa exibidas em uma folha separada. Os déficits de marcha podem ser determinados pela tarefa de andar no feixe.
O foco da tarefa de caminhada do feixe neste tópico específico de pesquisa será a análise da coordenação motora e não a avaliação do equilíbrio motor. Para a tarefa de andar de viga, é necessário um feixe, espaçador, mesa, fundo uniforme e uma filmadora. Use um feixe de madeira de 90 centímetros de comprimento, 1,7 centímetros de largura e 2 centímetros de altura.
Treine os animais por sete dias. Coloque o rato na plataforma inicial da viga. O rato deve atravessar a viga três vezes sem qualquer interrupção.
Mesmo que o rato atinja três corridas compatíveis nas três primeiras corridas, um mínimo de 6 a 10 corridas deve ser realizado para desempenho contínuo da tarefa. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação. Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas.
Aqui, o ponto de partida é rotulado por uma linha preta na trave, e a colocação do primeiro membro traseiro atrás da linha preta é definida como o ponto de partida da corrida. A colocação do primeiro membro traseiro na plataforma no final do feixe define o ponto de tempo final. Em seguida, calcule o tempo necessário para o rato atravessar o feixe.
Marque o número de passos e erros de três corridas compatíveis para ambos os membros traseiros separadamente, usando a função zoom e câmera lenta do software. Os erros incluem deslizamentos totais do pé e deslizamentos de meio pé. Um deslizamento total do pé é definido como uma colocação do pé que é seguida por deslizamento profundo, causando uma perda de contato da pata afetada com a viga.
Um meio deslize é definido como a pata deslizando para fora da parede lateral da viga sem perder contato completo. Calcule a porcentagem de deslizamentos de pé em relação ao número de passos para atravessar a viga. A tarefa de caminhada do degrau da escada pode avaliar a função motora, a colocação de membros dianteiros e membros traseiros e a coordenação entre membros.
Um aparelho de degrau de escada, espaçador, mesa, fundo uniforme e filmadora são necessários para este teste comportamental. O aparelho de degrau de letra horizontal consiste em degraus metálicos e paredes laterais de policarbonato claros. Treine os animais por oito dias.
Coloque o rato na zona de partida dos operadores de degraus de escada. O rato tem que atravessar a passarela de 100 centímetros do aparelho de degrau da escada três vezes sem interrupção, a fim de que ele se qualifique como uma corrida compatível. Selecione as sequências de vídeo de três corridas compatíveis da gravação.
Defina o ponto de tempo de partida e o ponto de tempo final das três corridas compatíveis selecionadas. A colocação do membro traseiro atrás da primeira linha preta na parede lateral do aparelho define o ponto de partida da corrida. A colocação do primeiro membro dianteiro atrás da segunda linha preta na parede lateral do aparelho define o ponto final da corrida.
Em seguida, calcule a duração da corrida através da passarela. Marque as três corridas compatíveis com a escala de 7 categorias de Mets e colegas usando a câmera lenta ou a função quadro por quadro do software. Determine o número de etapas e o número de erros de acordo com as categorias da escala para cada membro separadamente.
A escala distingue entre as seguintes categorias. Total falta. Deslizamento profundo.
Um pequeno deslize. Substituição.Correção. Colocação parcial. E corrigir a colocação.
Em seguida, calcule os erros por etapa. Os resultados representativos do teste de campo aberto de cinco minutos mostram que a lesão por esmagamento nervoso, cinco semanas após a cirurgia, não tem efeito na atividade locomotor. A análise de marcha com o sistema CatWalk XT gera muitos parâmetros diferentes.
Alterações significativas podem ser detectadas para a velocidade média de corrida, o comprimento do passo e a área de impressão da pata traseira direita lesionada pelo nervo. Ratos selvagens feridos pelos nervos mostraram um aumento significativo do tempo de latência para atravessar a trave, em comparação com ratos ingênuos do tipo selvagem cinco semanas após a lesão. Como uma leitura adicional da tarefa de caminhada do feixe, foram contados deslizes completos e meio deslizes do membro traseiro ferido pelo nervo e considerados como um erro para análise estatística.
A porcentagem de erros por passo do membro traseiro direito ferido pelo nervo foi significativamente aumentada em ratos selvagens feridos pelo nervo, em comparação com ratos ingênuos do tipo selvagem. Os dados representativos da tarefa de caminhada do degrau da escada não mostram alterações significativas no tempo de latência para atravessar a passarela do aparelho degrau da escada, ou na porcentagem de erros por passo do membro traseiro direito ferido pelo nervo. A análise do percentual de erro por passo do membro traseiro lesionado do nervo considerou apenas o escore de 0 a 2 da escala de categoria 7 de Mets e colegas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma lesão de esmagamento do nervo ciático, e como implementar uma avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após a queda unilateral do nervo ciático. Para alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e comparáveis após uma lesão de esmagamento do nervo ciático, um método padronizado para induzir o esmagamento nervoso é essencial, bem como uma caracterização fenotipicamente padronizada. O treinamento adequado para um teste de comportamento específico oferece as vantagens de economizar tempo durante a avaliação do experimento e obter melhores resultados.
