Somos gratos a Stephan Schwartz e Gutzen cristã de Biobserve GmbH por patrocinar este artigo e de assistência técnica muito. Agradecemos a Olivia Ochoa, Christian Kaufman, e Zachary Cress de assistência com cuidados de peixe, somos gratos ao governo federal mexicano permissão para coletar os peixes. Somos gratos a Glen Vigus, Frederic Parke, e do Laboratório de Visualização na Texas A &amp; M. Athena Mason e Ryan Easterling assistida na elaboração desta publicação. O financiamento foi fornecido pela Texas A &amp; M University e NSF IOS-1045226.

1. Configuração de hardware e sistema Viewer. O sistema consiste de um tanque de provas ladeado por dois monitores. Uma câmera de vídeo conectada ao sistema Visualizador BIOBSERVE registra o movimento do assunto em tempo real. Dados de movimento é passado para o programa de reprodução de vídeo interativo (IVP) em um servidor separado, o que determina o movimento do estímulo animado na tela. <ol><li> Coloque dois monitores CRT em extremidades opostas de um aquário de 80 l enchidos com água limpa; saída do monitor partida. </li><li> Overhead Coloque a câmera para capturar visão completa do aquário, conectar-se a BIOBSERVE placa de vídeo. </li><li> Configurar o sistema do Visualizador de receber informações de controle da câmera. </li><li> Ativar plug-in para o Visualizador de que envia as coordenadas do focinho do animal, corpo e cauda para servidor de animação em tempo real através de um endereço especificado de rede IP. </li><li> Ligue servidor animação. </li></ol> 2. Calibração. <ol><li> No servidor de animação, abra InteractiveDisplaySetup.txt. Digite largura e altura da tela em pixels em &quot;Informações Monitor&quot;. Em &quot;ProgramType&quot; enter &quot;calibragem&quot;. Salve as alterações para o arquivo. </li><li> Dê um duplo clique no ícone do programa para IVP início do programa. </li><li> Entre em extensões das dimensões do tanque como configurar no sistema do Visualizador no passo 2.3. Isto irá assegurar a correspondência entre os dados Viewer e saída interativa da IVP. </li><li> Desde os fins dos tanques de peixes são menores do que os monitores, o software permite ao usuário usar o teclado (a e s para a largura, z e x para a altura, e as teclas de seta para a posição) para mover a área de visualização (viewport) da estímulos para se alinhar com as extremidades do tanque de provas. Visualizada no servidor de animação, o viewport rosa é ecoada em um monitor de teste ea janela azul do outro (figura 1). </li><li> Use Z e X do teclado para escalar a exibição dos peixes machos em ambas as viewports até que corresponde ao tamanho do estímulo desejado. </li><li> Mover as caixas exibida para que eles se alinham para as bordas do tanque de teste. O usuário usa as teclas Q ou W para mover as caixas de direção ou para longe do centro do peixe. </li><li> Inserir informações experimento, quando solicitado pelo programa. O usuário tem a opção de escolher entre os modelos pré-carregados (em nossa demonstração, cortejando machos Xiphophorus birchmanni, X. Malinche). O usuário também especifica o comportamento de cada peixe em cada etapa (não interativo ou interativas), o lado e estágio em que cada estímulo irá aparecer, e no tamanho desejado (tamanho padrão) de cada estímulo. </li><li> A próxima pergunta pergunta se o usuário quer os movimentos de peixes a ser espelhado, ou seja, que o movimento do modelo de cada lado do aquário será exatamente o mesmo. Isso só é usado quando os peixes estão tanto em modo de animação. As últimas perguntas dizem respeito ao movimento da nadadeira dorsal. O usuário pode selecionar dorsal padrão, o que tornaria o dorsal apenas levantar durante uma exibição de corte lateral. Se o dorsal não está definido como padrão, o usuário pode decidir se o modelo levanta sua nadadeira dorsal acordo com a distância do assunto a partir do monitor. </li></ol> 3.Starting IVP para companheiro de escolha-teste. <ol><li> InteractiveDisplaySetup.txt aberto e definir &quot;ProgramType&quot; para liveTesting e defina &#39;experimentName&#39; para o mesmo nome de arquivo que contém os dados da experiência. </li><li> Delicadamente, coloque os peixes no aquário assunto e esperar 10 min. </li><li> Inicie o Visualizador de 2,0 eo IVP. </li></ol> 4. Companheiro de escolha ao julgamento. A seqüência geral experimental segue estudos anteriores usando estímulos