DT foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de Le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) e um MITACS Elevate Estratégico Fellowship. CMC foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e Ernest e Margaret Ford cardiologia dotado bolsa de pesquisa da Universidade de Ottawa Heart Institute. EOB foi apoiado por subvenções de funcionamento MOP80204 do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) e T6335 da Heart and Stroke Foundation of Ontario. O CIHR e Medtronic fornecer coletivamente EOB com uma cadeira da pesquisa peer-reviewed (URC # 57093). AEP é financiado pelas Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia (NSERC) Descoberta Grant, um suplemento NSERC Discovery Accelerator e agradece o apoio dos presidentes de Pesquisa do Canadá programa (CRC) e um pesquisador Prêmio início da Província de Ontário.

1. Deformação mecânica de células individuais <ol><li> Fabricação de um substrato de PDMS com partículas fluorescentes incorporadas Antes do fabrico do substrato, as microesferas fluorescentes em solução aquosa, são suspensas de novo em isopropanol para melhorar a mistura do grânulo em PDMS, devido à sua natureza hidrofóbica. <ol><li> Pipetar 500 l de microesferas fluorescentes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuga-se a 16.200 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 500 mL de isopropanol seguido de 5 min de agitação em vórtice. Coloque o frasco de lado durante a noite, no escuro, a fim de permitir que as partículas grandes agregados para sedimentar. </li><li> Na manhã seguinte, retire cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Esta solução de esferas pode ser utilizado para fabricar mais do que 5 substratos. Nota: A solução talão continuará a sedimentar para os próximos 3 dias. Tenha cuidado para evitar ressuspensão do pellet. </li><li> Despeje 0,5 g do agente de cura desdecom o kit de PDMS em um frasco de 1,5 ml de microcentrífuga com uma balança científica. Por etapas sucessivas, adicionar um total de 90 ul de contas (em seis adições de 15 ul), vortex durante 1 minuto entre cada adição. Ponha de lado. </li><li> Pesar 10 g de PDMS e mistura-se durante pelo menos 12 minutos, com a 0,5 g do agente de cura suplementado com esferas fluorescentes. </li><li> Fabricar um SU-8 2050 molde em forma de cruz, utilizando técnicas de fotolitografia padrão seguindo as instruções do fabricante. O molde utilizado tem uma altura de 320 microns e uma área de 13,4 cm 2 (Figura 3). O molde pode conter 428 mL ou 440 mg de PDMS. </li><li> Despeje a 400 mg de PDMS com grânulos no molde em forma de cruz com uma pipeta de transferência e de cura durante 2 horas a 80 ° C. Após a cura, descolar o substrato a partir do molde (Figura 5A). O substrato pode ser mantido numa caixa de Petri à temperatura ambiente durante 2 semanas sem exibir alterações significativas nas suas propriedades mecânicas. </li&gt; <li> Despeje gotículas de PDMS (agente de cura: PDMS com uma proporção de 1:20) em uma placa de Petri com um tamanho final de aproximadamente 4 mm de diâmetro e curá-las de cabeça para baixo durante 2 horas a 80 ° C (Figura 5B). Estas características de ancoragem podem ser mantidos numa placa de Petri por semana. NOTA: Mantenha o prato de cabeça para baixo para evitar que as gotas de achatamento durante o processo de cura. </li><li> Deleite Ar plasma (30 segundos a 30 W) o substrato e oito recursos de ancoragem. Ligar os recursos em cada extremidade do substrato a uma distância de 4 mm a partir do travessão em forma quadrada presentes sobre o substrato (Figura 5C). </li></ol></li><li> Montagem da membrana sobre os grampos <ol><li> Enrole cada extremidade do substrato ao redor da parte cilíndrica com ranhuras dos grampos e fixá-lo no lugar com os dois parafusos da parte superior (Figura 2B e Figuras 5D-E). </li><li> Aperte os quatro grampos no suporte do grampo e despeje PDMS (razão de 1:20) usando um descartável transferência pipeta na interface entre o substrato e a parte cilíndrica com ranhuras das braçadeiras. Espalhe as PDMS não curado ao redor da parte cilíndrica com ranhuras utilizando uma chave sextavada de 1,5 mm. </li><li> Despeje PDMS (01:20) nas