Expressamos agradecimento a Woo-Jin Chang para fornecer os canais trifurcating para DEP atuação e Mitchell Collens por sua ajuda na configuração do equipamento. O trabalho tem sido apoiado pelos EUA através da NSF Grant OISE-0951647 e por Taiwan NSC através Grant 99-2911-1-002-007.

Um diagrama geral da instalação do equipamento é mostrado na Figura 1A. A montagem PCB-amostra é ainda mais detalhado em um esquema de corte transversal na Figura 1B. 1. Preparando Eletrodos PCB: <ol><li> Design de PCB eletrodos para a geometria desejada para gerar um campo elétrico não uniforme. Eletrodo fichas personalizadas PCB podem ser encomendados através de instalações de fabricação comercial (Figura 1C). </li><li> Prepare pré-fabricados eletrodos PCB por arame 16 gauge solda ao final de cada eletrodo metálico impresso (Figura 1D). <ol><li> Coloque o fio na extremidade do eletrodo. Segure o fio no lugar sobre a área de metal do PCB com o ferro de solda quente para aquecer o fio. </li><li> Alimentar uma pequena quantidade de solda no fio aquecido para preencher o fio com solda. </li><li> Após o fio é preenchido com solda, retire o ferro de solda, segurando o fio no lugar enquanto a solda esfria. </li></ol></li><li> Repita o processo de soldagem para cada conexão elétrica sobre o PCB (Figura 1D). </li></ol> 2. Prepare canais microfluídicos: <ol><li> PDMS (polidimetilsiloxano) baseado em canais microfluídicos são preparados com o elastômero PDMS, Sylgard 184 da Dow Corning. Um molde mestre que define os canais geralmente é criado através de processos de microfabricação padrão usando uma placa de silício e fotorresiste SU-8. </li><li> Mix composto de base para agente de cura em uma razão de 10:1 por 5 minutos. </li><li> Despeje o líquido sobre PDMS o molde mestre pré-fabricadas SU-8 e remover as bolhas de ar, expondo PDMS líquido a vácuo por alguns minutos. Repita o processo a vácuo, se necessário remover completamente todas as bolhas. </li><li> Curar o PDMS a 70 ° C por 2 horas. </li><li> Remover laje PDMS com canais microfluídicos do wafer com uma lâmina de barbear, cuidado para não quebrar wafer. </li><li> Furos para a introdução de líquidos e células para dentro do dispositivo microfluídicos. (Nota: Seringa de bombeamento gravidade, ou da tensão superficial de fluxo baseado podem ser usados ​​com DEP). </li><li> Inspecionar o dispositivo micro para garantir que está livre de poeira e detritos. Limpeza do PDMS podem ser facilmente conseguido usando 3M Fita Mágica Scotch. </li><li> Plasma vínculo do PDMS canais microfluídicos para uma espessura No.0 limpo (80-130 mm) lamela. Aqueça a montagem lamela-microfluídicos a 100 ° C por um mínimo de 15 min. </li></ol> 3. Prepare mídia de baixa condutividade: <ol><li> Baixa condutividade media é preparada misturando 8,5% de sacarose + glicose 0,3% (w / v) em água deionizada (DI) 1. Nota:. Nós já demonstraram que as células podem ser cultivadas durante dias em meio de cultura convencional de células após ser exposto a baixa condutividade por períodos curtos (cerca de 30 min) 11 </li></ol> 4. Montar canais microfluídicos sobre eletrodos PCB: <ol><li> Coloque uma pequena quantidade (aproximadamente 10 mL) de óleo mineral para o PCB para garantir o contato firme entre o PCB ea lamela. Nota: Um passo opcional para diminuir a visualização do eletrodo é para revestir a superfície PCB com uma camada muito fina do marcador permanente preta ou tinta. </li><li> Coloque o conjunto de canais microfluídicos-lamínula sobre o PCB oleada, com lamela contato formando com o óleo (lamínula para baixo). Pressione suavemente a montagem lamela-microfluídicos para baixo para garantir um bom contato e minimizar bolhas de ar que pode prejudicar a visualização celular e talão. Um exemplo do dispositivo completo é mostrado na Figura 1D. </li></ol> 5. Concentre-se classificar e Contas e células usando DEP: <ol><li> Preencher os canais microfluídicos com água DI ou de baixa condutividade media; o processo de colagem plasma facilita o carregamento fácil de soluções aquosas nos canais microfluídicos temporariamente tornando o normalmente hidrofóbico da superfície hidrofílica PDMS. </li><li> Introduzir células e / ou esferas de poliestireno no reservatório canal (Figura 1C). Aqui usamos adenocarcinoma de cólon humano (HT-29) células. </li><li> Ligue a saída de um gerador de função para a entrada de um amplificador de potência AC, então conecte a saída do amplificador para os fios dos eletrodos. Cobrir todos os fios elétricos e superfícies da instalação com fita isolante para proteger os usuários da eventual exposição aos choques. Um diagrama esquemático da configuração do equipamento é mostrado na Figura 1A. </li><li> Ajuste o