This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1: Preparação de poli-D-lisina Hydrobromide <ol><li> Prepare 1 mg / ml de bromidrato de poli-D-lisina em tampão borato 0,1 M (pH 8,5). </li><li> Alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li></ol> Revestimento 2 Poli-lisina de Lamelas Nota: Executar todas as etapas de limpeza e revestimento em uma câmara de fluxo laminar. <ol><li> Coloque lamelas em uma placa de Petri contendo 1 N de ácido clorídrico (HCl) durante 2 horas. </li><li> Aspirar todo o HCl e enxágüe com 70% de etanol (EtOH) 2-3x. </li><li> Deixar em EtOH a 70% durante 1 hora. </li><li> Aspirar todo o etanol 70% e enxágüe com 100% EtOH 2-3x. </li><li> Deixar em EtOH a 100% durante 2 horas. Aspirar todo o EtOH. </li><li> Secar com papel de filtro e secar ao ar durante alguns segundos. </li><li> Colocar N em 1 mg de solução de poli-lisina / / ml de S. </li><li> Lavar lamelas dia seguinte com Millipore 4-5x água. </li><li> Ar seco poli-lisina sobre lamelas de vidro revestidas em rolos de uma caixa de Petri limpa. </li><li> Para immunohistochemistry, utilizar 35 × 10 mm tampas prato Petri. Prepare Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) alinhado pratos vertendo PDMS (elastómero e agente de cura de 10: 1, em peso) para o prato com uma espessura de 0,3 cm, e deixar solidificar a 30 ° CO / N. Uma vez que este se pôs, cortar dois centímetros por 1 centímetro talhado no PDMS. Limpar e revestir a inserção com poli-lisina, seguindo os mesmos passos como mencionado acima para lamelas. </li><li> Armazenar poli-lisina lamelas revestidas e pratos cobertos para dentro da câmara de fluxo laminar, até à sua utilização (cerca de 2 semanas, mas obter melhores resultados através da preparação de adesivos, periodicamente a cada 3-4 dias). </li><li> Prepare um bloco de PDMS, para fixar a medula espinhal no fatiador de tecido vibrando. Elastómero Mistura A e B de elastómero 1: 1 em peso. Verte-se uma placa de Petri de 100 x 15 mm e permite fixar O / N a 30 ° C. Corte um pedaço retangular do PMDS e cola-lo para a placa de base de corte com cola epóxi. Permitir que a cola para definir que fixa os PDMS no lugar e cortar várias seções finas na superfície para obter um apartamentosuperfície para fixar o tecido no. </li></ol> 3. aguda dissociação da Lampreia Medular para produzir isolados reticulospinais Axons <ol><li> Anestesiar um ammoecoete ou adulto lampreia (Petromyzon marinus) com metanos tricaina (MS-222; 100 mg / L). Adicionar anestésico dentro da água, em um copo de plástico coberto por uma tampa, contendo a lampreia para ser sacrificado. </li><li> Decapitar lampreia em frio (4 ° C) solução de Ringer com a seguinte composição (em mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 de CaCl2, 1,8 de MgCl2, 4 de HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) e remover o corpo músculos da parede para expor a superfície dorsal da espinal-medula. </li><li> Remover meninge Primitiva a partir da superfície dorsal da medula espinal utilizando fórceps finos. Não retire ventral Primitiva meninx nesta fase. </li><li> Corte medula espinhal em um centímetro peças longas. </li><li> Fixar um pedaço da medula espinhal usando finas pinos de insetos, lado dorsal voltada para cima, em um PDMS forrado cortar pla base dete (ver 2.12) numa câmara de tecido de vibração fatiador contendo a solução de Ringer com gelo. </li><li> Retirar uma secção central da coluna dorsal da espinal medula por corte ao longo do eixo rostro-caudal com a lâmina, deixando para trás secções da coluna dorsal intactas no rostral e caudal termina para servir como lida durante o processo de dissociação Figura 2a e a Figura 2b. Use configuração de velocidade mais lenta que permite cortar e uma configuração de profundidade que remove apenas a coluna dorsal deixando a coluna subjacente axônio reticuloespinhal Figura 2b sem danos. </li><li> Incubar cortados pedaços da medula espinal, à TA, durante 45 minutos, em uma mistura de 1 mg / protease ml (Tipo XIV a partir do Streptomyces griseus) e 1 mg / ml de colagenase preparado (Tipo IA a partir de Clostridium histolyticum) em solução de Ringer (adaptado a partir de El Manira &amp; Bussières , 1997 17). </li><li> Pedaços da medula espinhal Pin tratado com enzimas que utilizam pinos finos em um PDMS forrado Petri Conta pratoining solução de Ringer frio (4 ° C). </li><li> Remover ventral Primitiva meninx com uma pinça fina. </li><li> Cortar extensões laterais da medula espinal, com uma lâmina de bisturi, no ponto médio da secção dorsal cortado deixando a coluna central do axónios reticulospinais intactas na medula espinhal A Figura 2d. </li><li> Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lente. </li><li> Coloque