Dia 0 - Esterilização antes do dia de experimento <ol><li> Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas: <ul><li> Chambers </li><li> Tampas </li><li> Quadros (todos os 3 peças) </li><li> Parafusos </li><li> Juntas de borracha </li><li> Fórceps </li><li> Tesoura </li><li> Chaves Hex </li></ul></li><li> Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada. </li><li> Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos. </li><li> Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrados. Se utilizando membranas padronizada, garantir que o lado padronizada é a face para cima (álcool de spray em um lado da membrana e prestar atenção para o líquido para executar as ranhuras). </li><li> Deixe membranas cobertas em álcool 70% por 2 horas. </li><li> Luvas de pacote em folha de alumínio para autoclave amanhã de manhã. </li><li> Faça 2% (peso / volume) de solução de gelatina (2g/100mL) em água destilada para autoclave amanhã. </li><li> Após a esterilização duas horas em álcool 70%, coloque todos os materiais de polímeros e membranas (não autoclavável materiais) na capa de UV durante a noite: <ul><li> Chambers </li><li> Tampas </li><li> Quadros (todos os 3 peças) </li><li> Membranas </li></ul></li><li> Pacote de materiais remanescentes na bolsa autoclavável: <ul><li> Parafusos </li><li> Juntas de borracha </li><li> Fórceps </li><li> Tesoura </li><li> Chaves Hex </li></ul></li></ol> Dia 1 - Montagem das câmaras de estiramento <ol><li> Forceps autoclave, tesouras, chaves hex, parafusos, juntas, luvas, e gelatina utilizando autoclave pequena a 240 ° F durante 20 minutos no total </li><li> Remova as membranas de UV e tratar com O 2 plasma (lado modelado para cima) para ~ 1 minuto. </li><li> TC na capa, capa área padronizada de membranas de plasma tratado com gelatina. Casaco de 30 para minutos sob UV. </li><li> Lavar cada membrana com PBS 2X. Após a lavagem 2, deixar alguns PBS nas membranas para mantê-los escorregadios, para facilitar a montagem para as câmaras. (Deve também usar este PBS para lubrificar as juntas para facilitar a montagem). </li><li> Montar membranas em câmaras (usar luvas autoclavado durante a montagem) <ol><li> Ligar as duas principais peças do quadro usando um único parafuso. </li><li> Virar o quadro e coloque uma membrana na parte superior de modo que as faces de gelatina revestido lateral em direção à estrutura (área padrão deve estar no centro). </li><li> Assegurar a membrana para o quadro usando uma junta em cada lado. </li><li> Pressione a juntas de, usando gentil, mesmo pressão, para não rasgar a membrana. </li></ol></li><li> Anexar quadro montado para T-bar. </li><li> Virar o quadro e colocar em câmara de cabeça para baixo. Verso da moldura UV e membrana por 30 minutos </li><li> Vire a moldura novamente, e parafuso em câmaras (sem mudança para câmara de controle, mas para câmara de estiramento, precisa usar dois parafusos para fixar a peça final do quadro para o fundo da câmara, e precisa remover o único parafuso que é segurando as duas peças do quadro juntos). Frente UV por 30 min. Certifique-se que as membranas estejam completamente secas antes de prosseguir para a próxima etapa, ou então a solução da célula pode escapar durante a semeadura. </li><li> Células da semente. Área de 1 = Área da placa de 3 membranas, portanto, use 1 / 3 de uma placa confluentes por membrana. Use 1 mL de solução por célula de membrana. Mais do que 1,5 ml será difícil manter em solução. Coloque solução única célula na área de estampados, e usar a ponta da pipeta para espalhar a solução ao redor. Cubra e deixe câmaras anexar células por 30 minutos RT no capô. </li><li> Mover câmaras para incubadora e vamos anexar células por mais 1 hora. Ter muito cuidado movendo as câmaras de evitar que solução da célula escorregar! As células em que câmara será arruinado se a solução cai neste momento. </li><li> Retorno câmara para capô e adicionar 20 mL de mídia. </li><li> Câmaras lugar em álcool limpo banheira que é coberto com folha de alumínio (também pulverizadas com álcool). Mover câmaras para esticar incubadora (10% CO 2). </li><li> Câmaras de seguro para uma máquina de estiramento. Vamos anexar células mais durante a noite, e começar a esticar no dia seguinte. (Nota: quando colocar câmaras em máquina de esticar, lembre-se de bloquear a máquina na posição &quot;zero&quot; antes de colocar câmaras, e então aperte o elástico em volta das engrenagens Não se esqueça de desbloquear as engrenagens antes de iniciar a máquina.). </li></ol>

<ol>
	<li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro.">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li><li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells.">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li><li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells.">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li></ol>

Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células 1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome &quot;Flexercell&quot; (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que de...

Notas sobre a mídia: Estes experimentos estiramento uniaxial são propensos à contaminação devido à complexidade de configuração de biorreatores. Para combater isso, tentamos várias combinações de antibióticos e antifúngicos. O Fungizone 1% normalmente necessário, juntamente com uma combinação de antibióticos. Ou use uma combinação Pen / Strep, ou usar uma combinação de canamicina e gentamicina (mas não tente usar uma combinação / cocktail de três ou mais antibióticos em conjunto, como pode levar a bactérias resistentes a mutante, e também pode ser prejudicial para as células) .

mechanical stimulation of stem cells using cyclic uniaxial strain

O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada &quot;câmara de estiramento&quot;, incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.

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Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.

A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

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12.7K visualizações.  University of California, Berkeley. É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.