gerador de função para produzir uma saída de onda senoidal de 1,0-1,5 MHz. A amplitude da saída deve ser ajustado para o amplificador de potência RF para produzir uma saída de 80-100V para o PCB. O amplificador de potência RF neste trabalho requer uma tensão de entrada em torno de 220-330 mV. Em celas separadas e contas, a taxa de fluxo laminar deve ser compatível com a força DEP para mover as células e os grânulos dentro do canal principal (largura w = 100 mm, altura h = 27 mm) para os canais de destino (largura w = 100 mm , a altura h = 27 mm). Atenção: consultar com o fabricante para determinar o PCB mtensões de operação aximum para evitar problemas, tais como PCB superaquecimento ou de fusão. Verifique as especificações dos fabricantes de equipamentos &quot;para o gerador de função e fabricantes de amplificador de potência para determinar as configurações de operação segura. </li><li> Iniciar DEP às células classificar e miçangas. Células experiência positiva-DEP enquanto esferas de poliestireno uma experiência negativa DEP em um campo não-uniforme dentro das freqüências especificadas. Isto permite-force-DEP ativada bioactuation e separação de células e outras partículas dentro de dispositivos microfluídicos usando PCB acessível e reutilizável como eletrodos. </li></ol> 6. Resultados representativos: Quando a DEP é eficaz em células de atuação ou partículas, um alinhamento forte dentro não uniforme campos elétricos é observado para banhos estáticos ou velocidades de fluido lento. Em condições de maiores velocidades de fluidos, o comportamento das células ou partícula depende da orientação relativa do fluxo axial para o campo elétrico ea velocidade do fluxo. Além disso, os comportamentos de células e partículas são também depende da intensidade do campo elétrico e do grau de não-uniformidade dentro do campo elétrico. Comportamentos típicos de células ou partículas include &#39;cadeias de pérola &quot;, ciclismo, enrolando, ou virar. Condições que comprometam ou abolir DEP incluem a presença de sais ou outras moléculas no líquido iônico, intensidade do campo elétrico fraco,, velocidades de fluxo excessivo, lamelas que são muito espessas, ou soluções condutoras entre as lamelas e eletrodos PCB (por exemplo, uma lamela rachados podem induzir a mistura de água e óleo mineral). Aqui, quando se utiliza No.0 lamínulas espessura (80-130 mm) e um espaçamento entre os eletrodos de (231 mm), o gradiente do quadrado da intensidade do campo elétrico aplicado ao HT-29 células e contas é estimada em entre 2 -8 a 6 -8 V 2 m / 3 1. A força DEP pode ser estimado através da medição da velocidade da partícula, manipulados por DEP no fluido estático (Figura 2A-B). Devido à inércia da partícula pequena e ambiente altamente viscoso do canal de microfluídica, a força de arrasto hidrodinâmico será igual, mas em sentido oposto com a força DEP. A velocidade média no talão de baixa condutividade media é 34,5 mM / s com DEP tensão de 93 Vpp e 1,5 MHz. A força de arrasto hidrodinâmico pode ser calculada com a seguinte equação 1. F = drag 6πηRv A média viscosidade η dos meios de comunicação de baixa condutividade a 20 ° C é de 1,27 mPa • s eo raio R talão é de 7,5 mM. A força de arrasto hidrodinâmico para o microbead poliestireno é estimada em 6,19 pN. Para demonstrar a capacidade de atuar dentro de contas canais microfluídicos (Figura 2C-F), iniciamos o fluxo dos meios de comunicação de baixa condutividade, empregando superfície mediada pelo fluxo de tensão. A velocidade média do grânulo no canal de entrada única foi 1.540 M / s, enquanto que a velocidade média dentro dos canais individuais foi reduzida para 565 M / s (Figura 2C). Ao iniciar DEP, as contas foram mantidas dentro do canal central ao invés de ser liberado para o canal lateral. Assim, sob essas condições, as forças DEP foram suficientes para superar a força de arrasto do fluido nos dois canais laterais. O mesmo princípio foi usado também para desviar as contas do canil central para um canal único lado simplesmente mudando a orientação dos canais e do fluxo de contas para que os eletrodos de DEP (Figura 2E-F). Ao dobrar o eletrodo de metal no lado do canal de entrada única, quando a DEP foi iniciado, as contas foram guiados para o lado do canal, como as contas aproximou-se do ponto de trifurcação. Lá, as forças DEP foram suficientes para puxar as contas em um dos canais laterais, onde o fluxo laminar continuou a impulsioná-los para baixo o canal (Figura 2F). Porque as células e esferas de poliestireno têm diferenças em sua capacidade de ser polarizada e atuado em países não-uniforme campos elétricos, usamos DEP para demonstrar a capacidade de realizar a separação on-chip de células e