Agradecemos ao Dr. T. Helleday e Dr. E. Petermann para ajudar com a técnica de fibras, bem como os membros do laboratório para discussão útil. WN é apoiado por uma Bolsa de Investigação Sênior Internacional da Associação Internacional para Pesquisa do Câncer e pelo Comitê de Estado polaco de Investigação Científica de subvenção (N301 165935).

O método descrito aqui foi usado na seguinte publicação: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 cultura de células Materiais: soro fetal bovino (FBS), frango soro, penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI <ol><li> Prepare meio de cultura celular: FBS adicionar 7%, 3% de soro de frango, 1x penicilina / estreptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanol para meio RPMI. </li><li> DT40 células são cultivadas em frascos de cultura de células estéreis, a 38 ° C e 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada. Dividir células todos os dias para uma densidade de 5 x 10 5 células / ml 6. </li></ol> 2. Na rotulagem vivo Materiais: UDI, CldU <ol><li> Preparar soluções estoque de nucleótidos: dissolver UDI a 5 mM e 2,5 mM para CldU no meio. Calor ambas as soluções rapidamente para 60 ° C e vortex até que o análogo dos nucleótidosues são dissolvidos completamente. </li><li> Adicionar UDI a uma concentração final de 25 mM para crescimento exponencial DT40 células e mistura da suspensão de células também. Incubar as células durante 20 minutos a 38 ° C e 5% CO 2. </li><li> Após a incubação com a primeira etiqueta, adicione CldU para uma concentração final de 250 mM e tratar células, como descrito no passo anterior. </li><li> Lavar as células com PBS gelado e ressuspenda-los em uma concentração de 7,5 x 10 5 células / ml em PBS frio. Manter as células rotuladas no gelo. </li></ol> O procedimento de classificação e rotulagem é apenas uma sugestão e pode ser modificado para tratar de questões específicas. Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre design experimental. 3. Lise celular e DNA se espalhando Materiais: lâminas de vidro, fibra de solução de lise <ol><li> Prepare a solução de lise de fibras: 50 mM EDTA e SDS 0,5% em 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li&gt; Spot 2 l da suspensão de células para uma extremidade da lâmina de vidro. Secar por 5 minutos ou até que o volume da gota é muito reduzida, mas não seca. </li><li> Pipeta 7 mL de solução de lise no topo da suspensão de células e agitar suavemente com a ponta da pipeta para misturar as soluções. Incubar por 2 minutos para lise celular para prosseguir. </li><li> Tilt slides de 15 ° para permitir que as fibras se espalhar ao longo do slide. </li><li> Uma vez que a solução de fibra atingiu o fundo do slide, colocá-lo horizontalmente para secar ao ar. Após a secagem, uma linha fina, opaca deve ser visível ao longo do slide. Neste ponto, o início das fibras esticadas devem ser marcadas com um lápis como depois da coloração da linha não será visível por mais tempo. Esta marca irá mais tarde ajudar a localizar as fibras sob o microscópio. </li></ol> 4. Imunofluorescência Materiais: metanol, ácido acético, HCl, BSA 5% em PBS, tina de coloração, anti-BrdU anticorpos (mouse),anticorpo anti-BrdU (rato), ovinos anti-rato Cy3 de anticorpos, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos, Vectashield meio de montagem, lamínulas, unha polonês <ol><li> Imergir as lâminas em metanol / ácido acético (3:1) em uma tina de coloração e incubar por 10 minutos. </li><li> Lavagem das lâminas em água destilada H 2 O, em seguida, mergulhar em 2,5 M HCl por 80 minutos. </li><li> Lavagem das lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. </li><li> Retirar as lâminas da tina de coloração e recolher PBS excesso com uma toalha de papel. Colocar as lâminas na horizontal e BSA pipeta de 5% em cima de cada slide. Cobrir os slides suavemente com uma lamela para espalhar a BSA uniformemente sobre a lâmina e incubar por 20 minutos. </li><li> Diluir os anticorpos primários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:25 anti-BrdU (mouse) e 1:400 anti-BrdU (rato). </li><li> Mover a lamela suavemente a lâmina de vidro para removê-lo. Não force se a lamínula adere ao slide. O slide pode ser reidratados em PBS até a lamela fica solto umd pode ser removido com facilidade. Coletar BSA excesso com uma toalha de papel e coloque os slides na horizontal. Pipete 50 da solução de anticorpo primário em cada slide. Cubra novamente com uma lamela para espalhar a solução de anticorpos uniformemente sobre a lâmina e incubar em câmara úmida por 2 horas. </li><li> Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos </li><li> Diluir os anticorpos secundários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:500 ovelhas anti-rato Cy3 e 1:400 de cabra anti-rato Alexa Fluor 488. </li><li> Aplicar 50 ul da solução de anticorpo secundário como descrito para os anticorpos primários. Proteger os slides da luz e incubar por 1 hora. </li><li> Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos. </li><li> Adicionar uma gota de Vectashield meio de montagem em cada slide e uma lamela. Pressione suavemente as lamelas e remover o excesso de fluido em torno dele com uma toalha de papel. Lamínulas selo com unhas transparente polish e deixe-os secar. Armazenar os slides a -20 ° C. </li></ol> 5. Aquisição de imagem Materiais: microscópio