a lamela poli-lisina revestido (Figura 3a, parte superior, retângulo vermelho) na ranhura da câmara de gravação Figura 3 e aplique graxa de vácuo para todas as bordas (espaço entre os retângulos vermelhos e azuis na Figura 3a, a fim de facilitar um selo. Parafuso o top no lugar. Coloque a câmara na inserção no equipamento de gravação. </li><li> Adicionar a solução de Ringer na câmara de gravação, utilizando uma pipeta Pasteur. </li><li> Conecte o tubo de saída do frasco contendo solução anticongelante pressão para o tubo de entrada de dispositivo de resfriamento termoelétrico. Conecte o output tubagem do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico para a extremidade de entrada da camisa de arrefecimento externo e a extremidade de saída do reservatório para a Figura 3b. </li><li> Coloque um pedaço de medula espinal de cada vez na câmara de gravação e separar cuidadosamente a medula espinhal mantê-la ao longo da lamela em todos os momentos, utilizando fórceps revestidos de Teflon, até axônios são isolados Figura 2e e na Figura 2f. </li><li> Traga a temperatura da solução de gravação e 10 ° C, passando o pressurizado (gás de azoto é empurrado para dentro do frasco) de solução de anticongelante (por deslocamento), por intermédio do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico, através da camisa de arrefecimento exterior da câmara de gravação Figura 3b. </li><li> Permitir axónios para se recuperar por 1 h após a dissociação, a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2 Representação esquemática do protocolo de dissociação para o isolamento dos axônios reticulospinais. (A) A remoção da coluna dorsal. A seta indica a direcção de corte do tecido. Os cornos dorsais são marcados pelo alfabeto D (cor da fonte vermelho), enquanto os cornos ventrais de o alfabeto V (cor fonte vermelha) (b). Coluna dorsal removida na porção central da medula espinhal expondo os axónios reticulospinais (linhas verdes ). Os cornos ventrais, que permanecem intactos após o processo de corte, são marcadas pelo alfabeto V (cor de fonte vermelha). (C) o tratamento de 45 minutos com protease e colagenase enzimas cocktail (1 mg / ml). (D) Corte de extensões laterais da medula espinal; indicando a posição, a direcção e extensão do corte lateral. (e) dissociação mecânica da medula espinhal. As setas indicam a posição do fórceps e direção da força de separação durante a dissociação. (F) Representative exemplo de preparação dissociada axônio reticuloespinhal. Setas verdes marcar regiões de axônios reticulospinais agudamente dissociadas sem quaisquer processos pós-sinápticos. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Esquema de câmara para experimentos de eletrofisiologia gravação. Dimensões fornecidas são em polegadas. Retângulo vermelho mostrado no diagrama basepiece (a) indica o posicionamento da lamela no sulco lamela no basepiece. A região entre o rectângulo vermelho e azul, mostrado no diagrama basepiece (a) é o local onde está aplicado o lubrificante alto vácuo. (B) mostra a câmara de gravação montadas. 4. rotulagem e identificação dos terminais pré-sinápticos com FM 1-43 <ol><li> Rotular terminais pré-sinápticos, incorporando FM 1-43 em vesicles durante sináptica exo-endocitose durante a alta K + despolarização. Perfundir preparação com 5 uM de FM 1-43 (em 5 ml de solução de Ringer contendo KCl 30 mM). </li><li> Perfundir preparação com 1 mg / ml ADVASEP-7 (em 5 ml de solução de Ringer), para remover o excesso de corante FM) 18. </li><li> Perfundir preparação, com a solução de Ringer durante 15 min à lavagem e qualquer corante Remant o ADVASEP. </li><li> Imagem com 100 X lente de imersão em óleo (1,25 NA) num microscópio de fluorescência invertido, em conjunto com uma câmara CCD digital e software de aquisição de imagem micromanager, usando protocolos de imagem de fluorescência padrão. </li><li> Identifique os terminais pré-sinápticos marcados com fluorescência para direcionar para a gravação Figura 4c e 4d Figura. </li></ol> 5. Imunohistoquímica de isolados reticulospinais Axons <ol><li> Preencha prato inserção (seção Protocolo de 2.10.) Com bivalente-ion (Ca 2 + e Mg 2 +) livreSolução de Ringer. </li><li> Fabricar pipetas de patch em uma micropipeta extrator P-87. Colocar uma pequena quantidade de cola de sutura numa extremidade de inserção da poli-lisina usando uma pipeta de remendo de 1,5 mm (diâmetro exterior de vidro) e de sucção (tubagem de silicone com um diâmetro interno de 0,89 milímetros com uma ponta de micropipeta ligada à extremidade de aspiração). </li><li> Realizar dissociações utilizando o mesmo procedimento tal como mencionado na secção protocolo 3 Figura 2. Colocar uma extremidade