contas, ao mesmo tempo. Usamos a estrutura de canais microfluídicos mesmo PCB e eletrodos, conforme configurado na Figura 2E-F, mas introduziu uma suspensão de células HT-29 e contas da condutividade de baixa media para o canal de entrada simples (Figura 3). Quando a DEP é introduzida, e sob essas condições, o HT-29 células foram mantidas nos dois canais de saída esquerdo enquanto que as contas foram retidos no canal de saída individual na direita. Aqui as células mostram o comportamento de uma característica &quot;pérola-chaining&quot;, como são coletadas no canal de saída esquerdo. Ocasionalmente, um cordão e células se tornam ligados em conjunto em que estão reunidos, muitas vezes nos canais de saída da célula. A partir desta experiênciaal dados, determinar a taxa de classificação a ser 713 partículas (células e esferas) por minuto, ou o equivalente a 14.260 células e contas em 20 minutos. O número de células e os grânulos recuperados é relevante e útil para a biologia molecular, imagem, na bioquímica e lab-on-a-chip aplicações. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCB baseado DEP de células e partículas em canais microfluídicos. (A) A configuração do equipamento para a DEP baseada em atuação começa com um gerador de função para definir a freqüência e amplitude do sinal elétrico, em seguida, um amplificador de potência para aumentar a intensidade do sinal da campo elétrico gerado no PCB. (B) O conjunto de dispositivos microfluídicos para atuação amostra é constituída por canais microfluídicos PDMS irreversivelmente ligado a um não. 0 espessura lamela (80-130 mm) através de plasma de oxigênio, não condutor de mídia para banhar-se nas células e / ou contas. (C) Os eletrodos PCB usados ​​aqui duas regiões de onde os eletrodos são interdigitados para gerar um campo não-uniforme elétrico forte. (D) O dispositivo completou: um PCB com um dispositivo trifurcadas microfluídicos em uma lamela única, inset mostra todo o dispositivo com fios de eletrodo. (CD) Por escala, as medidas são 8,4 centímetros PCB (l), 2,1 cm (w), com 5 mm de largura eletrodos. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Imagens representativas das células e contas em canais antes e durante DEP atuação. (A) 15 mm esferas de poliestireno fluorescentes em a-baixa condutividade solução de mídia dentro de um canal microfluídicos PDMS, sem fluxo laminar (tempo decorrido, 1,23 seg). (B) Após a DEP iniciação, as contas migram para os padrões de eletrodo PCB (listras pretas) ao invés de entre os eletrodos (tempo decorrido, 8,18 seg). (C) Contas na mesma via, sob fluxo laminar são divididos entre os três canais separados (tempo decorrido, 5,3 seg); quando a DEP é iniciada (D), as contas são acionados a fluir apenas no canal central (tempo decorrido, 4.3 sec). (E) Ao alterar a orientação dos canais para os eletrodos PCB, esferas podem ser diferencialmente direcionada para os canais laterais (F), utilizando DEP em vez do canal central como mostrado em (D). (EF) Tempo decorrido é 8,23 seg e 5,16 segundos, respectivamente. Todas as barras de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagens representativas das células e contas em canais antes e durante DEP atuação. (AB) Antes de iniciar DEP, uma solução mista de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29) e fluxo de células contas de um canal para três canais de saída separados. A seta aberta identifica a direção do fluxo laminar e os canais são delineadas com linhas tracejadas para orientação e esclarecimento. (CD) Por DEP induzindo, pérolas e as células são seletivamente acionados em canais separados, identificados. HT-29 células de saída do canal central e esquerdo enquanto esferas de sair do canal direito. Encadeamento de pérolas característica de contas e células é observada durante DEP atuação. (A, C) Diferencial de imagem Contraste de Interferência de células e contas em microcanais torna as contas facilmente visível. Glow Images escala de intensidade (B, D) das mesmas imagens DIC (A, C) melhorar a visualização de células em canais. Os eletrodos de metal reflexivo ((A, C) faixa de luz e (B, D) amarelo e verde) oferecem um marco histórico importante para o alinhamento de microcanais para os eletrodos para atuação DEP baseada eficaz. Barra de escala = 100 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Manipulação de células em dispositivos microfluídicos é desejável para a ordenação ou colocação seletiva de células individuais ou para estudos populacionais. 