Os autores agradecem ao Dr. James Bamburg e membros de seu laboratório para a colaboração nestes estudos. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH HD19950, EY07133 e por concessões do Minnesota Medical Foundation.

Para rodamina-actina rotulagem, os neurônios são cultivadas em lamínulas colocado no fundo de 35 pratos de plástico mm, ou em lamelas coladas em &quot;video&quot; pratos. 1. Preparação de Lamelas ou &quot;Vídeo&quot; Pratos <ol><li> Muitos tipos de neurônios são mal adesivo in vitro substratos. Lamínulas de vidro, que são necessários para este procedimento, podem não permitir a adesão neurônio-substrato suficiente a menos que sejam adequadamente limpo e preparado. Um procedimento detalhado para o ácido da lavagem e limpeza lamínulas de vidro é descrito no livro a cultura de células nervosas, editado por Banker e Goslin. Alternativamente, um revestimento de nitrocelulose para lamínulas, que avidamente se liga as moléculas de substrato, é descrito nos passos 1.7 e 1.8 abaixo. </li><li> Lamínulas de vidro (por exemplo, 18 mm ou 24 praças círculos mm) são lavados em dH 2 O e cozido em calor seco (≥ 225 ° C) o maior tempo possível (mínimo de vários dias até três meses ou mais) para remover traços de orgânicos compostos. Vá para o passo 1.6 ou para pratos de vídeo proceder a 1,3. </li><li> Para criar um substrato de vidro fina e clara para videomicroscopia de alta resolução, orifícios circulares de diâmetro adequado são perfurados no fundo dos 35 ou 50 Petri de plástico mm ou placas de cultura de tecido usando uma broca elétrica de cortiça (ou instrumento similar). Perfuração é feita lentamente, com uma leve pressão para evitar a quebra do plástico. Bordas do buraco perfurado são raspadas com uma tesoura para criar uma superfície lisa em ambos os lados. </li><li> Lamínulas de vidro são limpos para o uso de cultura de tecidos, como descrito em 1.1 ou 1.2. Lamínulas são colados no local sobre os buracos, usando non-toxic cimento aquário silicone (para lamínulas 18x18mm, um pouco 12mm de diâmetro é usado). O cimento é curado por 24 horas. </li><li> (Os passos seguintes são feitos usando condições estéreis) Os pratos são lavados video 3 vezes com dH 2 O estéril e permitiu secar ao ar. </li><li> Lamínulas são revestidos com moléculas de substrato para a cultura neuronal. Em primeiro lugar, a superfície é revestida com lamínula (250 mL de 18x18 lamela) uma solução de 100 mg / mL poli-D-lisina em PBS por 4-8 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora. Lamínulas são então enxaguadas 3 vezes com dH 2 O estéril para remover unbound poli-D-lisina e secas ao ar. Muitos tipos de neurônios são cultivadas em lamínulas revestidas com poli-D-lisina sozinho, se as proteínas do soro estão incluídos no meio de cultura. No entanto, os resultados mais relevantes para as condições in vivo são obtidos usando moléculas de substrato natural. Soluções destas moléculas, tais como laminina, fibronectina ou CAM L1 (1-20 mcg / mL em PBS), podem ser diretamente aplicadas a poli-D-lisina lamínulas revestido por 4-8 horas ou durante a noite, mas no nosso laboratório, rotineiramente revestimento do lamínulas preparadas com uma fina película de nitrocelulose antes de aplicar moléculas de adesão celular para aumentar a proteína-substrato de ligação. </li><li> Faça uma solução de nitrocelulose 1% dissolvendo 5 g de nitrocelulose em 5 mL de 100% acetato de amila. Aplicar 10 mL desta solução para as lamelas e delicadamente espalhe sobre a superfície. Ar seco de 10 minutos. </li><li> Aplicar 250 L de uma solução de 25 mg / mL laminina ou 4 mg / mL L1 CAM em PBS e espalhar sobre a superfície de nitrocelulose. Incubar 4 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora, substrato aspirado e imediatamente adicionar meio de cultura, de modo que o substrato não seque. </li></ol> 2. Preparação das Culturas Neuronal <ol><li> Embrionárias dia 7 embriões de galinha são removidos a partir de ovos, e colocado em 100 milímetros pratos petri contendo meio de cultura com soro de 10% para dissecção para remover os órgãos internos do tórax e abdome, utilizando um estereomicroscópio. </li><li> Os embriões são então enxaguadas com o meio e se mudou para um prato de 60 