da medula espinal em que a cola de sutura e pressionar suavemente com uma pinça para aderir fortemente à superfície. Colocar uma gota de cola de sutura na outra extremidade da inserção e alongar suavemente a medula espinal até axônios são dissociados e prender a extremidade livre da medula espinal, arrastando-o suavemente sobre a cola de sutura. Fixe no lugar pressionando suave para baixo com a pinça. </li><li> Taxas bivalente libertar solução de Ringer com solução normal de Ringer por perfusão. </li><li> Permitir que os axônios se recuperar por 20 min pós dissociation a 10 ° C. </li><li> Fix axónios dissociados em 4% de paraformaldeído (PFA) {preparado de Tampão Fosfato Salino (PBS (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 a 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtre solução PFA antes da utilização através da passagem por um filtro de seringa de 0,2 uM. </li><li> Lavar a PFA irrigando glicina 0,1 M (em PBS) durante 10 min. </li><li> Incubar em 0,1% de Triton-X (em PBS) durante 10 min. </li><li> Lavar irrigando PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 6 horas a 4 ° C. </li><li> Adicionar em anticorpo primário para VGCC de interesse (diluição 1: 200 em PBS) e incuba-se durante 20 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar irrigando PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar em anticorpo secundário (1: 400 em PBS) e incuba-se escura durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar irrigando com PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 1% de soro bovino Albumin (em PBS) durante 20 min. </li><li> Adicionar em Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / ul concentração de trabalho; estoque preparadas em metanol a 200 Unidades / mL). </li><li> Lavar irrigando com PBS durante 20 min. </li><li> Imagem com lente de imersão em água 100X microscópio confocal. </li></ol> 6. eletrofisiológica Recording <ol><li> Fabricar pipetas de patch vidro alumino-silicato (resistência pipeta 2-5 mohms) em uma micropipeta extrator P-87. Projeto pipeta patch de tal forma que a ponta da pipeta engloba diâmetro inteiro terminal pré-sináptico. </li><li> PDMS remendo pipetas revestimento por imersão a pipeta de adesivo sob 50-60 psi de pressão em PDMS 23 (juntar um tubo de silicone, 0,89 mm de diâmetro interno, ligada a um cilindro de gás de azoto, para a extremidade traseira da pipeta patch) e secam-se utilizando um calor arma. Como alternativa, o revestimento manualmente pipeta com PDMS, aplicando o revestimento o mais próximo da ponta quanto possível, sob um microscópio composto. </li><li> Incêndio pipetas de patch polonês usando um microforge (um filamento de platina personalizado construído montada no palco de um microscópio composto). </li><li> Identificar axônios isolados demonstrando terminais pré-sinápticos marcados por microscopia de fluorescência. </li><li> Encha solução de gravação (concebido para isolar correntes de Ca 2 +, 10 mM de CaCl 2 ou 90 mM de BaCl2, como portador de carga, tamponada com HEPES, pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) para a pipeta de adesivo utilizando uma seringa. </li><li> Insira remendo pipeta no suporte da pipeta e posição acima do banho usando um MP225 motorizada manipulador. Abaixe cuidadosamente a pipeta de patch para o banho e posição contra o rosto de um terminal pré-sináptico fluorescently identificado. </li><li> Avança a pipeta remendo lentamente até que o contato é feito com a membrana. Neste ponto, conseguir uma vedação gigaohm por sucção boca suave através de um tubo colocado no suporte da pipeta. </li><li> Para atingir os níveis extremamente baixos de ruído de fundo necessários para a gravação de um único canal de Ca2 + correntes, use um Axopatch 200B com um andar de entrada arrefecida para as gravações. Os dados da amostra em 20-50 kHz e filtrar por 5 kHz filtro de Bessel. Realizar aquisição de dados utilizando um Axograph X. </li><li> Use um protocolo passo padrão, em incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar um pré-pulso no protocolo, o protocolo anterior passo, para assegurar activação máxima de canais de Ca 2 +. Incorporar uma mV etapa 10 vazamento no protocolo passo para pós-análise subtração das correntes de fuga. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Nosso protocolo de dissociação é significativo por ceder axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter funcional pré-sináptica terminais Figura 4c e 4d Figura. A ausência de processos pós-sinápticos que se opõem ao terminal pré-sináptico permite o acesso a gravação direta para a membrana rosto liberação pré-sináptica nos terminais pré-sinápticos individuais, que não eram possíveis...