ranhuras até estar completamente preenchido por acção capilar e curar o conjunto a 80 ° C durante 2 horas (Figura 5F). </li></ol></li><li> Semeando células na membrana <ol><li> Deleite Ar plasma (30 segundos a 30 W) toda a assembléia para esterilizar e funcionalizar o substrato para permitir revestimento de colágeno. </li><li> Funcionalizar a superfície do substrato em que as células irão ser semeado com 1 ml de 0,02 M de ácido acético suplementado com 16 ug / ml de colagénio de rato-cauda, ​​à temperatura ambiente durante 1 hora. A densidade de colagénio final desejado é de 5 mg / cm 2. </li><li> Lavar 3x com tampão de fosfato de substrato e deixar secar à temperatura ambiente durante, pelo menos, durante 10 min. </li><li> Adicionar 40 ul de meio de cultura suplementado com 10% seru fetal bovinom e 1% de penicilina-estreptomicina, contendo 2000 células na porção central do substrato para cobrir uma área de 1 cm 2 (densidade celular: 20 células / mm 2). A densidade celular pode ser alterado de acordo com requisitos experimentais. </li><li> Colocar todo o conjunto numa incubadora de cultura de células padrão com o substrato virado para cima com a gota de meio de cultura contendo as células nele. NOTA: O conjunto deve ser mantido com o substrato virado para cima por pelo menos 3 horas para permitir que as células para anexá-lo com firmeza. Para evitar a evaporação, a 30 mL de meio de cultura quente é adicionada à gota sobre o substrato a cada 45 min durante 3 horas. </li><li> Depois de 3 horas, virar todo o conjunto em uma placa de Petri cheia de meio de cultura fresco para submergir o substrato e incubar durante a noite para permitir que as células a proliferar. </li><li> No dia seguinte, preparar uma solução salina tamponada com HEPES (HBSS, 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, 1,8 mM de CaCl2, e 11,1 mM de dextrose). Ajustar o pH para 7,4. NOTA: A solução de HBSS tem que ser preparada diariamente e mantida a 37 ° C durante as experiências. Esta solução fisiológica é usada para manter as células na fase de microscópio imitando o ambiente de tecido / sangue normal. </li><li> Monte o set-up em invertido de contraste de fase ou microscópio fluorescente Monte o conjunto da braçadeira-substrato na plataforma BAXS e motores. Encher o prato de Petri no interior do aquecedor de placa de Petri com um tampão de HEPES (Figura 2D). </li></ol></li></ol> 2. Rigidez Arqueação das Embarcações de pequeno calibre <ol><li> Preparação <ol><li> Solução fisiológica de Krebs: Prepara-se uma solução de 118,1 mM de NaCl, 11,1 mM de D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, e 2,5 mM de CaCl 2. Ajustar o pH para 7,4 e oxigenar a solução com carbogénio gás médico (95% de O2 / 5% CO 2) durante 30 min. NOTA: A solução que Krebsno tem que ser preparada diariamente e mantida a 37 ° C durante as experiências. Esta solução fisiológica é usada para manter os tecidos vivos ao imitar o ambiente de tecido / sangue normal. </li><li> Reúna a instrumentação para a dissecção e avaliação mecânica dos vasos de aorta: tesouras cirúrgicas, pinças dobrados, micro-tesouras, cirúrgica microscópio de dissecação, 50 ml tubos de centrífuga de polipropileno e 10 ml pipetas sorológicas. O procedimento cirúrgico e experiência não necessita de quaisquer condições estéreis. Montar as pinças da plataforma BAXS juntamente com a célula de carga de antemão. </li></ol></li><li> Isolamento de Tecidos e Dissection Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais de laboratório tem que ser aprovado pelo Comitê Animal Care e Use dos usuários &quot;instituição, que está em conformidade com o Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos usuários &#39;país. <ol><li> Realizar rato eutanásia com a inalação de 99% de CO 2 (7 psi)numa câmara de plexiglass (Figura 6A). </li><li> Abdômen aberto rato e cortar a aorta torácica para sangrar o mouse. </li><li> Remover o diafragma, a caixa torácica e os lobos pulmonares (Figura 6B). NOTA: Para minimizar o risco de danificar o tecido, manter o coração ligado à aorta e evite tocar o navio diretamente, mas manipulá-lo usando o coração. </li><li> Remover o coração, a raiz da aorta e da aorta torácica, cortando