Samir Hamdan auxiliado no desenvolvimento desta técnica. E. coli são proteínas do laboratório do Prof Nick Dixon, proteínas Universidade de Wollongong, e T7 são do Prof Charles Richardson, Harvard Medical School. Trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (GM077248 para AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Antes de realizar um experimento de replicação única molécula, alguns materiais precisam ser preparadas com antecedência. 1. Modelo de replicação do DNA O substrato para a reação de replicação é um biotinilado, M13 círculo cauda rolando preparado usando o padrão de biologia molecular 1,2 técnicas. Materiais: M13mp18 DNA de fita simples, primer oligonucleotídeo biotinilado cauda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7 DNA polimerase, bloco de calor, fenol / álcool isoamílico / Clorofórmio <ol><li> Recozer a oligo cauda biotinilado para o M13, adicionando um excesso de 10 vezes de oligo em TBS tampão (330 nM cauda oligo, 33 nM M13). </li><li> Aquecer a mistura a 65 ° C no bloco de calor. Uma vez aquecida, por sua vez o bloco de calor e deixe resfriamento lento corretamente anneal o primer. </li><li> Adicione o M13 preparado para uma mistura de 64 nM DNA polimerase T7 e buffer de replicação T7 contendo dNTPs e MgCl 2. </li><li> Incubar a reação a 37 ° C por 12 minutos e saciar com 100 mM EDTA. </li><li> Purificar o DNA preenchido produto com fenol / clorofórmio / isoamílico extração de álcool e diálise em tampão TE ou buffer de armazenamento adequado e determinar a concentração de DNA (Back-extrair cada fase orgânica para recuperar qualquer residual preparado M13). </li><li> Uma iteração do modelo de preparação pode facilmente fazer alguns ml de modelo de concentração nanomolar, o suficiente para centenas de milhares de single-molécula de experimentos. </li></ol> 2. Lamelas funcionalizados Para prender a DNA para a lamela de vidro, o vidro é o primeiro funcionalizados com um aminosilane, que é acoplado a moléculas de PEG biotinilado. Este revestimento ajuda a reduzir as interações não específicas de DNA e proteínas de replicação com a superfície 1,3. Materiais: lamínulas de vidro, potes de coloração, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k NHS-éster, Biotina-PEG5k-NHSester, acetona, 1M KOH, Etanol, Forno sonicador Bath, <ol><li> Limpam-se as lamínulas de vidro, colocando-os na coloração frascos e encher os frascos com etanol. Sonicado por 30 minutos e enxaguar os frascos e encher com 1 M KOH. Sonicado por 30 minutos Repita os dois lavagens. </li><li> Para a reação de funcionalização em primeiro lugar, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Enchei as talhas de acetona e sonicate por 10 min. Enxaguar os frascos novamente com acetona. </li><li> Prepare uma solução 2% v / v do reagente silano em acetona. Adicionar ao tinas de coloração e agitar por 2 minutos. Esta reação casais do grupo de alcóxi de aminosilane ao vidro, deixando uma amina reativos para a etapa seguinte de acoplamento. Saciar a reação com um grande excesso de água. </li><li> Seca as lamelas cozendo-los a 110 ° C no forno por 30 minutos. </li><li> Prepare um metoxi 50:1: biotina mistura PEG em 100 mM NaHCO 3 pH 8.2. Apontar para cerca de 0,2% PEG w / v biotinilado. </li><li> Pipetar 100 mL da mistura PEG em uma lamela seca silanizadas e colocar outra lamínula por cima. Incluindo um espaçador lamela de vidro vai permitir a separação das lamelas. </li><li> Incubar as lamelas na solução de PEG por 3 horas, em seguida, separe cada par de lamelas e lavar abundantemente com água. Tenha cuidado para manter as lamelas funcionalizados lateral-se como apenas o lado uma vez serão revestidas com PEG. </li><li> Seca as lamelas e armazenar sob vácuo. As superfícies de permanecer estável por pelo menos um mês, assim que dezenas de lamelas podem ser feitas em um lote e usado quando necessário. </li></ol> Estes materiais devem ser feitas antes do tempo, e então usado para cada experimento. Para iniciar cada experimento molécula única, comece a montagem da câmara de fluxo. 