não-interativas de vídeo 1-4. As fêmeas são apresentados com dois estímulos diferentes em monitores em extremidades opostas de um aquário de testes. Comportamento feminino é monitorado em tempo real pelo sistema Visualizador Biobserve. O ensaio de resposta é a associação do tempo, a quantidade de tempo que uma mulher gasta dentro de 10 cm de um monitor ou de outro. Tempo de associação é calculado automaticamente pelo Viewer. <ol><li> Os estímulos de vídeo são exibidos para pessoas num ensaio que consiste em dois, 20 minutos-estágios. Um estágio é composto por quatro segmentos de cinco minutos: <ol><li> O primeiro segmento aclimata a fêmea para o tanque de teste durante cinco minutos, exibindo uma tela monocromática em ambos os monitores. </li><li> No segundo segmento, dois estímulos diferentes de vídeo são exibidas para a fêmea, uma no monitor esquerdo e outro na direita por cinco minutos. </li><li> Imediatamente após a exibição do vídeo estímulos, uma tela monocromática é novamente exibido em ambos os monitores por cinco minutos. </li><li> No segmento de quarto e último, os estímulos do segundo segmento são apresentados, mas a posição de cada estímulo é comutada. Isso proporciona um controle dentro-fêmea de viés lado. </li></ol></li><li> O secestágio ond repete o mesmo padrão, com um conjunto diferente de estímulos simultaneamente apresentadas. </li><li> Ensaios adicionais são executados voltando ao passo 2 e sistematicamente variando lado e ordem de apresentação. </li></ol> 5. Resultados representante. Nós avaliamos a eficácia da reprodução interativo, comparando a resposta feminina a animações interativas e não interativas dos machos cortejando. O estímulo não-interativo realizado um estímulo corte na tela, independente do comportamento feminino, como em estudos anteriores 1-4. O estímulo interativo rastreado a posição horizontal do sexo feminino em toda a tela. A posição de ambos os peixes simulados ou o peixe assunto foi operacionalmente definido como o ponto médio da linha que liga o centróide eo focinho. As três regras que regem o comportamento do sexo masculino foram os seguintes, onde a direção X refere-se ao comprimento do tanque, ea direção Z refere-se à largura do tanque (figura 2): Regra 1: O macho simulado segue sempre o assunto em toda a tela, seguindo-la na direção Z. Regra 2: O macho barbatana dorsal simulado somente é levantado quando se está realizando uma exposição corte lateral. Regra 3: Os peixes swordtail simulado do sexo masculino só vai realizar uma exposição corte lateral para 50% do tempo total que está sendo exibido para o feminino. O visor namoro lateral é desencadeada pelo peixe macho estar dentro de um quarto do comprimento do corpo masculino dos peixes do sexo feminino na direção Z. O visor namoro lateral é independente de quão perto a fêmea é o monitor na direção X. O estímulo interativo acompanhado de perto a posição da mulher em tempo real (figura 3). Trabalho anterior, através de estímulos não-interativas 4,5 mostraram que X. feminino birchmanni fortemente preferida sinais visuais de sua própria espécie. Os estímulos não-interativo criado pelo IVP foram igualmente eficazes em extrair preferências companheiro conspecific (t = 1,923, N = 9, p = 0,046). Quando as fêmeas foram testados em simulação interativa machos da mesma espécie e heterospecific imediatamente antes ou depois, no mesmo julgamento, porém, eles não mostraram uma preferência (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Monitor de instalação para calibração. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Vista esquemática do tanque e configuração do monitor, eixos indicadores utilizados para descrever a posição. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Posição horizontal do exemplar animadas e representativas do sexo feminino ao longo do tempo. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Associação vez (es) de fêmeas com interativo e não interativo e conspecific heterospecific estímulos do sexo masculino. Cada parcela é criado a partir de um registro de cinco minutos da saída de posições pelo protótipo. Nessas parcelas, o tempo avança na direção Y verticais 0-5 minutos. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Representante de dados de tempo de associação e de rastreamento por dois estímulos interativos. Dois segmentos de cinco minutos para duas fêmeas são mostrados.