suavemente entre o navio e da coluna vertebral. NOTA: Não induzir qualquer alongamento no navio durante a excisão para manter a estrutura interna do tecido intacto (Figura 6C). </li><li> Mergulhar imediatamente e manter o coração ea aorta em solução de Krebs. </li><li> Cortar e lavar cuidadosamente a aorta em solução de Krebs para remover quaisquer coágulos sanguíneos. Remover o tecido conjuntivo usando micro-tesouras, pinças e cirúrgico microscópio de dissecação (Figura 6D-E). NOTA: Mantenha todo o comprimento do vaso e usar o aorraiz tique para determinar a orientação da embarcação. </li></ol></li><li> Vessel Dimension Determinação e montagem Para determinar a rigidez do recipiente, as dimensões do reservatório descarregadas são necessários e podem ser determinadas com um microscópio calibrado. <ol><li> Cortar um anel aórtico de cerca de 2 mm de comprimento e medir com precisão o seu comprimento, utilizando um microscópio calibrado configuração (Figuras 6F-L). Coloque este segmento de lado em solução de Krebs. </li><li> Corte outro anel aórtico tão pequeno quanto possível entre cada um dos segmentos de 2 milímetros (Figura 6F). Coloque este pequeno segmento sobre uma lâmina de vidro de microscópio com a luz para cima e medir a espessura da parede usando uma configuração de microscópio calibrado (Figura 6H). </li><li> Encher a placa de Petri sobre a plataforma BAXS com solução de Krebs e inserir o segmento de aorta anel 2 mm nas pinos de tracção (inset na Figura 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Fabricação de substrato Figura 5. PDMS e montagem. A) Após a cura, o substrato é cuidadosamente tirou o SU-8 2050 molde e posta de lado em uma placa de Petri. B) Ancoragem recursos feitos de PDMS e ajudar a proteger o substrato sobre o E) imagem grampos C Substrato.) com características de fixação prontos para a montagem. D) O substrato é montado nos quatro grampos, que são depois montadas sobre o suporte do grampo (ver inserção). detalhada do substrato montadas nos quatro grampos. F ) Processo de verter PDMS na ranhura por baixo do substrato. A seta indica o PDMS enchendo lentamente o sulco por capilaridade. &quot;Width =&quot; 500 454fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Preparação e isolamento da aorta torácica. A) Preparação de instrumentos cirúrgicos e o ratinho sacrificado. B) Através de uma incisão abdominal longitudinal, a caixa torácica e lobs pulmonares são removidos. C) A aorta é cuidadosamente removido utilizando o coração para manipular o tecido. D) O coração e aorta são colocados em solução fisiológica de Krebs. A aorta é limpa por remoção de todos os tecidos conjuntivos. E) imagem detalhada, mostrando o coração e aorta. F) do segmento da aorta utilizado para a avaliação da rigidez juntamente com pequenos segmentos utilizados para a medição da espessura. GH) O comprimento exacto (L) e a espessura (H) de cada um dos segmentos de navios são avaliados utilizando um microscópio invertido e um programa de análise.

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C., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+collagen+production+of+human+patellar+tendon+fibroblasts+in+response+to+cyclic+uniaxial+stretching+in+serum-free+conditions.">Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions.</a> J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).</li><li>Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-induced+cell+polarisation+is+linked+to+RhoA-driven+microtubule-independent+focal-adhesion+sliding.">Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding.</a> J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).</li><li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A plataforma BAXS aqui apresentado facilita numerosas experiências no estudo de mechanobiology, a partir de investigações de células individuais de tecidos completos. Além disso, a plataforma é altamente flexível e configurável, permitindo a numerosas experiências de estimulação mecânica e os ensaios de tracção de multi-axial. A plataforma também permite a manutenção de células e tecidos em condições fisiológicas e permite a microscopia simultânea durante as experiências de alongamento. Os dois ex...

O microambiente mecânica desempenha um importante papel em muitas funções celulares tais como a proliferação, migração e diferenciação, que têm um impacto profundo no desenvolvimento e homeostasia dos tecidos e também em doenças 1-6. Ao longo dos anos, uma série de ferramentas experimentais têm sido utilizados para estimular mecanicamente as células ou tecidos e medir as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos com o objetivo de aumentar a compreensão das mechanobiology básico e estudando o início e progressão de doenças 6-17. No entanto, deve-se muitas vezes dependem de vários dispositivos experimentais diferentes, a fim de alcançar os objetivos de um estudo particular. Este artigo apresenta uma plataforma única, multi-funcional, biaxial alongamento (BAXS) que permite para os estudos que investigam o papel que as propriedades mecânicas e forças mecânicas jogar em biologia na sub-celular para escalas de comprimento tecido inteiras. A plataforma BAXS não só permite a quantification das propriedades mecânicas dos tecidos isolados, mas também facilita a capacidade de aplicar campos de tensão simples, complexos, e dinâmicas de células vivas, de modo a compreender as suas respostas ao alongamento que ocorre in vivo. A plataforma BAXS também mantém a capacidade de realizar microscopia de células ao vivo durante os testes mecânicos e perturbações em células e tecidos. A plataforma BAXS é um aparelho integrado personalizado que pode ser utilizado para investigar o efeito de deformação do substrato, ao nível celular e realizar ensaios de tracção em tecidos biológicos (Figura 1A). Um aquecedor de alumínio foi fabricado para acomodar um padrão prato de Petri de 10 cm e manter as soluções fisiológicas, a 37 ° C, utilizando um controlador de temperatura e aquecedores de Kapton (Figura 1B). Esta plataforma BAXS podem ser integrados em um contraste de fase invertida e / ou microscópio de fluorescência e permite a gravação simultânea (Figura 1C).Em breve, a plataforma BAXS consiste de quatro motores lineares de bobina de voz, dos quais as partes móveis são montadas em lâminas de rolamento de esferas de movimento linear em miniatura orientados ao longo de dois eixos perpendiculares (Figura 1D). Uma fase de posicionamento linear é montado em cada um dos quatro motores para permitir o movimento vertical do sistema de aperto que vai ser usado (Figura 1E). A posição de cada um dos motores é controlada por um codificador óptico com uma resolução de 500 nm (Figura 1F). Todos os quatro motores são controlados de forma independente com um controlador de movimento empregando retorno do codificador óptico para executar comandos de movimento (Figura 1G). Uma interface LabVIEW fornece controle total sobre a magnitude do deslocamento, velocidade e aceleração de cada motor, a fim de gerar deformação completamente customizável, estática e dinâmica, das células ou amostras de tecido. A técnica utilizada para induzir uma deformação em células é conseguido por simplesmente allowing de células para aderir firmemente a um substrato flexível e transparente e, em seguida, este alongamento do substrato utilizando quatro motores da plataforma BAXS. A plataforma BAXS permite a montagem de qualquer conjunto de design personalizado de grampos para prender o substrato sobre os motores de bobina de voz. Para esta finalidade, desenvolvemos uma série de grampos para que um substrato transparente e flexível, feita de polidimetilsiloxano (PDMS), podem ser ligados (Figuras 2A-C e Figura 3). Como os grampos vai ser exposto a soluções fisiológicas, todas as partes foram maquinados a partir de aço inoxidável para permitir a esterilização. Estes grampos foram cuidadosamente concebidos para levar o substrato tão perto quanto possível em relação ao objectivo do microscópio para melhorar a qualidade de imagem ao mesmo tempo minimizando a tensão sobre o substrato durante o alongamento (Figura 2D). A mesma plataforma BAXS também pode ser utilizado para quantificar a rigidez de pequenas amostras de tecido, utilizando um conjunto apropriado de braçadeiras com adaptaçãoted suporte para as amostras de tecido e de uma célula de carga para monitorar forças. Várias abordagens podem ser tomadas para a montagem de um tecido para os motores de plataforma BAXS; neste caso, os aços inoxidáveis ​​micro alfinetes minucias insectos pinos pode ligar através da abertura de tecidos vasculares, a fim de realizar ensaios de tracção (Figuras 4A-B). Em alternativa, no caso dos tecidos de espessura sem uma abertura natural, as bordas do tecido pode ser mantido em posição com grampos ligados aos motores de bobina de voz, ou colados às pequenas lâminas de vidro com cola biológica e ligados aos motores com os grampos. A fim de realizar os testes de tracção é necessária uma célula de carga e em miniatura podem ser facilmente incorporados em motores de plataforma BAXS e usadas para medir a força que actua sobre o tecido durante um ciclo de alongamento (Figura 4C). À medida que a plataforma BAXS é composta de quatro motores, a introdução de uma segunda célula de carga permite a realização de testes de tracção ao longo de duas direcções ortogonais. Esta capacidade permite quantify a rigidez mecânica de um único tecido ao longo de duas direcções perpendiculares, durante o mesmo experimento. Importante, em todas as configurações, as células ou amostras de tecido de interesse são sempre mantidas em um banho de temperatura controlada, que é acessível