3. Preparação câmara de fluxo O experimento é realizado com uma câmara de fluxo simples construída com uma lamela funcionalizados, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubo. Uma câmara de fluxo está preparada para 1,4 cada molécula única experiência. Materiais: fita dupla face, lâmina de barbear, lâmina de quartzo com furos para tubos de epóxi, Quick-seca, lamela funcionalizados (veja acima), Estreptavidina solução (25 mL de 1 mg / mL em PBS), tubulação, tampão de bloqueio (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Comece colocando 20-25 mL de tampão de bloqueio em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. </li><li> Dê uma lamela PEG-funcionalizados e espalhar 125 de PBS-diluída solução de estreptavidina sobre a superfície. Deixar isso para incubar por 20 minutos enquanto prepara outras partes da câmara, permitindo estreptavidina para ligar a Biotins superfície. </li><li> Corte um pedaço de dupla faced fita para combinar com o tamanho da lâmina de quartzo. Marcar a posição dos furos de tubo na fita com um lápis, para que um esboço da câmara de fluxo podem ser tiradas na fita (1 mg / mL). </li><li> Faça um retângulo de 2 mm de largura em torno dos furos. Isso servirá como um canal de fluxo, por isso não deixe de fazer os lados em linha reta e deixar espaço ao redor da tubulação de entrada e saída. Se desejar, múltiplos canais ou tamanhos diferentes podem ser usados. </li><li> Corte ao longo do contorno desenhado, tornando reto, cortes limpos para garantir que nenhum sobressaia adesivo para o canal. </li><li> Limpe o quartzo, cuidadosamente, com acetona ou etanol para remover adesivo da construção anterior de fluxo de células. </li><li> Encontrar o melhor alinhamento do contorno do canal, remove um dos lados da camada adesiva e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina de quartzo. Tenha o cuidado de alinhar a fita corretamente, como os buracos de entrada e saída necessidade de permanecer desbloqueados. </li><li> Cortar comprimentos de tubulação para a entrada e saída da célula de fluxo. Isso ajuda a cortar a extremidade do tubo em cerca de um ângulo de 30 ° para que o tubo não vai pressionar plana contra o fundo de câmara. Colocar os tubos em algum tipo de apoio a suspendê-las para fixação fácil a célula de fluxo nas próximas etapas. </li><li> Lavar a lamela estreptavidina revestida abundantemente com água e seque com ar comprimido. Lembre-se que apenas um lado é funcionalizado; ter cuidado para não transformar a lamela mais. Remover o outro lado do suporte de fita e colocar a lâmina de quartzo para a lamela. </li><li> Pressione levemente na lamela a empurrar para fora todo o ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar as bolhas de ar entrando no canal de fluxo. </li><li> Vedação dos lados da câmara com epóxi. Insira o tubo de corte nos orifícios do quartzo e foca no lugar com epóxi. Isso precisa secar por alguns minutos. </li><li> Depois de seco, comece a bloquear a superfície, puxando alguns dos desgaseificados tampão de bloqueio através de um dos tubos. A agulha calibre 21 se encaixa perfeitamente dentro do tubo de 0,76 milímetros. Lavar algumas vezes para remover bolhas de ar, e permitir que a câmara para incubar por pelo menos meia hora. </li></ol> 4. Única molécula-Experimento de replicação Materiais: câmara de fluxo preparados, SYTOX Orange, microscópio TIRF, 532 nm do laser, CCD da câmera, computador com software de aquisição de imagem, Rolling círculo substrato DNA, proteínas de replicação <ol><li> Após a célula de fluxo foi bloqueado, tudo está pronto para começar a experiência única molécula. </li><li> Pegue a célula de fluxo e colocá-lo no palco microscópio. Segure a câmara no lugar com clipes de palco e ter certeza de que o canal de fluxo é posicionado em linha reta ao longo do eixo-y. </li><li> Conecte o tubo de saída de fluxo de células para a bomba de seringa, usando um tubo conector maior diâmetro ou uma agulha. Coloque a entrada em tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover qualquer ar no tubo. Um filme suave do tubo de saída vai ajudar a limpar as bolhas de ar aprisionado na célula de fluxo. </li><li> Diluir o modelo de DNA de ações a 25 pM em 1 mL de tampão de bloqueio. Fluxo para a câmara de fluxo moderado para permitir a cobertura boa superfície de DNA. 0,025 mL / min por 30 minutos funciona bem. Isto pode ser variado com base em quantas moléculas de DNA estão na superfície para cada lote de lamelas ou quantos forem desejados para o experimento. </li><li> Uma vez que o DNA se encontra, lavar DNA