milímetros com meio líquido e posteriormente dissecadas para retirada e preparar explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) ou tecidos neurais da retina. Uma descrição detalhada dissecação pode ser encontrado em Métodos em Biologia Celular, volume 71, Neurônios: Métodos e Aplicações para a biologia celular, editado por Hollenbeck e Bamburg. Explantes DRG são gânglios 1/2-whole e neural explantes da retina são de 1 mm ou menos de diâmetro. </li><li> Após a limpeza dos explantes de tecidos estranhos, explantes individuais são movidos com uma pinça para relojoeiros as lamelas, que já estão em placas de cultura com o meio de cultura. Sob um microscópio de dissecação, o explante é delicadamente pressionado para o centro da lamela com uma pinça para evitar a movimentação durante o transporte para a incubadora. Explantes são cultivados em meio com B27 F12 aditivos, tamponado com HEPES 10 mM de pH 7,4 e colocado durante a noite em um umidificado 38 ° C incubadora. Fatores de crescimento podem ser adicionados, conforme necessário, para o meio de cultura. Neurotrofinas são muitas vezes adicionados aos DRG culturas a partir de embriões mais velhos, embora E7 neurônios DRG vai estender axônios a partir de explantes sem neurotrofinas acrescentou. Explantes de retina neural estender axônios neste meio de cultura semdding fatores de crescimento. </li><li> Culturas são incubadas por pelo menos 18 horas para permitir crescimento axonal suficiente antes de começar o procedimento abaixo. </li></ol> 3. Preparação de Rodamina actina-Buffer permeabilização <ol><li> A solução estoque de tampão contendo 138 mM permeabilização KCl, 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, e BSA 1% (pH = 6.9) pode ser mantida até 2 semanas a 4 ° C11. Imediatamente antes da utilização, os seguintes componentes são adicionados para uma concentração final de: saponina 0,025%, 0,1 mM de ATP, e 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin. </li><li> Uma solução separada também é preparada imediatamente antes da utilização com estes mesmos componentes, mais 0,45 rodamina actina muscular não-A solução é alternadamente agitadas e tritrated por 5 minutos para dissolver rodamina actina-aglomerados, e é agitadas durante 1 min durante a etapa de permeabilização inicial para evitar a polimerização no tubo. Se, apesar disso, a montagem de filamento do tubo continua sendo um problema, a solução pode ser centrifugadas antes do uso. </li></ol> 4. Permeabilização das Culturas Neuronal e Incorporação de Rodamina-actina em F-actina Termina farpado <ol><li> A placa de cultura com explantes DRG ou da retina é cuidadosamente removida da incubadora e os passos seguintes são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Todas as alterações das soluções deve ser feito com cuidado. A ponta da pipeta deve ser colocada na borda da lamínula, e as soluções devem ser removidos e adicionados lentamente e com pouca força. </li><li> O meio de cultura é removido com uma pipeta com cuidado, mas firmemente, e buffer de permeabilização suficiente para cobrir as células é adicionado para 1 min (para lamela x 18mm 18mm, ~ 60 mL). A cultura não é lavado com outras soluções antes de adicionar o buffer de permeabilização, e as lamelas não é permitida para secar antes de adicionar o buffer de permeabilização. </li><li> O buffer de permeabilização é gentilmente removido com uma pipeta e substituído pelo tampão contendo 0,45 mM permeabilização rodamina actina não-músculo por 4 min. </li><li> A rodamina-actina contendo tampão é gentilmente removido com uma pipeta, e os neurônios são fixadas pela adição de uma solução de paraformaldeído a 4% (qualidade laboratorial, feito com tampão fosfato, pH 7,3), glutaraldeído 0,05% e sacarose 10%. Após a fixação cinco minutos as lamelas são delicadamente lavados com PBS e montadas em Slowfade em lâminas de vidro de 3 polegadas. </li><li> Uma abordagem alternativa para soluções de mudança é a utilização de uma célula de fluxo. Esta pode ser uma célula de fluxo disponíveis comercialmente, ou uma célula de fluxo simples pode ser feita colocando pequenos pedaços de plástico (≤ 1 mm de espessura) como espaçadores nos cantos da lamínula, e então montar uma lamínula de mesmo tamanho na parte superior da lamela. Soluções podem ser trocados por colocar a pipeta em um dos lados da célula de fluxo e retirada soluções com um pavio (algodão ou um Kimwipe) no outro lado. </li><li> A incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado e fluorescente-phalloidin rotulagem de F-actina em cones de crescimento é visualizado com epi-fluorescência óptica através de um objetivo 60X óleo de imersão, e as imagens são coletados, usando uma câmera CCD refrigerado. Um microscópio confocal pode fornecer imagens melhoradas. </li><li> Para melhor quantificação da rodamina-actina incorporação de todas as imagens devem ser recolhidos em uma única sessão, usando o mesmo ganho e as configurações de exposição da sensibilidade da câmera digital para cada imagem. Análise de rotulagem deve ser feita a partir de regiões equivalentes de cada imagem; Metamorph, Image J ou similar ferramentas informatizadas para análise de imagens pode ser usado. </li></ol> Variações deste PROCEDIMENTO 5. Uma variação: Colete Imagens Live Cell Antes de Rodamina actina-Labeling <ol><li> Pratos de vídeo são colocadas em um estágio do microscópio aquecida, e as imagens ao vivo cone de crescimento são coletados. Lamínulas em grade pode ser usado, ou gravuras e / ou marcas de caneta na lamela pode ser feita para encontrar mais facilmente células específicas após a rotulagem ou o prato de vídeo pode ser fixado no lugar no estágio do microscópio para a duração do procedimento. </li><li> Incorporação permeabilização, de rodamina-actina, e fixação de células são conduzidas no prato de vídeo, dentro ou fora do palco microscópio. Após a fixação, PBS é adicionado a pratos de vídeo para imagens imediatas. Para preservar a amostra para imagens mais tarde, slowfade meio de montagem é adicionado à lamela e uma lamela de igual tamanho é suavemente colocado em cima (evitar bolhas), e as bordas são seladas com unhas polonês claro. </li></ol> 6. Variação dois: Imunoquímica de Proteínas Co-label adicionais <ol><li> Rodamina actina-incorporação e fixação pode ser realizada em neurônios cultivados em lamelas ou em pratos de vídeo, como descrito acima (4,2-4,4). </li><li> Após a fixação e lavagem em PBS, as células são tratados 15 min com 0,1 M de glicina em PBS e, em seguida, extraída com 0,1% Triton X-100 (TX-100) em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h. Lamínulassão incubadas com os anticorpos primários diluídos em PBS contendo BSA 1% durante 1 h. As lamelas são então lavados e incubados em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h, antes de aplicar fluorescentes anticorpos secundários na diluição 1:1000 em PBS com BSA 1% durante 1 h. Após a lavagem, as lamelas são novamente incubadas em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% por 30 min, lavadas, e montados em anti-fading médio. A localização de algumas proteínas é interrompida pela etapa inicial permeabilização (4.3). Para manter estas proteínas para localização com anticorpos, paraformaldeído e glutaraldeído 0,05% 0,05% pode ser adicionado ao buffer permeabilização por 1 min (isto é, antes de adicionar o rodamina-actina) sem afetar a rotulagem final farpado por rodamina-actina. </li><li> Imagens de cones de crescimento triple-rotulados são recolhidos por microscopia de fluorescência confocal ou. </li></ol> 7. Variação Três: Avaliação dos Efeitos da Cues Orientação sobre extremidades livres F-actina farpado <ol><li> Um fator de crescimento ou sugestão orientação é adicionado a placas de cultura na incubadora, em concentrações de vários ng / mL por alguns minutos (ou um tempo de tratamento apropriado) antes de retirar o prato da incubadora e iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos de curto prazo de fatores de crescimento ou pistas de orientação sobre extremidades livres F-actina farpado. </li><li> Um prato de vídeo com as culturas de neurônios pode ser colocado em um estágio do microscópio aquecida, e fatores de crescimento ou pistas de orientação podem ser liberados a partir de uma micropipeta em um gradiente próximo a um cone de crescimento antes de começar a permeabilização e rodamina actina-incorporação. Por exemplo, NGF pode ser liberado para DRG neurônios ou netrin de células ganglionares da retina neural. A pipeta pode ser introduzida para tão curto quanto 1-2 minutos antes de iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos locais de um gradiente de cue orientação sobre a formação de extremidades livres F-actina farpado nas margens de crescimento cone principal (ver citação de referência 10 para imagens). </li><li> Estas variações podem ser combinados com mediada por anticorpos rotulagem de outros componentes neuronal, como descrito em 6.2 acima. </li></ol> 8. Quatro variação: F-actina Labeling extremidade livre farpado em Neurônios Transfectados <ol><li> O uso de construções constitutivamente ativa ou dominante-negativo ou knockdown proteínas usando RNAi (com um marcador fluorescente identificar) pode ser usado para avaliar o envolvimento de uma proteína na regulação da F-actina livre termina farpado. Dependendo da proteína, sua localização dentro do cone de crescimento, e se ele é fundido a uma etiqueta fluorescente, a proteína fluorescente expressa em células transfectadas pode ser perdida após permeabilização. Se este for o caso, pratos de vídeo pode ser usado para identificar uma célula transfectadas microscopicamente antes de permeabilização ea permeabilização pode ser realizada no palco microscópio, depois de marcar as posições das células transfectadas. Alternativamente, uma construção GFP-actina pode ser co-transfectadas com GFP-um constructo de interesse. Neste caso, GFP-actina serão incorporados F-actina, e não será perdida por permeabilização, permitindo a identificação de células transfectadas após permeabilização. </li><li> Esta variação pode ser combinada com a adição de pistas de orientação, conforme descrito no 7,1-7,3 acima. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Além global de NGF aumentos totais F-actina e F-actina termina farpado na margem cone de maior crescimento. Quando um cone de crescimento DRG é estimulado com fator de crescimento neural (NGF) por 5 minutos, polimerização de actina é estimulada na margem principal, e uma banda de rodamina-actina rotulagem é visto em torno da periferia do cone de crescimento. A Figura 1 compara rodamina-actina incorporação em um cone unstimulated DRG crescimento e uma NGF estimulada cone de crescimento DRG. A fluorescência verde nas imagens fundidas é phalloidin rotulagem de F-actina no cone de crescimento eo vermelho é rodamina-actina rotulagem. Um bom controle de rotulagem final farpado é adicionar 10-6 M ou superior citocalasina B ou D no buffer de permeabilização nos passos 4.2 e 4.3. Citocalasinas cap F-actina termina farpado e inibir rodamina actina-binding para fins farpado. Isso deve reduzir drasticamente ou eliminar a incorporação de rodamina-actina na célula. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Um gradiente de NGF localmente aumenta a F-actina termina farpado. A micropipeta que libera NGF é trazido para um lado de um cone de crescimento DRG por 2 minutos, seguido de rotulagem de F-actina livre termina farpado. As imagens abaixo mostram que a exposição a um gradiente de NGF localmente estimula um aumento na extremidades livres F-actina farpado na região cone de crescimento mais perto da pipeta. A imagem mesclada mostra phalloidin em verdee rodamina-actina em vermelho. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. ERM proteínas ativadas acumulam na margem cone de maior crescimento. Rotulagem imunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) com extremidades livres F-actina farpado. Gluteraldehyde (0,05%) e paraformaldeído (0,05%) foram adicionados ao tampão de permeabilização inicial para uma min para preservar a localização de ERM. Rodamina-actina, vermelho, PERM, verde; phalloidin, azul. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Estimulação da polimerização de actina requer proteínas ERM ativo. DRGs Dissociated foram co-transfectadas com GFP-actina e um controle GFP plasmídeo ou um dominante negativo Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) construir. O uso de GFP-actina permite a identificação de células transfectadas após permeabilização. Aqui, NGF foi adicionado 5 min antes de rotulagem de F-actina termina farpado. Observe o cone de crescimento transfectadas com DN ERM tem reduzido os níveis de final farpado na margem cone de crescimento inicial (painel inferior do meio), o que contrasta com um cone de crescimento próxima untransfected (painéis inferiores), ou com o controle GFP (painel de média alta). Rodamina-actina, vermelho; GFP-actina, verde. Barra de escala, 10 mM.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos aqui apresentados permitem resolução temporal e espacial de componentes celulares que estão envolvidos na remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina na margem líder de migração cones de crescimento. A ação das moléculas de atrativo, como NGF ou netrin, para estimular rapidamente a polimerização de actina filamento é revelado como um aumento local na actina termina farpado, criado por actina cortando filamento ativado ADF / cofilina 10, como mostrado nas Figuras 1 e 2. O método...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

As pontas móveis de axônios em crescimento são chamados cones de crescimento. Cones de crescimento levam a navegar axônios através dos tecidos em desenvolvimento, interagindo com pistas expressas localmente orientação molecular que se ligam receptores cone de crescimento e regulam a dinâmica e organização do citoesqueleto cone de crescimento 3-6. O principal alvo desses sinais de navegação é a malha filamento de actina que enche a periferia cone de crescimento e que dirige a motilidade cone de crescimento através da polimerização de actina contínua e dinâmica remodelação 7. Pistas de orientação positiva ou atraentes induzir cone de crescimento transformando estimulando actina filamento (F-actina) polimerização na região da periferia do cone de crescimento que é mais perto da fonte do cue atrativo. Esta polimerização de actina unidades locais de crescimento cone protrusão de adesão, da margem de liderança e alongamento axonal em direção ao atrativo. Polimerização de actina filamento depende da disponibilidade de monômero de actina suficiente e nos núcleos de polimerização ou termina filamento de actina farpado para a adição de monômero. Actina monômero é abundantemente disponível no pinto gânglio da raiz dorsal e da retina (DRG) cones de crescimento. Conseqüentemente, a polimerização aumenta rapidamente quando livre F-actina termina farpado ficam disponíveis para a adição de monômero. Isso ocorre no pinto DRG e cones da retina de crescimento através da ativação local da actina proteína F-actina cortando depolymerizing fator (ADF / cofilina) na região cone de crescimento mais perto de uma 80-10 atrativo. Esta atividade ADF / cofilina heightened severs filamentos de actina para criar novos F-actina termina farpado para polimerização. O método a seguir demonstra esse mecanismo. Conteúdo total de F-actina é visualizado através da coloração com phalloidin fluorescente. F-actina termina farpado são visualizados através da incorporação de rodamina-actina dentro de cones de crescimento que são permeabilizadas com o procedimento descrito a seguir, que é adaptado a partir de estudos anteriores de outras células móveis 11, 12. Quando rodamina-actina é adicionado em uma concentração acima da concentração crítica para além de monômero de actina para fins farpado, rodamina-actina monta para livre termina farpado. Se a sugestão atraente é apresentado em um gradiente, como sendo liberados a partir de uma micropipeta posicionada para um lado de um cone de crescimento, a incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado será maior no lado cone de crescimento para a micropipeta 10 . Cones de crescimento são estruturas celulares pequenas e delicadas. Os procedimentos de permeabilização rodamina-actina fixação incorporação, e visualização de fluorescência são cuidadosamente feito e pode ser realizada no palco de um microscópio invertido. Estes métodos podem ser aplicados ao estudo de polimerização de actina locais nos neurônios migrar, outras células do tecido primário ou linhas celulares.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.

Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  University of Minnesota. Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.

Vídeo: Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...