ao utilizador. Esta capacidade permite a introdução de agentes farmacológicos, durante o alongamento da amostra, a fim de analisar a resposta temporal da amostra. Além disso, como o eixo óptico do microscópio invertido permanece sem obstruções, todas as formas de microscopia ainda estão disponíveis para o utilizador. Finalmente, como todos os quatro motores da plataforma BAXS são independentes, é possível aplicar campos estirpe altamente configuráveis ​​para a amostra de interesse. Em células in vivo e os tecidos são expostos a complexo e anisotrópica de alongamento que pode ser mais apropriadamente imitou nesta plataforma, em oposição a tradicional uniaxial 7,13,15,18,19 plataforma alongamento. Além disso, as características físicasdo campo de tensão pode ser alterado em tempo real durante um experimento. Essas habilidades permitem que o usuário examinar a resposta ao nível do tecido celular e um grande número de alta complexidade, anisotrópica, temporalmente, e os campos de deformação variando espacialmente. Este artigo descreve as vantagens e limitações da plataforma BAXS, bem como a sua concepção, princípios de funcionamento e os detalhes experimentais para uma única célula e tecido experiências integrais. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Visão geral da plataforma BAXS. A) Vista de cima da plataforma BAXS mostrando os quatro motores de bobina de voz. B) imagem detalhada do aquecedor de placa de Petri usada para manter as células e os tecidos a 37 ° C. C) A plataforma pode ser montada sobre um microscópio invertido para apresentar ao vivo- imagens de células durante as experiências de alongamento.D) imagem detalhada do motor de bobina de voz; E) foto da parte móvel da plataforma. detalhada da fase de posicionamento linear permitindo o deslocamento vertical dos sistemas de fixação. F) imagem detalhada do codificador óptico que fornece posição em tempo real do motor para o controlador de movimento G) Retrato detalhado. do controlador de movimento que mostra as quatro entradas e saídas do codificador óptico de energia para os quatro motores de bobina de voz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Sistema de fixação para experimentos com células de alongamento. AB) de imagens que mostram os detalhes dos grampos utilizados para fixar o substrato de PDMS para os motores de bobina de voz para o alongamento. C) O substrato é enrolado em volta da parte cilíndrica do grampo com a sua ancoragem features sentado na ranhura na parte superior. Em seguida, o substrato é D) Ilustração da plataforma BAXS com os grampos segurando o substrato em lugar protegido usando os parafusos que empurram o substrato / ancoragem recursos para o topo groove.. A inserção mostra uma visão detalhada do substrato com células ligadas a ele sentado logo acima uma lamínula ea objetiva do microscópio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Lista de materiais da membrana e o seu sistema de aperto. Desenhos mostram as dimensões das partes principais integrado para a plataforma biaxial para efectuar experiências com células de alongamento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Examplo de um sistema de fixação para a avaliação da rigidez dos vasos de pequeno calibre. AB) Imagens detalhadas do sistema de fixação usado para induzir deformação de 1 mm de diâmetro rato aorta. Pinos de aço inoxidável, foram cuidadosamente moldadas em triângulos abertos para permitir que o navio para deslizar em ambos os pinos C) Ilustração da plataforma BAXS com os grampos de segurar o recipiente e uma célula de carga ligado entre o motor e fixo o grampo esquerdo.. A inserção mostra uma vista de cima e pormenorizada do recipiente montado sobre os pinos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PDMS</td>
			<td style="width:155px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:255px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">FluoSpheres fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">F8810</td>
			<td>Keep away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Linear voice coil</td>
			<td style="width:155px;">Moticont</td>
			<td style="width:255px;">LVCM-051-051-01</td>
			<td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Ball bearing slide</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">NT37-360</td>
			<td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">linear positioning stage</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">38-960</td>
			<td>Center Drive 1.25&#34; Square Linear Translation Stages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">optical encoder</td>
			<td style="width:155px;">GSI microE systems</td>
			<td style="width:255px;">Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td>
			<td>reflective incremental encoder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">motion controller</td>
			<td style="width:155px;">Galil</td>
			<td style="width:255px;">DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td>
			<td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">load cell&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Honeywell</td>
			<td style="width:255px;">31 low</td>
			<td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Insect minutiens pins (0,20mm)</td>
			<td style="width:155px;">Pin Service Austerlitz Insect pins</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SU-8 2050</td>
			<td style="width:155px;">Micro Chem</td>