em excesso com tampão de bloqueio. Lavagem para pelo menos 200 o fluxo de células-volumes para se livrar de todo o DNA livre. </li><li> Começar a desgaseificação do buffer de replicação. Para a E. experimentos de replicação coli, fazer isso a 37 ° C para reduzir o risco de bolhas na câmara de fluxo aquecido. </li><li> Ligue o laser e câmera. O CCD refrigerado precisa atingir a temperatura antes que ele possa ser usado. </li><li> Se realizar a 37 ° C experimento, por sua vez o aquecedor ligado. Certifique-se o objetivo está em contato com a célula de fluxo ou ele vai ser um dissipador de calor mais tarde. </li><li> Após a lavagem e desgaseificação, a reação pode ser preparado. Nucleotídeos Mix, DTT, e SYTOX no buffer de replicação. Em seguida, adicione proteínas e misture delicadamente. </li><li> Fluxo da mistura de reação dentro da célula de fluxo. Esta velocidade do fluxo deve ser suficiente para esticar dsDNA. Para a 2 mm de largura, canal de fluxo 100 mícrons de altura 0,04 mL / min funciona bem. </li><li> Dar tempo para a mistura de entrar na câmara e começar a imagem. Uma boa dica é mover o campo de visão para o lado do canal e foco no material adesivo. Isso irá assegurar que você está perto da superfície para focagem. </li><li> Ajustar a potência do laser, o foco do microscópio, e ângulo TIRF. Manter o baixo consumo de energia para evitar qualquer photocleavage do DNA manchado. Adquira com 1-5 frames / segundo por vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Se desejar, repita para obter trajetórias mais de replicação ou mover para um novo campo para ver mais moléculas. </li><li> Após a mistura de reação é quase vazio, ele é uma boa idéia a fluir com mais buffer com SYTOX para ver os campos de vista do outro. Tomando várias imagens de diferentes moléculas replicado fornece estatísticas para a determinação de processabilidade. </li></ol> 5. Resultados representante Moléculas replicantes ativamente são facilmente visíveis como linhas crescente de DNA manchado. Em nossos experimentos, fluindo 25 pM do substrato M13 dá 100-1000 moléculas em um 60x 125 M x, campo 125 mM de vista (Figura 1). Realização de experimentos de replicação usando o E. proteínas coli replissoma a 37 ° C (veja Materiais para detalhes) dá moléculas replicantes 50-50 por campo de visão. Em concentrações equivalentes dos replissoma T7, que inicia no substrato com muito mais eficiência, observa-se&gt; 70% das moléculas em um campo de replicar. Estas condições produzem uma densidade do produto tão alto que moléculas individuais são difíceis de resolver e analisar, de modo que o T7 experimentos são realizados em concentrações mais baixas de proteína. Análise de dados: Para obter dados de taxa, basta traçar o ponto final do DNA em função do tempo e calcular a inclinação (Figura 2). Para processabilidade, determinar o comprimento total do DNA. Ambos estes números terão de ser convertido em pares de bases. Antes de executar o experimento, você deve saber o tamanho do pixel da câmera para a ampliação adequada. Para a conversão de pares de bases, uma boa estimativa é simplesmente a conversão com base no comprimento de cristalografia de DNA, 2,9 pb / nm. No entanto, o fluxo laminar não será completamente esticar o DNA, para uma calibragem de comprimento DNA deve ser realizado tomando um DNA comprimento conhecido, por exemplo, 48.502 bp λ DNA, anexá-lo à célula de fluxo com um oligo biotinilado e medir seu comprimento SYTOX manchada no a vazão utilizada para o experimento de replicação. Determinar o número de pares de bases / pixel permitirá o cálculo preciso das taxas de replicação e processivities. Levando inúmeras imagens e filmes irá fornecer um grande número de moléculas do produto, permitindo plotagem de taxa e processabilidade distribuições (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (De Ref 1.) Um dos desenhos animados) do ensaio de replicação rolling-círculo. (SA, estreptavidina). Levando-vertente de síntese se estende a cauda ligando o círculo e de superfície. A cauda é convertido para dsDNA pela polimerase vertente em atraso e se estendia pelo fluxo laminar. b) Exemplo de campo de visão com SYTOX Laranja e 532 nm de excitação. Pequenas manchas fluorescentes são amarrados, não replicado substratos. Observe o comprimento do extremo dos produtos e ao grande número de produtos por campo (cada célula de fluxo contém&gt; 5000 tais campos). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adaptado da Ref. 1.) A, b) Kymographs típico de moléculas replicadoras de T7 (a) e E. coli (b) experimentos. c) as trajetórias Endpoint de moléculas de a) e b) plotados em função do tempo. Trajetórias estão equipados com a regressão linear para obter taxas de replicação. Exemplos mostrados são 99,4 bp s -1 e 467,1 bp s -1. d) Comprimento distribuições de produtos de replicação, se encaixam com decaimento exponencial simples para obter processabilidade: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Taxa de distribuições de trajetórias única molécula, se encaixam com gaussianas único. Significa: 75,9 ± 4,8 s -1 bp (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Um crítico de controlo está a analisar o efeito da mancha, SYTOX Orange, sobre as proteínas de replicação de interesse. Uma maneira simples de fazer isso é realizar o experimento de replicação na célula de fluxo, como descrito, mas com a omissão de SYTOX. Após a mistura de reação fluiu através da câmara, adicionar tampão com SYTOX para manchar DNA e examinar a distribuição do comprimento das moléculas replicado. Alternativamente, reações granel padrão pode ser utilizado para verificar qualquer efeito sobre a taxa de SYTOX replicação e eficiência. O experimento aqui descrito utiliza apenas um canal de fluxo único. Isto pode ser alterado facilmente através da criação de multi-canal de câmaras de fluxo ou usando PDMS ou similar dispositivos microfluídicos. Aumentar o número de canais facilita muito triagem das concentrações de proteínas, os mutantes, ou moléculas de inibidor e aumenta a rapidez da coleta de dados de replicação. Como mencionado, realizamos a E. experimentos de replicação coli a 37 ° C utilizando uma casa construída em alumínio aquecedor de célula de fluxo, um elemento de aquecimento resistivo (aquecedor de cartucho) e fonte de alimentação variável. Isto dá boa estabilidade de temperatura e evita a compra de um aquecedor objetivo. Para calibrar o aquecedor, nós simplesmente um furo no centro de um alto fluxo de quartzo celular, inserido um termopar no canal de fluxo e fluiu buffer como normal. Medir o fluxo de temperatura tampão celular em tensões crescentes permite aquecimento precisas.

T7 Replicação: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutamato de potássio, 10 mM de cloreto de magnésio, 100 mg / mL BSA, com 5 mM ditiotreitol, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes uso. Proteínas adicionadas como: 5 nM gp4 (hexâmero), 40 nM polimerase (1:1 GP5: thioredoxin), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli replicação: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM de acetato de magnésio, 80 mM de cloreto de potássio, 100 mg / mL BSA com 10 mM ditiotreitol, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs mM, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes do uso. Proteínas adicionadas como: 30 nM DnaB (hexâmero), 180 nM DNAC (monômero), 30 nM αεθ, 15 nM 2 τ γ uma δδ&#39;χψ ou τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetrâmero), 20 nM Pria, 40 nM PRIB, 320 nM Pric, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Nós descrevemos um simples microscopia de fluorescência baseada em método em tempo real para observar a replicação do DNA ao nível de moléculas individuais. A circular, modelo de DNA bifurcada é anexado a uma lamela de vidro funcionalizados e replicados extensivamente após a introdução das proteínas de replicação e nucleotídeos (Figura 1). O crescimento do produto DNA dupla fita (dsDNA) é estendido com fluxo laminar e visualizados usando um corante intercalando. Medir a posição do fim de DNA crescente em tempo real permite a determinação precisa da taxa de replicação (Figura 2). Além disso, o comprimento dos produtos de DNA concluído relatórios sobre a processabilidade de replicação. Este experimento pode ser realizado muito facilmente e rapidamente e requer apenas um microscópio de fluorescência com uma câmera razoavelmente sensíveis.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.3K visualizações.  Harvard Medical School. Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologia

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação