O peixe-caverna está criando como um fantástico mural animal para entender a evolução e os processos biomédicos. Estamos agora conduzindo a investigação biomédica usando esse traço como paralelo de um sintoma humano. Aqui mostraremos a bateria do ensaio de comportamentos e o sistema de análise que podem ser utilizados tanto para estudos evolutivos quanto biomédicos.
Para avaliar as vibrações e o comportamento, uma haste de vidro vibrante é inserida em uma tigela de vidro contendo um peixe no escuro. Os peixes são aclimatados quatro dias antes do ensaio em água condicionada com um ciclo escuro de 12, 12. No dia anterior ao dia do ensaio após três dias de aclimatação, substitua a água na câmara de ensaio por água fresca e condicionada.
No dia do ensaio, os peixes são privados de alimentos até que o ensaio seja concluído, pois a cessação mudará sua resposta às vibrações. Prepare o aparelho emissor de vibração sintonizando 40 Hertz. Defina os parâmetros de gravação adequados, as condições de estoque e o arquivo de destino.
Coloque o cilindro de ensaio no estágio de gravação, iluminado com luz de fundo infravermelha em uma sala escura, e deixe os peixes se aclimatarem por três minutos após serem colocados no palco. Após a aclimatação de três minutos no escuro, grave 3 minutos e 30 segundos de vídeo. No início da gravação, insira a haste de vidro vibrante de 7,5 milímetros de diâmetro na coluna de água, com aproximadamente 5 centímetros de profundidade.
Evite fazer qualquer ruído ou vibrações ao posicionar a haste de vidro vibrante na água, pois os peixes podem sentir pequenos ruídos e vibrações. Certifique-se de terminar este procedimento dentro de 30 segundos após iniciar a gravação de vídeo para garantir que mais de três minutos de comportamento sejam gravados. Execute o arquivo em lote clicando duas vezes avs_creator.
bastão para converter o vídeo AVI comprimido em formato legível para ImageJ. A macro pode ser carregada simplesmente arrastando e soltando em uma concha de interface de usuário gráfica. Esta macro permitirá certas teclas de ajuste para a análise a seguir.
No diretório de trabalho, crie uma nova pasta e nomeie-a Process_ImageJ. Esta pasta será usada automaticamente para armazenar arquivos de saída a partir da análise a seguir. Clique com o botão direito do mouse no arquivo de vídeo AVS a ser analisado e selecione a montagem rápida.
Depois que o arquivo AVS for montado como uma unidade externa, abra o arquivo AVI no ImageJ. Para definir a escala da medição da distância, selecione o diâmetro da câmara de ensaio desenhando uma linha reta através da câmara usando a ferramenta de seleção de linha reta e, em seguida, defina a escala clicando em analisar, definir a função de escala. Para o nosso caso, inserimos 9,4 centímetros.
Verifique a caixa de rádio da global para padronizar a escala em todas as análises de vídeo a seguir. Copie a área da câmara de ensaio usando a ferramenta de seleção oval e, em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione duplicata de imagem. Neste momento, especifique a gama de quadros a serem atualizados para análise suplementar.
Limpe fora da câmara de ensaio e converta a imagem em uma imagem binária acertando o hotkey sete na barra de números. Após o ajuste de fundo, você será solicitado a adicionar um ponto preto no centro para indicar a posição da haste de vidro vibratória usando a ferramenta de seleção oval já definida como preta com a função de preenchimento. Clique em OK e a macro solicitará que você passe para o ajuste de limiar.
Ajuste o limiar para que o peixe seja capaz de ser visto durante todo o clipe de vídeo e selecione aplicar. Execute o plug-in do Tracker acertando a tecla hotkey oito na barra de números. Ajuste o tamanho mínimo do pixel para 100, quando solicitado.
Este processo irá gerar a distância entre a haste de vidro vibrante e o peixe por quadro durante todos os três minutos do vídeo binário. Para salvar o arquivo do rastreador, acerte a tecla 9 na barra de números. Isso exportará automaticamente uma pilha binária de imagens de todo o vídeo e um arquivo XLS com coordenadas e dados de distância, caso seja necessário reanalisar.
Isso também fechará todos os arquivos associados ao vídeo atual. Os arquivos gerados agora podem ser analisados dependendo da questão específica da pesquisa. Aclimate cinco peixes experimentais por quatro dias ou mais em cada câmara de um desenho personalizado de 10 litros de aquário de gravação acrílica cheio de água condicionada.
Cada câmara individual é separada com placa de acrílico preto. Cada tanque deve ser coberto para evitar que os peixes pulem em outra câmara. Ajuste o temporizador de energia programável para ligar automaticamente a luz LED branca durante 12 horas e desligar durante 12 horas todos os dias durante o período de aclimatação.