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido e preciso. Ação potencial invasão do terminal pré-sináptico leva à abertura de VGCCs localizados na membrana rosto liberação, o aumento resultante na pré-sináptica de Ca2 + age como o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores 1. Todos estes passos ocorrem dentro de centenas de microsegundos 2, e, portanto, requerem acoplamento espacial de VGCCs apertado para a vesícula máquinas de fusão 3. Pré-sinápticos de Ca2 + fluxos têm sido caracterizadas principalmente por meio de imagens abordagens utilizando Ca2 + corantes sensíveis 4. Incorporando Ca2 tampões que modulam Ca2 + nos neurónios pré-sinápticos tem sido utilizado para caracterizar indirectamente a relação entre o cálcio pré-sináptico e a neurotransmissão 3. Além disso, a modulação da pré-sináptico livre concentração de Ca2 + por uncaging Ca2 + 5 ou gravação macroscopic correntes de Ca2 + têm sido utilizados em conjunção com medidas de fusão e / ou a libertação de vesículas; como medidas de capacitância 6 ou pós-sinápticos respostas 2 para abordar a mesma questão. No entanto, a caracterização de Ca2 + correntes directamente na face de libertação, a secção especializada da membrana pré-sináptica, onde a despolarização da membrana é convertida em Ca 2 + correntes provocando a fusão das vesículas sinápticas e a libertação de neurotransmissores, é essencial para se obter uma medida precisa do Ca2 requisito para a fusão das vesículas sinápticas. Além disso, a capacidade de caracterizar directamente as correntes de Ca2 + nos terminais pré-sinápticos individuais, acoplado com medições simultâneas precisos de fusão das vesículas e libertação permite uma elucidação preciso da relação de temporização entre o curso do tempo da acção potencial, pré-sináptico corrente 2 + Ca, fusão das vesículas e liberação. Acesso à membrana rosto liberaçãonão está disponível na maior parte dos terminais pré-sinápticos, devido a fechar por aposição dos dendritos pós-sinápticos. Esta inacessibilidade tem sido um grande obstáculo na caracterização de VGCCs uma vez que impede medidas diretas de corrente nos terminais pré-sinápticos individuais. Caracterização direta de pré-sinápticos Ca2 + correntes nos terminais pré-sinápticos individuais, até agora, não foi possível nas sinapses centrais e só foi alcançado em dois terminais pré-sinápticos do tipo coletor; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar 7-10 e rato calyces 11,12. Em todos os outros terminais pré-sinápticos, incluindo a sinapse reticuloespinhal gigante na lampreia medula espinhal 13, a falta de acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica exigiu o uso de abordagens indiretas, tais como Ca2 + radiológico para o estudo pré-sinápticos de Ca2 + fluxos. <img alt="Figura 1" fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 lampreia sinapse reticuloespinhal gigante. (A) Secção transversal da lampreia medula espinhal indicando orientação dorso-ventral. Axônios reticulospinais são marcadas com asterisco verde. (B) reconstrução 3-D da sinapse reticuloespinhal na lampreia medula espinhal mostrando axônio pré-sináptico reticuloespinhal fazendo numerosos en passant contatos (marcado por setas verdes) sobre o neurônio pós-sináptico 13. Terminais pré-sinápticos têm sido marcados com Alexa Fluor 488 conjugado com hidrazida faloidina (verde), enquanto que o neurónio pós-sináptico foi preenchido com Alexa Fluor 568 hidrazida (vermelho). Lampreia gigantes axônios reticulospinais, localizado na região ventral da medula espinhal paralelo ao eixo Figura 1a rostral-caudal, forma múltipla en passant contatos sinápticos em neurônios doespinhal chifre ventral 14 Figura 1b 13. De célula inteira macroscópica Ca2 correntes foram registadas a partir de axônios reticulospinais na medula espinhal intacta 13,15. No entanto, tentativas anteriores para cegos medição directa de correntes de Ca 2 + em axónios reticulospinais na medula espinhal lampreia intacto usando ligado de células técnica de fixação de membranas 13, não têm tido sucesso, devido à falta de acesso à membrana cara de libertação pré-sináptica devido aos processos de pós-sinápticos opostas Figura 1b. A membrana de