Trabalho em nosso laboratório é apoiado pela concessão de CARREIRA MCB0551798 da National Science Foundation e conceder ÁREA R15GM86839 do NIGMS-NIH.

1. Crescimento e irradiação UV. <ol><li> 200μl de uma cultura fresca durante a noite contendo o plasmídeo pBR322 cultivadas em Davis meio 1 suplementado com glicose 0,4%, 0,2% casamino ácidos, e 10 mcg / ml timina (médio DGCthy) e 100 mg / ml ampicilina é peletizada. O pellet celular é então ressuspenso em meio DGCthy 200μl falta ampicilina e usada para inocular 20 ml de meio de DGCthy. </li><li> Culturas são cultivadas sem ampicilina seleção em uma incubadora de agitação a 37 ° C para um OD 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 células / ml). Crescimento sem ampicilina evita seleção contra intermediários de replicação anormal ou improdutivas que podem surgir em alguns mutantes. Além disso, se estiver usando luz UV para induzir a dano, a remoção da ampicilina da mídia é necessária, pois absorve fortemente nestes comprimentos de onda e escudos das células, reduzindo a dose efectiva de UV. </li><li> Trabalhando sob luzes amarelas, a cultura é colocada em um prato de 15 centímetros de diâmetro Petri sobre uma plataforma giratória para agitação. Nossas culturas são colocados a uma distância de uma lâmpada germicida de 15 watts, que produz uma taxa de exposição de ~ 1 J/m2/sec, que é medida usando um fotômetro UVC. Culturas são irradiados com 50 J/m2 e depois colocado imediatamente de volta para a agitação 37 ° C incubadora para a duração do experimento. Esta dose produz, em média, um ciclobutano pirimidina dímero cada 4,5 kb de ssDNA. A iluminação amarela impede fotorreativação reversão de dímeros de pirimidina ciclobutano por fotoliase. </li></ol> 2. DNA Isolation. <ol><li> Às vezes, quando os intermediários de replicação devem ser examinados, uma alíquota de 0,75 ml da cultura é colocada em 0,75 ml de tampão de gelo NET30 frio (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) e colocados no gelo até o final do o curso do tempo. Nós normalmente executam um curso de tempo 90 minutos, com amostras examinadas em 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos. O EDTA e temperatura fria serve para efetivamente parar a replicação e reparação por excisão de nucleotídeos. </li><li> Cada amostra é então peletizadas, ressuspenso em 150 mL de 1,5 mg / ml lisozima e 0,2 mg / ml RNaseA em TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) e lisadas a 37 ° C por 20 min. Neste momento, 10μl de proteinase K (10mg/ml) e 10μl de sarkosyl 20% são adicionados e os de incubação é autorizado a continuar por 1 hr. Proteinase K e sarkosyl ajudar a liberar fragmentos de DNA que podem ser associados com a membrana ou proteínas antes da extração de fenol ocorre. Desde DNA ativamente replicando muitas vezes é obrigado a complexos de proteínas ou membrana, esta ajuda a aumentar o rendimento de fragmentos de replicação que são recuperados. </li><li> Amostras são então extraídos pela adição de 2 volumes de fenol, para cada amostra e os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos. Em seguida, 2 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados e os tubos são suavemente invertido uma vez por 5 minutos. </li><li> As amostras são centrifugadas a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos ea fase aquosa superior de cada amostra é retirada, e colocado em um novo tubo. Em seguida, 4 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados, os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos, e centrifugadas novamente a 14.000 rpm por 5 minutos. </li><li> A fase superior, aquosa de cada amostra é então dialisadas para 1 hora de spotting 100μl de cada amostra em um disco de 47 milímetros mM Whatman 0,025 poros que flutua em 250 ml de 0,1 x TE num copo. Porque as estruturas replicando com regiões único fio ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao corte, que normalmente cortam nossas dicas de pipeta fora com uma lâmina de barbear para fazer a boca mais larga e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, pipetagem deve ser reduzido ao mínimo até que o DNA foi digerido com enzimas de restrição. </li><li> Cada amostra é então digerido com PvuII (New England Biolabs), que lineariza o plasmídeo apenas a jusante da origem de replicação. </li><li> Antes de carregar no gel de agarose, clorofórmio e 100μl 20μl de corante que contém carga 6X Cyanol Bromofenol Azul e Xileno são adicionados a cada amostra e mistos. Então, 40μl da fase aquosa contendo o corante de carregamento é carregado no gel. Para minimizar os vieses estruturais, artefatos estruturais e corte de DNA, este procedimento de isolamento não inclui quaisquer medidas para enriquecer a regiões único fio, precipitado, ou concentrar as amostras de DNA após a lise celular. </li></ol> 3. Gel 2D e Análise do sul. <ol><li> O 2-dimensional análise agarose-gel é modificado a partir do 3. Para a dimensão 1 º, as amostras de DNA restrito são executados através de um gel de agarose 0,4% em TBE 1X em 1V/cm. Um litro de solução de TBE 10X de ações contém: <ul><li> 108 g Tris Base de Dados </li><li> 55 g de ácido bórico </li><li> 40 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0) </li></ul></li><li> A lambda marcador tamanho Hind III é carregado na pista primeiro, depois as amostras são carregadas em cada outra pista. Que normalmente executa o primeiro dimension ~ 12-15 hrs. Pular faixas torna mais fácil para cortar as pistas fora para lançar na segunda dimensão. A baixa tensão e baixo percentual de agarose gel serve para separar os fragmentos de DNA principalmente com base em tamanho. </li><li> Para a segunda dimensão, pistas gel são cortados fora do gel primeira dimensão usando uma faca de açougueiro grandes. A primeira faixa que contém o marcador lambda III Hind pode ser corado com brometo de etídio. Usando o marcador lambda III Hind como um guia de culturas, e descartar a região do gel que é abaixo de onde o plasmídeo linearizado é esperado para ser executado. Sob essas condições, descobrimos que pBR322 linearizada corre ligeiramente acima da cyanol xileno mancha. </li><li> Para lançar a segunda dimensão, cada faixa é colocada horizontalmente na parte superior de um gel caster vazio. A solução de agarose 1,0% em TBE 1X é preparado e resfriado a 55 ° C. Neste momento, a solução é derramado em gel para lançar a segunda dimensão, certificando-se cobrir completamente as fatias de gel. Uma vez que o gel tem definido, ele é executado no 6.5V/cm em uma unidade de eletroforese, que permite o buffer para recircular. Normalmente, executar a segunda dimensão ~ 5,5-7 horas. A alta tensão e alta cento agarose gel efetivamente separa os fragmentos de DNA com base em sua forma, assim como o tamanho. Formas não-lineares funcionar mais lentamente através da segunda dimensão. </li><li> Eletroforese seguinte, o gel é então lavado em H 2 O, lavados duas vezes em 400ml de ácido clorídrico 0,25 m por 15 minutos, lavados com H 2 O;, e depois lavados duas vezes em 400 ml de NaOH 0,4 M por 30 minutos. O ácido lava servem para nick parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores que a transferência de forma mais eficiente. Esta etapa é necessária devido ao grande tamanho e formas incomuns dos intermediários de replicação do DNA. </li><li> O DNA no gel é então transferido para uma Hybond N + nylon membrana 4. Usamos um sistema de transferência para baixo alcalino com NaOH 0,4. Brevemente, duas folhas de papel mata-borrão embebido em NaOH 0,4 M são colocados em uma grande pilha de toalhas de papel. A membrana de nylon também é embebido em NaOH 0,4 M e colocado em cima do mata-borrão. O gel é então cuidadosamente em camadas no topo desta, seguido por um outro pedaço de papel mata-borrão, umedecidas na solução de NaOH. Finalmente, um longo pedaço de papel mata-borrão molhado é em camadas na parte superior e suas duas extremidades são colocadas em um prato com 1 L de solução de NaOH 0,4 M para servir como um pavio. Normalmente, deixe a transferência de DNA para 12/06 horas. </li><li> A membrana de nylon é removido, lavado em 20-30 seg Buffer SSC 5X, e colocado em um frasco contendo solução de hibridização rolo Prehybridization 10.5ml. Então, a membrana é incubada a 42 ° C com rotação por mais de 6 horas. Solução Prehybridization: <ul><li> 5,0 ml formamida </li><li> 0,5 ml SDS 20% </li><li> 2,5 ml * 20X SSC </li><li> * 2,0 ml de 50X Denhardt </li><li> 0,5 ml de DNA de esperma de salmão (10mg/ml) * Receitas para SSC e Denhardt pode ser encontrada em 5 </li></ul></li><li> Durante o período prehybridization, 1 mg de pBR322 plasmídeo é marcado com 32P pela tradução nick acordo com o protocolo fornecido pela Roche alfa usando rotulados [32-P] dCTP-. A sonda marcada (100μl) é desnaturado pela incubação a 98 ° C por 10 minutos em um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca, em seguida, colocada imediatamente no gelo. </li><li> A sonda desnaturada é adicionado a 5,9 ml de solução de hibridização, que contém: <ul><li> 3,0 ml formamida </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml de 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml SDS 20% </li><li> 0,15 ml 10mg/ml DNA do esperma de salmão </li></ul></li><li> A solução prehybridization é derramado da garrafa rolo ea solução de hibridação é derramado dentro A garrafa de rolo é então devolvido à 42 ° C incubadora e rodado por mais de 12hrs. </li><li> A solução de hibridação é derramado da garrafa rolo. Então, o blot é lavado 4 vezes por 20 minutos na garrafa de rolo com ~ 150 ml de uma solução de lavagem contendo SSC 0,5 X, SDS 0,1% a 42 ° C com rotação. </li><li> Após a última lavagem, a membrana é colocada em uma toalha de papel até que o líquido tem visivelmente desapareceu. A membrana é então envolto em cloreto de polivinil-plástico e expostos a uma tela phosphorimager. Nós visualizar e quantificar a radioatividade usando uma tempestade 840 e seu software associado ImageQuant. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Intermediários de replicação do plasmídeo observada na presença e ausência de UV induzida por dano ao DNA. O padrão de migração de PvuII digerida pBR322 plasmídeo observado por 2D-agarose-gel análise é diagramado. Não-linear replicar plasmídeos executado como um fragmento de 4,4 kb linear. Plasmídeos replicar formulário em forma de Y estruturas que migram mais lento do que os fragmentos não-replicantes, devido à sua maior dimensão e nãoforma nlinear. Este padrão de migração formas um arco que se estende para fora da região linear para o bem. Após a irradiação UV, duplo Y ou X em forma de moléculas são observadas na região cone que migra mais lentamente do que o arco de Y em forma de moléculas. Um exemplo da análise do sul do gel 2D sondado com 32P-rotulados pBR322 é mostrado para as células imediatamente após a irradiação UV e 15 minutos após a irradiação UV (reproduzido com permissão do editor).