<ol>
	<li>Fisher, H. S., Mascuch, S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+male+traits+misalign+with+multivariate+female+preferences+in+the+swordtail+fish,+Xiphophorus+birchmanni.">Multivariate male traits misalign with multivariate female preferences in the swordtail fish, Xiphophorus birchmanni.</a> Anim. Behav. 78, 265-269 (2009).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hungry+females+show+stronger+mating+preferences.">Hungry females show stronger mating preferences.</a> Behavioral Ecology. 17, 979-981 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+swordtails+court+with+an+audience+in+mind.">Male swordtails court with an audience in mind.</a> Biology Letters. 3, 5-7 (2007).</li><li>Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+disdain+for+swords+in+a+swordtail+fish.">Female disdain for swords in a swordtail fish.</a> American Naturalist. 167, 136-140 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+chemical+environment+disrupts+communication+in+a+freshwater+fish.">Alteration of the chemical environment disrupts communication in a freshwater fish.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273, 1187-1193 (2006).</li><li>Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+considerations+and+techniques+for+constructing+video+stimuli.">Design considerations and techniques for constructing video stimuli.</a> Acta Ethol. 3, 49-54 (2000).</li><li>Turnell, E. R., Mann, K. D., Rosenthal, G. G., Gerlach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+zebrafish+(Danio+rerio)+analyzed+with+video-stimulus+techniques.">Mate choice in zebrafish (Danio rerio) analyzed with video-stimulus techniques.</a> Biol. Bull. 205, 225-226 (2003).</li><li>Rosenthal, G. G., Ryan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assortative+preferences+for+stripes+in+danios.">Assortative preferences for stripes in danios.</a> Animal Behaviour. 70, 1063-1066 (2005).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocks,+herds+and+schools:+A+distributed+behavioral+model.">Flocks, herds and schools: A distributed behavioral model.</a> , 256 (1985).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steering+Behaviors+For+Autonomous+Characters.">Steering Behaviors For Autonomous Characters.</a> , (1999).</li><li>Hoare, D. J., Couzin, I. D., Godin, J. -. G. J., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+group+size+choice+in+fish.">Context-dependent group size choice in fish.</a> Animal Behaviour. 65, 663-669 (2004).</li><li>Hoare, D. J. &. a. m. p. ;. a. m. p., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+organisation,+shoal+structure+and+information+transfer.">Social organisation, shoal structure and information transfer.</a> Fish and Fisheries. 4, 269-279 (2003).</li></ol>

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinada pela Research Biobserve.