libertação cara tenha sido previamente tornado acessível pela remoção do neurónio pós-sináptico 11, perturbação mecânica da sinapse antes da gravação de 12 ou tratamento enzimático acoplado com dissociação mecânica 16. Dada a complexa organização da medula espinhal, que seria extremamente difícil identificar o neurônio pós-sináptico e recolhê-lo mecanicamente ou perturbar ªe sinapse. Por isso, decidimos usar o tratamento enzimático 17 seguido de dissociação mecânica. Usando essa abordagem, temos desenvolvido uma preparação profundamente dissociada da lampreia medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados viáveis ​​com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de quaisquer processos de pós-sinápticos, proporcionando assim o acesso irrestrito aos terminais pré-sinápticos individuais. Em conjunto com um microscópio invertido padrão e imagens de fluorescência, que nos permite identificar e alvejar terminais pré-sinápticos fluorescente identificados individualmente, com uma pipeta de patch que contém uma solução de gravação que isola as correntes de Ca2 + 4c figura e Figura 4d, para gravar utilizando célula- ligado técnica tensão-grampo. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana rosto liberação pré-sináptica de indivíduo terminais pré-sinápticos Figura 4f. Este é um significant avanço no campo da transmissão sináptica, uma vez que é o primeiro exemplo de gravação a ser realizada nas sinapses centrais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido. O potencial de ação dirigido influxo de Ca2 + para o terminal pré-sináptico, através de canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCCs) localizados na membrana rosto lançamento, é o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores. Crucial para a rapidez da transmissão sináptica é a sincronia espacial e temporal entre a chegada do potencial de acção, e a maquinaria VGCCs a libertação de neurotransmissores. A capacidade de gravar diretamente de Ca2 + correntes da membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais é imprescindível para uma compreensão precisa da relação entre pré-sináptica de Ca2 + e liberação de neurotransmissores. Acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica para a gravação eletrofisiológico ainda não está disponível na maioria das preparações e Ca 2 + entrada pré-sináptica tem sido caracterizada utilizando técnicas de imagem e MeasureMe atual macroscópicoNTS - técnicas que não têm resolução temporal suficiente para visualizar Ca2 + entrada. A caracterização de VGCCs diretamente nos terminais pré-sinápticos individuais não foi possível nas sinapses centrais e, até agora, foi alcançado com sucesso apenas no tipo cálice sinapse do gânglio ciliar e pinto em cálices de ratos. Temos abordado com sucesso este problema na sinapse reticuloespinhal gigante da lampreia medula espinhal através do desenvolvimento de uma preparação agudamente dissociada da medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de estruturas pós-sinápticos. Podemos fluorescently rotular e identificar terminais pré-sinápticos individuais e orientá-las para a gravação. Usando esta preparação, caracterizamos VGCCs diretamente para o rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais usando imunohistoquímica e eletrofisiologia abordagens. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana o rosto liberaçãoterminais pré-sinápticos individuais de f, o primeiro registo a ser realizada nas sinapses centrais.

<html> Isso gera protocolo dissociação saudáveis ​​e funcionais axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter os terminais pré-sinápticos funcionais capazes de evocado vesículas sinápticas exo-e endocitose Figura 4c e 4d Figura. Secções das regiões isoladas dos axônios reticulospinais podem ser claramente identificados em microscópio de luz para estar livre de quaisquer outros processos...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals at JoVE.c

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K visualizações.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Vídeo: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Neurociência

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.