Financiamento para este trabalho foi fornecida por um prêmio Grow Fundo Iowa Valores para BFBS.

1. Amostragem de superfície com fita adesiva estéril <ol><li> Selecione uma fita de usar para a amostragem. O comercialmente disponíveis Fungi Tape-Con-Tact ou-It fitas de amostragem são estéreis e, especialmente embalados para facilidade de uso. No entanto, descobrimos que transparente (translúcido) fita escritório genéricos também podem ser usados. </li><li> Use um marcador permanente para desenhar um centímetro 2 quadrados do lado não-pegajosa de um pedaço de 10 cm de fita adesiva (um modelo de papel pode ser usado). Isso servirá como um guia visual para notar que parte da fita foi utilizada para a superfície da amostra de alimentos ou ambiental. </li><li> Formar um &quot;C&quot; em forma de laço de fita, com o lado adesivo virado para a superfície a ser amostrada. Para fazer isso, segure as pontas pegajosa com o polegar eo dedo médio ea posição do dedo indicador contra o quadrado desenhado na parte de trás (não-pegajosa lado) da fita (Figura 1). </li><li> Coloque a fita sobre a superfície a ser amostrada e pressione suavemente a área marcada contra a superfície. Sem soltar as bordas da fita, use o dedo indicador para garantir que o lado adesivo da fita vem em pleno contacto com a superfície da amostra, evitando bolhas. </li><li> Usando um movimento uniforme, puxe lentamente a fita de distância da amostra, extração fisicamente ligado à superfície micróbios. Aperte a fita de células-carregada, lado adesivo para cima, sobre uma lâmina de vidro com fita de escritório genérico transparente. Garantir a tensão adequada / alongamento da fita de modo que uma superfície plana, não-wrinkly é criado. Isso ajudará a minimizar problemas com a deformação / ondulação da fita durante o aquecimento subseqüentes durante a hibridização. </li></ol> 2. Em fase sólida e Enriquecimento Miniculture superfície do líquido <ol><li> Fase sólida enriquecimento é realizada por colocar a fita de face para baixo sobre xilose-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) placas de ágar para que as células da amostra são colocados em contato direto com a superfície do ágar. A porção de contato templated / amostra da fita é colocada nivelada com a superfície do ágar e uma final da fita é vagamente aderido à parede lateral da placa de Petri para facilitar a remoção fácil da fita da superfície do ágar seguintes enriquecimento. </li><li> Placas são invertidas (para evitar a condensação) e incubadas a 35-37 ° C para permitir o crescimento suficiente de Salmonella spp. A duração do período de incubação necessário para enriquecer as células a um nível detectável dependerá dos níveis de contaminação inicial Salmonella. Temos observado a formação microcolony excelente inóculos inicial baixa após 8 h de enriquecimento. </li><li> Após o período de enriquecimento desejado, abra a placa de ágar. A fita vai manter a sua aderência durante a incubação. Pressione suavemente a fita contra o agar usando o dedo indicador para assegurar a recuperação máxima de microcolônias formada na interface de fita-ágar. Segure a fita da borda fixada na parede da placa de Petri e removê-lo com um processo lento, movimento, mesmo. Montar a fita de células-carregada, lado adesivo para cima, sobre uma lâmina de microscópio, como descrito no ponto 1.5 acima. Proceder à &quot;fixação ea desidratação&quot; passo abaixo. </li><li> Para miniculture superfície líquida, comece a fixação da fita utilizada para a amostragem em uma lâmina de microscópio, como descrito no ponto 1.5 acima. Em seguida, cobrir a parte de contato templated / amostra da fita com uma câmara de perfusão não estéreis silicone (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando uma câmara selada cujo fundo é formado por células da fita carregada, virado para cima. Firmeza, mas pressione suavemente a câmara no lugar para garantir uma vedação estanque. </li><li> Usando um gel flexível carregamento pipeta ponta, transferência ≤ 500 mL Trypticase Soy Broth ou meio de enriquecimento outro material adequado através de uma das portas da câmara pequena enseada. Seal ambas as portas com fita adesiva transparente de escritório para evitar a evaporação slides e incubar a 35 -37 ° C, conforme necessário para o enriquecimento suficiente. Apesar de todas as operações devem ser realizadas de acordo com boas práticas de amostragem e manuseio, a esterilidade de porta-fita de vedação ou câmaras de perfusão não