de fluorescência da câmera, Coloque uma gota de óleo de imersão em uma corrediça de perto da marca de lápis e começar a localizar as fibras. Normalmente, há um feixe de fibras principais, mas essas fibras são muito preso e não pode ser analisada mais tarde. Afastar-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras são claramente separados uns dos outros (Fig. 2). Gostaríamos de selecionar fotos usando apenas um canal de cor a fim de evitar viés. Então, levaria cerca de 10 fotos de cada linha de concentração ponto, ou de células da hora. No entanto, o número de imagens depende de quantas fibras podem ser contadas em cada imagem. Se movem ao longo do slide para tirar as fotos diferentes, como uma área de um slide pode não fornecer comprimentos de fibra representante ou estruturas de replicação. 6. A análise dos dados Materiais: programa de análise de imagem, por exemplo, ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importar imagens em um programa de análise de imagem. Medir o comprimento dos feixes de fibras e / ou contar as estruturas de replicação diferentes (Fig. 3). Só contam as fibras que são claramente visíveis e que não se estendem ao longo da borda da imagem. Normalmente, medir o comprimento de cerca de 100 fibras e contagem de 150-200 estruturas de replicação e gostaríamos de repetir experiências individuais, pelo menos, três vezes. 7. Resultados representativos: DNA recém-replicada pode ser visualizado como linhas de anticorpo marcado com nucleótidos. Em nossos experimentos um garfo em curso é representado como adjacentes sinais vermelho e verde (Fig. 3). O protocolo a dupla marcação também nos permite definir quatro classes principais de estruturas de replicação: 1) eventos de iniciação novo pode ser divid<html> ed em origens que dispararam enquanto as células foram incubadas com o rótulo de primeiro e origens que dispararam durante a incubação com o rótulo de segundo. O primeiro consiste de vizinhos verde-vermelho-verde e os últimos sinais de uma linha verde só. 2) manifestar-se como eventos de rescisão adjacentes vermelho-verde-vermelho sinais. 3) intercaladas origens são os locais no genoma com origens espaçados. Esses sites consistem de origens consecutivos e sinais de terminação. 4) dependendo do projeto experimental, parado / garfos colapso pode ser definido como um sinal vermelho apenas 7 ou uma linha vermelha seguido de um intervalo curto verde 8,9. Usando as condições aqui descritas, as células do tipo selvagem DT40 têm uma velocidade de garfo média de 0,4 mM / min. Podemos detectar aproximadamente 63% garfos em curso, a origem de 10%, 16% garfos parado (vermelho folhetos apenas), terminações 8% e 3% de fibras intercaladas. <html> ure 1 &quot;/&gt; . Figura 1 (A) O lado esquerdo do desenho animado retrata o primeiro passo do processo de rotulagem DNA: a adição de UDI para crescimento exponencial DT40 células leva o análogo de nucleotídeo para ser facilmente incorporados ao líder recém-sintetizado e atraso fitas de DNA. Isto pode ser visualizado utilizando um anticorpo específico, e será exibido como uma linha vermelha quando visto sob o microscópio. Posteriormente, o mesmo procedimento é repetido com CldU como mostrado no lado direito da figura. Após a incubação com o análogo de nucleotídeo segundo, um garfo de ativos será visível como um trato vermelho-verde adjacente. O comprimento médio de fibra é proporcional ao tempo de incubação da nucleótidos. (B) o DNA de células lisadas DT40 é esticada por gravidade para uma lâmina de microscópio e os análogos de nucleotídeos incorporados são visualizados através da utilização de anticorpos específicos e de microscopia de fluorescência. IGURA 2 &quot;/&gt; Figura 2. A imagem representativa mostra de fluorescência de fibras de tipo selvagem DT40 células posteriormente rotulados com UDI e CldU por 20 minutos cada. A maioria das fibras são bem separadas umas das outras e podem, portanto, ser facilmente analisado. A barra branca representa 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 A técnica de fibra rotulagem dupla permite distinguir entre as estruturas de replicação diferentes; 1 - garfos ativamente replicar, 2 - novos locais de replicação do DNA (disparo de novas origens), 3 - terminações fork (dois garfos convergentes), 4 - fibras intercaladas (sites de origens espaçados) e 5 - garfos parado (único sinal vermelho).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um método que permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em um nível única molécula. Nos últimos dez anos, diferentes versões da técnica de DNA fluorography fibra foram desenvolvidos para visualizar o movimento de garfos de replicação individuais dentro de células vivas. O parâmetro crítico em todas estas técnicas é o procedimento utilizado para alcançar o melhor possível alongamento de DNA em superfícies de vidro fornecendo fibras bem separados DNA. Um passo crucial para atingir este é o tempo de incubação da suspensão de células sobre a lâmina de microscópio, bem como tempo de lise. Estes parâmetros dependem da temperatura e fluxo de ar em um laboratório particular e deve ser determinada empiricamente. A parte prática de uma experiência de fibra DNA é tipicamente realizada em um dia. No entanto, a aquisição de imagem e posterior análise é mais demorado e requer prática. O protocolo de rotulagem podem ser adApted para responder a vários problemas científicos: usando um agente que interfere com a replicação durante a rotulagem segundo pulso monitores alongamento garfo / stalling em resposta ao estresse replicativo. Neste cenário, o primeiro rótulo não precisa ser lavada como o segundo nucleotídeo é adicionado em excesso. Alternativamente, as drogas que impedem a replicação pode ser usado em combinação ou apenas após a adição da primeira etiqueta. Isto requer a primeira etiqueta e que a droga a ser removido antes do segundo nucleotídeo análogo é aplicado. Este procedimento permite determinar a importância dos fatores de reparo de DNA em vários estabilidade replicativa garfo / recuperação sob condições de estresse replicativo (garfo ou seja, estagnação e / ou colapso). Notável, uma análise mais detalhada dos elementos do programa de replicação do DNA pode ser realizada com o uso de uma combinação de abordagens alternativas DNA pentear ea hibridização fluorescente in situ. Isso, entretanto, é tecnicamente mais desafiador e requer despesassive equipamentos. A capacidade de analisar qualitativa e quantitativamente elementos da replicação do DNA fornece uma ferramenta essencial para a investigação de defeitos na replicação do DNA em si, bem como os caminhos que suprimem instabilidade genômica associada com garfos de replicação. Sem dúvida, este ensaio continuará a ajudar a lançar luz sobre os mecanismos de replicação mediada reparo de DNA que permitem que as células normais para responder / se adaptar às mudanças ambientais, bem como a forma como células de câncer de utilizar estes mecanismos para resistir à toxicidade de drogas que alvejam garfos de replicação.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Ouro de soro fetal bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Chicken soro </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-iodo-2&#39;-deoxiuridina (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-desoxi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio slides SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Tampa desliza No1 </td><td> Suppplies laboratório científico </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield meio de montagem </td><td> H-1000 Vector laboratório </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-BrdU (mouse) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-BrdU (rato) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> ovelhas anti-mouse Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Manutenção da estabilidade de forquilha de replicação é de extrema importância para dividir células para preservar a viabilidade e prevenir a doença. Os processos envolvidos não só garantir a duplicação do genoma fiéis em face de danos no DNA endógenos e exógenos, mas também evitar a instabilidade genômica, um fator causador reconhecido no desenvolvimento do tumor. Aqui, nós descrevemos um microscópio baseada simples e cost-effective de fluorescência método para visualizar a replicação do DNA na linha de células B aviária DT40. Esta linhagem celular fornece uma poderosa ferramenta para investigar a função da proteína in vivo por genética reversa em células de vertebrados 1. DNA fluorography fibra em DT40 células falta um gene específico permite elucidar a função deste produto gene na replicação do DNA e estabilidade do genoma. Métodos tradicionais para analisar a dinâmica do garfo de replicação em células de vertebrados dependem de medir a taxa global de síntese de DNA em uma população de pulso marcado com células. Esta é uma abordagem quantitativa e não permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA. Em contraste, a taxa de movimento de garfos ativo pode ser seguido diretamente ao utilizar a técnica de fibra de DNA 2-4. Nesta abordagem, o DNA nascente é rotulado in vivo por incorporação de nucleotídeos halogenados (Fig 1A). Posteriormente, as fibras individuais são esticadas sobre uma lâmina de microscópio, e os tratos replicação rotulados de DNA são marcadas com anticorpos específicos e visualizados por microscopia de fluorescência (Figura 1B). Início da replicação, bem como direcionalidade garfo é determinada pelo uso consecutivo de dois análogos de forma diferente modificada. Além disso, a abordagem rotulagem dupla permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S, as estruturas de replicação ou seja, como garfos em andamento e paralisadas, a densidade de origem de replicação, bem como rescisões garfo. Finalmente, o procedimento experimental pode ser realizared em um dia, e requer apenas equipamentos de laboratório geral e um microscópio de fluorescência.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, um sistema de vertebrados modelo genético, fornece uma ferramenta poderosa para analisar a função da proteína. Aqui nós descrevemos um método simples que permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em células DT40 no nível única molécula.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

39.6K visualizações.  University of Oxford. DT40, um sistema de vertebrados modelo genético, fornece uma ferramenta poderosa para analisar a função da proteína. Aqui nós descrevemos um método simples que permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em células DT40 no nível única molécula.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.