Isso vai entrar no ritmo circadiano do peixe se o peixe for suscetível à entrada. Para fornecer uma luz branca mais difusa, usamos uma placa acrílica branca plana de dimensão semelhante ao tanque de 10 litros como difusor para passar luz para cada tanque. Durante esse período, forneça uma vez por dia a alimentação com camarão salgado vivo e forneça aeração através do filtro de esponja em cada aquário.
Note, certifique-se de que os peixes são alimentados em momentos consistentes. Por exemplo, uma vez por dia pela manhã. No dia anterior ao dia do ensaio, três dias ou mais da aclimatação, substitua a água na câmara de ensaio por água fresca e condicionada.
Defina a gravação dos parâmetros no software VirtualDub. O vídeo será gravado em 15 quadros por segundo no tempo de exposição fixa. O vídeo é comprimido em codec X264VFW para alcançar aproximadamente 700 vezes a compressão.
No dia da gravação, alimente cada peixe com camarão de salmoura vivo. Remova todo o filtro de esponja e comece a gravar. Acenda a luz infravermelha na fase de gravação.
Observando a imagem ao vivo do VirtualDub na tela, ajuste a posição de cada aquário para garantir que eles enfrentem a câmera USB corretamente. Comece a gravação 24 horas pela manhã. Por exemplo, a hora de início é 9.m.
e o tempo de término é de 9 a.m no dia seguinte. Comece a capturar o vídeo e proteja o local para evitar distúrbios.
Ocasionalmente verifique se a gravação está sendo gravada. Após 24 horas de gravação, certifique-se de que o vídeo foi salvo corretamente. Transfira o vídeo para a estação de trabalho do PC para acompanhar o comportamento do peixe.
Depois de transferir o vídeo para a pasta apropriada, faça rapidamente uma verificação de qualidade do vídeo para garantir que ele seja de boa qualidade. Isso inclui olhar para a iluminação, verificar se há um peixe em cada seção, e se há algum movimento estrangeiro que pode causar erro de rastreamento. A partir daqui, o Freeware SwisTrack é usado para rastreamento de animais.
A vantagem deste software é que o software pode rastrear vários animais ao mesmo tempo e subtrair a imagem de fundo usando um quadro arbitrário que identificamos. As desvantagens são que o rastreamento pode saltar entre arenas contendo um peixe diferente. A imagem de fundo pode não ser adequada para os quadros posteriores, e o SwisTrack atribui aleatoriamente o rastreamento de ID a peixes individuais, portanto é necessário recuperar a ID do peixe, traçando a posição física média de cada peixe.
Para superar essas questões, três abordagens são utilizadas. O uso de máscaras binárias, uma para o rastreamento de arenas numeradas uniformes, e uma para o rastreamento de arenas numeradas ímpares. O uso da automação Win para atualizar automaticamente imagens de fundo a cada três minutos e o uso de scripts Perl para reconstruir as IDs de peixe.
O primeiro passo da análise é fazer as máscaras binárias para arenas estranhas e até mesmo. Depois de verificar a qualidade do vídeo, escolha um quadro representativo em um software de edição de vídeo e use-o para criar duas máscaras binárias, uma para uniforme e outra para arenas numeradas ímpares. O objetivo dessas máscaras binárias é evitar erros entre arenas adjacentes.
Depois de fazer máscaras binárias, abra os arquivos do parâmetro SwisTrack que determina os caminhos e parâmetros do arquivo para o processo de rastreamento. Prepare um arquivo de parâmetro em cada uma das pastas de arquivo uniformes e ímpares para o rastreamento de vídeo. Neste arquivo, digite o caminho para os locais de arquivo dos arquivos de vídeo e máscara.
Depois de preparar os arquivos do parâmetro, abra o arquivo executável Win-automation que redefine automaticamente o plano de fundo a cada três minutos. Com este arquivo executável, o SwisTrack será executado automaticamente e, em seguida, abrirá o arquivo de parâmetro em cada pasta uniforme ou ímpar neste software de rastreamento. Execute o software de rastreamento para rastrear o movimento dos peixes.
Dentro dos primeiros 9.000 quadros de rastreamento, certifique-se de que os peixes estão sendo devidamente rastreados olhando para o componente de rastreamento do vizinho mais próximo. Depois de estabelecer adequadamente o rastreamento, retorne à guia de componentes de subtração de fundo adaptativo e aperte o hotkey R no teclado para executar a win-automation para subtração contínua de fundo adaptável. Após cerca de cinco horas, arquivos de texto são gerados para cada peixe, contendo coordenadas X e Y para cada quadro do vídeo.
Para continuar a análise, aloque os três arquivos de script Perl para a pasta que inclui pastas uniformes e ímpares. Para converter o comprimento em pixels em centímetros, é necessário conhecer a proporção centímetro/pixel. Digite essa razão na localização apropriada do arquivo de script Perl chamado 1.fillupGaps.pl.
Executar 1.fillupGaps. pl Perl script usando um emulador Unix para Windows. Primeiro, use o comando CD para passar para o diretório de trabalho atual e, em seguida, digite Perl 1.fillupGaps.
pl para executar o script Perl. Os outros dois scripts serão automaticamente chamados em ordem sequencial. Esses três scripts atribuem cada arquivo de rastreamento a cada seção do aquário e, portanto, podem ser usados para analisar o comportamento de cada peixe.
Consulte o arquivo de texto chamado Summary_Sleep que é gerado após a execução dos scripts para verificar se o número de quadros retirados da análise é aceitávelmente baixo. Perder menos de 15% dos quadros é considerado aceitável. Copiar e colar dados de rastreamento em um arquivo de planilha com uma macro interna.
Essa macro reestruturará os dados analisados em vários níveis de processo de etapa, como a duração média do sono e a soma da distância de natação. Para manchar a linha lateral dos peixes, dissolva a solução de estoque DASPEI em água condicionada para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro, em seguida, imerja o peixe na solução em temperatura ambiente em um ambiente escuro por 45 minutos. Após 45 minutos, recupere o peixe da solução DASPEI e mergulhe-o em água gelada e condicionada com MES triplo dois.
Uma vez que o peixe é profundamente anestesiado, monte o peixe em uma placa de Petri e observe-o sob microscópio eficiente. Certifique-se de fazer uma série estatística para incluir todos os planos do peixe em foco e compilar tudo em uma única imagem. Para análise de imagem, adicione uma nova pasta intitulada Process_ImageJ e o arquivo macro à pasta contendo as imagens a serem analisadas.
Abra o software ImageJ e, em seguida, abra a macro arrastando o arquivo macro para ImageJ. Execute macro clicando em macros, execute macro. Se a imagem não abrir automaticamente, clique em macro, escolha o arquivo.
Macro, então, pegará automaticamente um arquivo de imagem para analisar. Para quantificação neuromast mostra a região de interesse clicando no polígono dois, e desenha a área na imagem. Oito, cinco para duplicar a região de interesse.
Use a ferramenta de tinta para remover ou adicionar qualquer ponto que esteja extra ou faltando da imagem anterior e, em seguida, oito, seis. Uma vez que você oito, seis, duas novas janelas aparecerão. Uma janela mostrando um esquema de pontos neuromases numerados e uma janela com uma mesa com neuromas total quantificado.
Acerte sete para salvar ambos os arquivos. Uma vez que você clique em OK, esses arquivos são armazenados e um novo arquivo de imagem será aberto para análise suplementar. Consolide a contagem de neuromas correndo macro.
Os seguintes resultados são resultados representativos do que se pode esperar para ambas as morfinas de peixes em condições controladas. Esses quatro números mostram resultados representativos de ensaios de comportamento de atração de vibração. A e B são as principais vistas do caminho de natação de A, um peixe superficial, e B um peixe-caverna.
Linhas vermelhas são os traços das coordenadas geradas pelo rastreamento ImageJ ao longo de três minutos de gravação. C e D mostram uma comparação dos resultados de C, um peixe superficial, e D, um peixe-caverna, extraído pela macro de planilha dos arquivos TXT. O eixo Y é o número contado de vezes que o peixe se aproximou da haste vibratória.
Cada ponto representa uma observação experimental durante o ensaio comportamental de um peixe. Note que os peixes superficiais não mostram um aumento nas abordagens em qualquer frequência, enquanto os peixes-caverna apresentam um máximo de atração em torno de 35 a 40 Hertz. Esses dois números mostram resultados representativos de ensaios de comportamento do sono extraídos pelas macros de planilha dos arquivos TXT.
A e B demonstram duas das métricas resumidas automaticamente pelo arquivo macro. A Figura A mostra a distância de natação durante o dia e a noite para peixes superficiais e peixes-caverna, enquanto B mostra a duração do sono para ambas as morfinas. Neste caso, os peixes-caverna apresentaram hiperatividade e menos sono quando comparados aos peixes superficiais.
Esses números mostram resultados da análise de imagem DASPEI extraídos pela macro de planilha dos arquivos TXT. A e B demonstram a relação entre o número neuromasto versus o comportamento de atração de vibração e o tamanho do neuromasto versus o comportamento em peixes-caverna, peixes superficiais e descendentes de F1. Cada ponto representa cada peixe.
Note que o número do neuromas está positivamente correlacionado com o comportamento de atração de vibração, sugerindo que o neuromast pode regular esse comportamento. O tamanho do neuromas também suporta essa conclusão. C e D são imagens exemplos de dasPEI manchado neuromast de C, um peixe superficial, e D, um peixe-caverna.
Cada ponto fluorescente nas imagens é um neuromasto, que tomou as DASPEI. Note, a abundância notavelmente maior de neuromass em peixes-caverna. Mostramos uma série de análises de comportamento para atividade de natação de comportamento de linha lateral e sono.
O sistema de rastreamento animal também pode ser adaptado a outros comportamentos, como comportamentos repetitivos estereotipados, interações sociais e lateralidade comportamental.