é necessária durante miniculture superfície do líquido. A combinação de FISH e citometria de fluxo permitirão clara discriminação de Salmonella spp. de não-alvo bactérias que podem estar presentes, com a maior contribuição de não-alvo flora deverá vir da própria amostra. Proceder à &quot;fixação ea desidratação&quot; passo abaixo. </li></ol> 3. Fixação e desidratação <ol><li> Para amostragem de superfícies directo ou para o enriquecimento da fase sólida de Salmonella spp. na XLT-4 agar, executar em fita de fixação das células por 30 min a 25 ° C, cobrindo a área de contato da amostra com 500 mL de 10% neutro tamponado. </li><li> Descartar fixador em um recipiente lacrado (sob um capuz químico para minimizar a exposição a irritantes / tóxicas vapor). </li><li> Desidratar em série etanólica (50%, 80% e 95%, 300 mL / 3 min cada concentração). Proceder à &quot;hibridização&quot; passo abaixo. </li><li> Para fixação da amostra de 500 mL miniculture superfície líquidas, câmaras de perfusão são selados, e um gel flexível carregamento de ponteira é usada para extrair o enrichate. Pipetagem rápida cima e para baixo é usado para ajudar a garantir a remoção eficaz de qualquer restante de fita-bound células. </li><li> Em seguida, todo o volume de 500 mL miniculture é transferido para um tubo de microcentrífuga e girou para baixo a 2.000 xg (5 min). O sobrenadante é descartado, o pellet é agitadas vigorosamente durante 30-60 s, então ressuspenso em um volume igual de 10% neutro tamponado. Células são fixadas por 30 min a 25 ° C. </li><li> Fixador, ao lado é removida ea amostra é ressuspenso em tampão de armazenamento de células, como se segue. A amostra é girada para baixo em 2000 xg (5 min, 25 ° C) o sobrenadante é descartado, o pellet é agitadas vigorosamente por 30 - 60 s, o ressuspenso em um volume igual de 50% não desnaturado etanol 50% de fosfato solução salina. Células fixas podem ser armazenadas indefinidamente (anos) a -20 ° C. Nota: Sempre que líquidos forem alterados (por exemplo, ao introduzir um buffer de fixador ou diferentes), é importante completamente ressuspender (com vórtice) o pellet celular em uma parcela mínima (~ 10-20 mL) de líquido do sistema &quot;de saída&quot; . Isso ajudará a evitar aglomeração e garantir que as suspensões até mesmo de células individuais são obtidos. Proceder à &quot;hibridização&quot; passo abaixo. </li></ol> 4. Hibridização <ol><li> Prepare hibridação / tampão de lavagem usando o comercial de biologia molecular grau soluções observado na Tabela Materiais. Concentrações componente final do buffer é 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, sulfato de sódio 0,1% dodecil, fez até o volume final desejado com grau molecular da água e filtrada através de uma seringa de 0,22 mM ou filtro de copo. Mesmo tampão, sem adição de sondas (veja abaixo) é usado como um tampão de lavagem. Pré-aqueça hibridação e lavagem buffers a 55 ° C. </li><li> Adicionar fluorescente marcado Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &#39;) e Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&#39; ) sondas de oligonucleotídeos (Tabela de Materiais) para tampão de hibridação pré-aquecido. A sonda concentração total de 5 ng mL -1 é usado (por exemplo, 2,5 ng mL -1 sonda cada; Bisha e Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Para amostras de enriquecimento direto-para-fita e em fase sólida, sobreposição da área de contato templated amostra da fita com 300 mL de tampão de hibridação contendo o coquetel sonda e hibridizar fita-bound células em uma câmara de incubação úmida, selado definido para 55 ° C. Se uma incubadora de contato direto, como o instrumento Moat Slide (Tabela de Materiais) é utilizado, as amostras são hibridizadas por 15 min e&gt; 20 slides podem ser processados ​​simultaneamente. Se um forno rotativo de hibridização de estilo, como o instrumento Bambino (Tabela Materiais) é utilizado, slides são colocados em tubos de polipropileno de 50 mL de centrífuga para a hibridização, um slide por tubo. Porque a transferência de calor não é direta, estas amostras são hibridizadas por períodos mais longos (até 30 min). </li><li> Após a hibridização, as lâminas são removidas ea sonda contendo sobreposição de tampão de hibridação é descartado. Slides são então brevemente e gentilmente lavada com tampão de lavagem pré-aquecido por pipetagem de um pequeno volume de tampão sobre uma lâmina inclinada (3 lavagens de 300 mL cada), ou formalmente lavados (até 30 min) ou