			<td style="width:255px;">SU-8 2050</td>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Air-plasma treatment system</td>
			<td style="width:155px;">Glowresearch</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Autoglow Oxygen Plasma System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A10483-01</td>
			<td>Collagen I, Rat Tail 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">R37605</td>
			<td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">KHLV-0504/(10)-P</td>
			<td>28V flexible heaters; can be supplied with a 24V</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">CN63200-R1-LV</td>
			<td>Temperature controller; supply 24 V.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">DMEM culture medium</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3024301</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SV30010</td>
			<td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3039603C</td>
			<td>Keep frozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Trypsin 0,05%</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH30236,02</td>
			<td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hepes</td>
			<td style="width:155px;">Wisent Inc</td>
			<td style="width:255px;">330-050-EL</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP358-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">KCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP366-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">MgSO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">M65-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C614-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dextrose</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP220-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP328-1</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP362-500</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">Carbogen 95% O2/ 5% CO2</td>
			<td style="width:155px;">Lindle</td>
			<td style="width:255px;">DIN:02154749</td>
			<td>Krebs physiological solution oxygenation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1404</td>
			<td>Microtubules depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cytochalasin-D</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C8273</td>
			<td>Actin filaments depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-&#945;-SMA-FITC</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">F3777</td>
			<td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Picrosirius red stain</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td style="width:255px;">43665</td>
			<td>Used to stain and quantify collagen content</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

As ferramentas que permitem a aplicação de forças mecânicas de células e tecidos, ou que podem quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos têm contribuído significativamente para o entendimento de mechanobiology básico. Estas técnicas têm sido amplamente utilizados para demonstrar como o aparecimento e progressão de várias doenças são fortemente influenciados por estímulos mecânicos. Este artigo apresenta uma plataforma multi-funcional biaxial alongamento (BAXS) que pode estimular mecanicamente células individuais ou quantificar a rigidez mecânica dos tecidos. A plataforma BAXS consiste de quatro motores de bobina de voz, que pode ser controlada de forma independente. As células individuais podem ser cultivadas num substrato flexível que pode ser ligada aos motores que permitem uma para expor as células a campos de deformação complexos, dinâmicos, e variando espacialmente. Por outro lado, através da incorporação de uma célula de carga de força, pode-se também quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos primários, eles são expostos a ciclos de deformação.Em ambos os casos, um conjunto apropriado de braçadeiras devem ser concebidas e montadas para os motores de plataforma BAXS de modo a segurar firmemente o substrato flexível ou o tecido de interesse. A plataforma BAXS pode ser montado em um microscópio invertido para realizar luz transmitida em simultâneo e / ou imagem de fluorescência para verificar a resposta estrutural ou bioquímica da amostra durante as experiências de alongamento. Este artigo fornece detalhes experimentais do projeto e utilização da plataforma BAXS e apresenta os resultados de estudos de tecidos inteiros única célula e. A plataforma BAXS foi usado para medir a deformação de núcleos nas células do rato mioblastos individuais em resposta ao substrato tensão e para medir a rigidez de isolados de rato aortas. A plataforma BAXS é uma ferramenta versátil, que pode ser combinado com vários microscopia óptica, a fim de proporcionar novos conhecimentos mechanobiological nos níveis de tecidos sub-celular, celular e inteiro.

Alongamento celular A plataforma BAXS foi utilizado para investigar a resposta mecânica do núcleo do rato em células individuais de mioblastos (C2C12) exposto a uma deformação do substrato de 25%. Células de mioblastos são encontrados no tecido muscular e estão constantemente expostos a estiramento mecânico e compressão in vivo. As propriedades de forma e mecânicas do núcleo celular têm demonstrado desempenhar um papel importante na regulação da expre...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K visualizações.  University of Ottawa.  Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos. 

Vídeo: A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...