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Resultados típicos obtidos a partir de células de tipo selvagem, na presença e ausência de UV induzida por danos são mostrados na Figura 1. Na ausência de danos, cerca de 1% do DNA total plasmídeo pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial. Após a irradiação, um aumento transitório no Y moléculas em forma é observado como garfos de replicação bloqueados acumular em locais danificados. Os intermediários em forma de X replicação também transitoriame...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

Replicação imprecisa na presença de danos no DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celular e mutagênese observado em todos os tipos de células e é acreditado extensamente para ser diretamente associada ao desenvolvimento de câncer em seres humanos. Danos ao DNA, como a induzidas por radiação UV, severamente prejudica a capacidade de replicação para duplicar o modelo genômico com precisão. Uma série de produtos de genes foram identificados que são necessários quando a replicação de DNA encontros lesões no modelo. No entanto, um desafio restante foi para determinar como essas lesões proteínas processo durante a replicação<em&gt; In vivo</em&gt;. Usando Escherichia coli como um sistema modelo, descrevemos um procedimento no qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar os intermediários estruturais que surgem em plasmídeos replicar<em&gt; In vivo</em&gt; Seguinte UV induzida por dano ao DNA. Este procedimento tem sido utilizado para demonstrar que forquilhas de replicação bloqueada pelo UV induzida por danos sofrer uma reversão transitória que é estabilizado por RecA e produtos de genes associados com vários RecF o caminho. A técnica demonstra que esses intermediários de replicação são mantidas até que um tempo que se correlaciona com a remoção das lesões através de reparação por excisão de nucleotídeos e retoma a replicação.

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Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

10.6K visualizações.  Portland State University. Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

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Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biologia

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em&gt; E. coli</em&gt; Para raios-X Cristalografia

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...