com uma sobreposição de tampão de lavagem pré-aquecido ou imersão em um tubo de centrífuga de 50 mL de polipropileno contendo tampão de lavagem pré-aquecido. Em nossa experiência, apesar de uma lavagem formais irá proporcionar melhores resultados (menos névoa da sonda não ligada), um simples enxágüe é adequado para a detecção inequívoca de Salmonella spp. Em seguida, as lâminas são secas ao ar antes de passar para a &quot;detecção&quot; passo abaixo. </li><li> Hibridização de amostras miniculture superfície líquida é realizada girando para baixo amostras (recém-fixados ou mantidos em buffer de armazenamento a -20 ° C) por 5 min a 2.000 xg, seguido por vórtex vigoroso da pelota e ressuspensão em 100 mL tampão de hibridação contendo pré-aquecido o coquetel de sonda. As amostras são hibridizadas a 55 ° C por 30 min em um bloco de aquecimento ou da estação de incubação outro material adequado (Tabela de Materiais), seguido pela adição de 500 mL de tampão de lavagem pré-aquecido. Tal como acontece com fita-bound amostras, estas amostras podem ser formalmente lavados por até 30 min de incubação com mais de 55 ° C neste tampão de lavagem, com vórtex intermitente. Alternativamente, as amostras podem ser bem agitadas após a adição de 500 mL de tampão de lavagem pré-aquecido, seguido pela colheita para análise imediata (abaixo). </li><li> Em preparação para a detecção de Salmonella spp. através de citometria de fluxo, as amostras de líquido miniculture superfície são girados para baixo em 2000 xg por 5 min, o sobrenadante é descartado e as amostras são ressuspenso em 300 mL temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Se as amostras necessitam de transporte para uma unidade distante, ou se o atraso é esperado entre hibridização e análises, as amostras podem ser refrigeradas ou mantidos em gelo antes da analise. Alternativamente, as amostras podem ser transferidos para o buffer de células de armazenamento (50:50 mistura de PBS e etanol absoluto) e realizada a -20 ° C por até uma semana sem perdas apreciáveis ​​em sonda-conferidos fluorescência (Bisha e Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Detecção <ol><li> Em fita para a detecção de Salmonella spp. através de microscopia de fluorescência, as amostras de enriquecimento direto-para-fita ou em fase sólida são sobrepostos com ~ 10 mL Vectashield meio H-1200 de montagem contendo a contracoloração nuclear 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), montado com uma lamínula, então incubadas no escuro por 10 min. </li><li> Óleo de imersão é colocada sobre a lamínula, e as amostras são analisadas utilizando objetiva de óleo de alta ampliação (63x ou 100x). O filtro DAPI é usado para levar a amostra em foco, o microscópio é então ligado ao filtro apropriado (verde ou vermelho, dependendo do corante utilizado para acabar com rótulo as sondas) e células de Salmonella são marcados visualmente de acordo com sua fluorescência (Figuras 2 e 3). </li><li> Para a detecção por citometria de amostras miniculture líquido de superfície, vários instrumentos podem ser usados, dependendo da disponibilidade local. Em nosso laboratório, PBS-suspenso amostras são transferidas para tubos de 5 mL rodada final de amostragem (BD Falcon) e examinadas em um citômetro de fluxo FACSCanto com excitação em 647 nm (Tabela de Materiais). Para as amostras enriquecidas com elevado número de bactérias totais, o &quot;baixo caudal&quot; setting (10 min mL -1) é usada e 5,000-50,000 eventos são coletados. Dados são analisados ​​utilizando programa FlowJo (versão 8.8.6, Árvore Star, Inc., Ashland, OR) ou software de análise de outro material adequado (Figura 4, painéis A e B). </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Uso de fita adesiva para amostragem de Salmonella spp. a partir da superfície de um tomate artificialmente contaminados. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Os resultados típicos para direct-to-tape de amostragem e de detecção de FISH de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 a partir da superfície de um tomate (100 objetivo de óleo X). Um cocktail dois sonda de Texas Red sondas marcadas (Sal3/Salm-63) foi usado para rotular essas células. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Microcolônias de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formada na superfície do ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT-4) após um 8 h em fita-enriquecimento a 37 ° C. O inóculo inicial foi amostrado a partir da superfície de um tomate artificialmente contaminados. Em fase sólida de enriquecimento aumenta o número de células disponíveis para a detecção e também melhora o conteúdo rRNA celular. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Uso de fita adesiva para amostragem de S. enterica sorovar Typhimurium da superfície de um tomate artificialmente contaminadas, seguido por análise direta via FISH e citometria de fluxo (painel A) ou após 5 h de enriquecimento miniculture não-seletivo líquido de superfície em uma câmara de perfusão com 500 mL Trypticase Soy Broth (painel B ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Métodos simples e rápido para a detecção de patógenos em superfícies produzem podem ajudar a mitigar doenças transmitidas por alimentos, fornecendo dados em tempo útil e acionável. Adesiva métodos baseados em fita de amostragem têm sido usados ​​em microbiologia ambiental, clínico e alimentar desde a década de 1950 e envolvem pressionando de &quot;Scotch&quot; fita-de estilo para superfícies para remoção de microorganismos, seguido por exame microscópico direto ou transferência de microrganismos ad...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Este protocolo descreve um método simples para adesiva-fita baseada em amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido em fita-hibridização fluorescente in situ (FISH) para detecção independente de cultura rápida de Salmonella spp. Fitas de células carregadas também podem ser colocados face para baixo em ágar seletivo para fase sólida de enriquecimento antes da detecção. Alternativamente, enriquecimentos de baixo volume de líquido (miniculture superfície do líquido) pode ser realizada sobre a superfície da fita em caldo não seletivo, seguido por FISH e análise através de citometria de fluxo. Para começar, fita adesiva estéril é colocada em contato com produtos frescos, uma leve pressão é aplicada, ea fita é removida, fisicamente extrair os micróbios presentes sobre estas superfícies. Fitas adesivas são montados lado-a em lâminas de vidro para microscópio e as células da amostra são fixados com formalina a 10% (30 min) e desidratados, utilizando uma série de etanol classificados (50, 80 e 95%; 3 min cada concentração). Em seguida, células carregadas fitas estão manchadas com tampão contendo uma Salmonella-alvo cocktail sonda de DNA e hibridização por 15 - 30 min a 55 ° C, seguido de uma breve lavagem em uma solução de lavagem para remover sonda não ligada. Aderente, FISH marcado células são então contrastado com o DNA de corante 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e os resultados são visualizados através de microscopia de fluorescência. Para o enriquecimento de fase sólida, célula carregada fitas são colocadas de face para baixo sobre uma superfície adequada agar seletivo e incubado para permitir o crescimento in situ de microcolônias Salmonella, seguido por FISH e microscopia, como descrito acima. Para miniculture superfície do líquido, células carregadas fitas são colocadas lado adesivo para cima e uma câmara de perfusão silicone é aplicado de modo que a fita eo formulário microscópio deslize a parte inferior de uma câmara estanque em que um pequeno volume (mL ≤ 500) de Trypticase Soy caldo (TSB) é introduzido. As portas de entrada estão fechados e as câmaras são incubadas a 35-37 ° C, permitindo o crescimento baseado em amplificação de fita-extraídos micróbios. Após a incubação, portas de entrada são selados, as células são separadas e misturadas com volta vigorosa e para trás pipetagem, colhidas através de centrifugação e fixados em 10% neutro tamponado. Finalmente, as amostras são cruzados e analisados ​​através de citometria de fluxo para revelar a presença de Salmonella spp. Como descrito aqui, o nosso &quot;fita-FISH&quot; abordagem pode fornecer amostragem simples e rápido e detecção de Salmonella em superfícies de tomate. Temos também utilizado esta abordagem para a amostragem de outros tipos de produtos frescos, incluindo espinafre e pimentas jalapeño.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda a<em&gt; Salmonella</em&gt; Usando fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K visualizações.  Colorado State University. Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda a Salmonella Usando fluorescência In situ Hybridization (FISH).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Imunologia e Infecção

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...