Métodos anteriores para reprodução de vídeo interativo em comportamento animal têm contado com um operador humano para dar respostas aos sinais comportamentais de indivíduos. Com IVP, criamos um programa que aplicada com base em regras em resposta a interatividade em tempo real, dados sobre o comportamento automatizado assunto. Fazemos uma breve descrição das etapas envolvidas na criação do programa abaixo. O primeiro passo foi criar digitais exemplares machos de X. birchmanni e X. Malinche. Nós tomamos uma abordagem semelhante a estudos anteriores 6. Criamos malhas em 3D que são modelados em texturas com base em fotografias de reais X. birchmanni e X. Malinche. Para capturar as texturas realistas do peixe real, as fotografias mesma usada para modelar as formas de peixes foram usados ​​como texturas para os peixes. Um mapa planar aplicado às suas coordenadas UV alinhados no mapa UV com a textura fotografia. Em segundo lugar, a malha de peixe digital deve deformar como um peixe real. Para conseguir isso, um esqueleto virtual foi criado para o corpo e as barbatanas e &quot;pele&quot; para a malha. O processo de esfola permite a malha a ser deformado quando as articulações são rodados. Segundo, nós adicionamos o movimento para o peixe digital. Seis movimentos fundamentais que um peixe macho faz swordtail foram animadas. Três dos movimentos foram usados ​​para representar as diferentes velocidades em que um peixe nadar. Os outros três movimentos foram os peixes restantes ainda, voltando-se, ou exibindo uma tela de namoro lateral. Uma vez que os machos podem aumentar ou diminuir a sua barbatana dorsal de acordo com receptores se macho ou fêmea estão presentes 3, dissociado do movimento da nadadeira dorsal do que da tela namoro lateral. A barbatana dorsal foi introduzido para que pudesse ser levantada ou abaixada em qualquer momento durante o ciclo. Um total de 24 ciclos de animação foram usados. Cada ciclo começou e terminou com o peixe na mesma postura, para que os ciclos de animação poderia facilmente se misturam. Todos os ciclos de 24 a animação foi criado por rotoscopia 7,8 o movimento desejado da sobrecarga de um vídeo ao vivo, cortejando machos X. birchmanni. Em terceiro lugar, habilitado interatividade. Foi utilizado o sistema Visualizador Biobserve para acompanhar em tempo real a posição do focinho, corpo e cauda do swordtail feminino e transmitir essa informação em tempo real para o programa de IVP. Isto foi feito separadamente para cada macho cortejando em cada monitor. A animação do sexo masculino seguiu a posição do peixe sujeito. Nós modelamos a seguir usando Reynolds chegou comportamento da direcção 9,10, o que permitiu o homem a seguir a mulher e desacelerar medida que se aproxima da fêmea. Para calcular a posição do peixe swordtail masculino em cada passo de tempo, o sistema foi fornecido com a posição atual da mulher, que permitiu que o programa para calcular as forças que impulsionam o macho. Primeiro, o vetor alvo-offset foi calculado subtraindo-se a posição dos peixes machos a partir da posição do peixe fêmea. Distância o segundo do peixe macho para os peixes fêmeas foi determinado tendo a magnitude do vetor-alvo offset. Terceiro, a velocidade desejada do peixe macho foi determinada pela divisão da distância por um valor de desaceleração constante. Isto permitiu que os peixes machos para abrandar quando se aproximava o peixe do sexo feminino. Passado, a aceleração desejada foi calculado subtraindo-se a velocidade da corrente do macho da velocidade desejada. Desde animações são renderizadas como frames de vídeo discreta em 60 Hz, os cálculos foram feitos para cada passo de tempo discretos, em intervalos de 0,016 segundos. Máxima velocidade foi definida com um valor de 10 cm / s para estas experiências. Se a magnitude da velocidade de novo foi maior do que a velocidade máxima, a velocidade foi definido para o máximo. Para esta simulação particular, o peixe interativo do sexo masculino aumentou a sua barbatana dorsal 50% do tempo, e apenas durante as interações namoro. O comportamento de exibição laterais namoro foi acionado sempre que o estímulo do sexo masculino foi 0,25 dentro de comprimentos corpo do peixe swordtail feminino na dimensão Z. Ficamos surpresos que a interatividade aboliu a preferência feminina por membros da mesma espécie, apesar do fato de que as animações não-interativas provocou uma forte preferência e dado que as fêmeas passaram a maior parte do tempo associar-se com os estímulos interativos. Uma possibilidade é que a seguir atentamente a fêmea pode substituir sinais visuais usados ​​para avaliar os homens, como a espada ea nadadeira dorsal. Alternativamente, as fêmeas podem ser menos propensos a perder o interesse em um macho cortejando e, portanto, menos propensos a amostra de indivíduos (figura 5). No entanto, nossos resultados mostram que o princípio de funcionamento de vídeo-game ou seja, tecnologia, software-driven, baseado em regras agentes responder à entrada do usuário pode ser aplicado com sucesso a reprodução interativos em estudos decomportamento animal. Este tipo de reprodução baseado em regras interativa deve ser útil para estudos de movimento empolamento e coletiva 11,12. Em particular, a capacidade de manipular as regras que um exemplar virtual usa para empolamento deveria nos dar insights sobre os processos que os animais usam para tomar decisões empolamento.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Maya 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C# program using Microsoft&#x2019;s XNA Game Studio 2.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BIOBSERVE Viewer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell 15&#x201D; CRT monitor (2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 X 20 X 80 cm Plexiglas testing aquarium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell Latitude computer (animation server)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated interactive video playback for studies of animal communication

Reprodução de vídeo é uma técnica amplamente utilizada para a manipulação controlada e apresentação de sinais visuais na comunicação animal. Em particular, o parâmetro baseado em animação por computador oferece a oportunidade de manipular de forma independente de qualquer número de características comportamentais, morfológicas, ou espectrais no contexto dos realistas, imagens em movimento de animais na tela. Uma das principais limitações da reprodução convencional, porém, é que o estímulo visual não tem a capacidade de interagir com o animal vivo. Empréstimo de video-game tecnologia, criamos um sistema automatizado interativa para reprodução de vídeo que controla animações em resposta a sinais em tempo real a partir de um sistema de monitoramento de vídeo. Nós demonstramos este método através da realização de ensaios companheiro de escolha de peixes swordtail feminino, Xiphophorus birchmanni. Fêmeas receberam uma escolha simultânea entre um macho cortejando conspecific e um macho cortejando heterospecific (X. Malinche) em lados opostos de um aquário. O estímulo virtuais do sexo masculino foi programado para seguir a posição horizontal do sexo feminino, como os machos cortejando fazer em estado selvagem. Companheiro de escolha de ensaios sobre selvagens capturados X. birchmanni fêmeas foram utilizados para validar a capacidade do protótipo para efetivamente gerar um estímulo visual realista.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication at JoVE.com

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Reprodução de vídeo é uma técnica amplamente utilizada em comportamento animal. Criamos e avaliou um programa que se aplica com base em regras de reprodução, interativo 3-D de animações de computador em resposta a tempo real, dados sobre o comportamento automatizado assunto.

Reprodução de vídeo automatizada interativo para estudos da comunicação animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

automated-interactive-video-playback-for-studies-animal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K visualizações.  Texas A&M University (TAMU). Reprodução de vídeo é uma técnica amplamente utilizada em comportamento animal. Criamos e avaliou um programa que se aplica com base em regras de reprodução, interativo 3-D de animações de computador em resposta a tempo real, dados sobre o comportamento automatizado assunto.

Vídeo: Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Neurociência

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Cirurgia estereotáxica de roedores e animais Melhorias Resultado do Bem-Estar de Neurociência Comportamental

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Fixação de Perfusão todo animal para Roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment and Communication for People with Disorders of Consciousness

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the level of consciousness of people unable to provide motor response and, in a second stage, establishing a communication channel for these people that enables them to answer questions with either &#39;yes&#39; or &#39;no&#39;. The suite of paradigms is designed to test basic responses in the first step and to continue to more comprehensive tasks if the first tests are successful. The latter tasks require more cognitive functions, but they could provide communication, which is not possible with the basic tests. All assessment tests produce accuracy plots that show whether the algorithms were able to detect the patient&#39;s brain&#39;s response to the given tasks. If the accuracy level is beyond the significance level, we assume that the subject understood the task and was able to follow the sequence of commands presented via earphones to the subject. The tasks require users to concentrate on certain stimuli or to imagine moving either the left or right hand. All tasks are designed around the assumption that the user is unable to use the visual modality, and thus, all stimuli presented to the user (including instructions, cues, and feedback) are auditory or tactile.

With this experiment, one might be able to detect consciousness in people with disorders of consciousness. Furthermore, the approach can create a simple communication channel that enables people to give simple YES/NO answers to questions.

Avaliação e Comunicação para Pessoas com Distúrbios da Consciência

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...