2 O fluxo laminar é usado em conjunto com válvulas e bombas para manipular células dentro de dispositivos microfluídicos. No entanto, estes métodos só são desafiadoras e requerem processos de fabricação detalhado e habilidades 3 Centrifugação pode simplificar as exigências para a colocação simultânea de imagens de células, mas é um desafio;. Além disso, a arquitetura de canal para a centrifugação deve ser cuidadosamente considerar ao projetar as manipulações desejadas e considerando efeitos de forças centrípetas. quatro pinças Laser pode ser usado para a colocação de celular, mas o método é caro e não passíveis de high-throughput separação de células. 5 No entanto, DEP tem sido demonstrada como um sistema eficaz de &quot;pinça elétrica&quot; ​​para a colocação de células eficaz, caracterização e manipulação 6,7. Especificamente, a DEP tem sido usado para capturar e classificar seletivamente células para on-chip de processamento de viver e de células mortas, 7-10 e para coleta de células em sensores de ressonância para a medição da massa celular. 11 Nós já demonstraram que, aumentando o DEP vigor em bactérias ou contas acima da força de arrasto fluídica, a concentração on-chip e aprisionamento de esferas de poliestireno e Listeria monocytogenes V7 pode ser realizado. 12 populações mistas de E. coli e L. monocytogenes bactérias também pode ser dirigida e liberado através de pulsos DEP. Além disso, as partículas maiores podem ser diferencialmente capturada e concentrada nos eletrodos com base no tamanho de partículas grandes, enquanto que partículas menores não são de captura, mas são removidos com o fluxo de fluidos 13. Quando as forças DEP não superar as forças fluídicas arrastando as partículas, o talão ou célula não é capturado, mas mudou-se dentro do fluxo de fluidos. Conforme mostrado na Figura 2C, contas pode ser focada na região central do fluxo de líquido suficiente para manter as contas no canal central. Isto pode ser devido ao efeito combinado de partícula para partícula influências dentro do campo elétrico, fluido velocidades superiores a DEP forças arrastando, a combinação destes, ou algum outro efeito indefinido. Avanços mais recentes em contato DEP permitem maximizar a captura e manipulação de células com o campo mínimo exigido, protegendo assim os tipos de células, na maior medida, durante a manipulação do DEP. 1,9 Contactless DEP promessa oferece à comunidade microfluídica para classificação, coleta e posicionamento de células dentro de dispositivos microfluídicos. Nós antecipamos que, com o aumento da procura e implementação de, DEP para a manipulação dentro de dispositivos microfluídicos, novas descobertas e inovações irá expandir a compreensão e influência de forças DEP. PCBs podem ser fabricados por meio de alto volume de processos a um preço acessível com um rápido tempo de resposta de fabricação, tornando-as plataformas de bom para comercialização. Além disso, os PCBs são fáceis de usar e acessível para os cientistas em uma série de disciplinas para manipulações on-chip celular e classificação. Ao projetar o layout do PCB eletrodos, deve-se considerar para a desejada trajetória de partículas / células. Principais fatores a considerar incluem tamanho de partícula e tipo (cordão e / ou celular), tipo de célula, o tamanho de microcanais, velocidade de fluxo, espaçamento entre os eletrodos (que determina a intensidade do campo elétrico), espessura da lamela, ea condutividade do fluido. Esses fatores influenciam a força necessária e disponível para manipular a partícula ou célula, e, finalmente, a eficiência da separação. Nosso protocolo aqui apresentado demonstra uma configuração eficaz para iniciar DEP para micro e separação de células. Para aplicações potenciais, os usuários devem coincidir com a arquitetura do projeto do canal microfluídicos com os caminhos de fluxo desejado para as células e contas, bem como os padrões de eletrodo para otimizar a eficiência para cada aplicação. Espaçamento entre os eletrodos e espessura lamínula pode ser usado de acordo com as diretrizes anteriormente relatados ao projetar o layout de canais microfluídicos 1. A condutividade e permissividade da célula / partícula e da mídia em torno deve ser diferente o suficiente para facilitar DEP positiva ou negativa, mantendo as células intactas. A polaridade do DEP para uma partícula esférica pode ser determinada a partir da parte real de um valor complexo do fator de Clausius-Mosotti seguinte no ω freqüência de tensão DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="Equação 1" /> Equação 1 Neste ε equação, é a permissividade, σ é a condutividade, e ε * é a permissividade complexa. Os índices p e mdenotam a partícula e mídia, respectivamente. Quando uma célula tem uma maior permissividade do que a mídia, ou a parte real do fator de Clausius-Mosotti torna-se positiva, a partícula se torna mais polarizada do que a mídia ao redor. Devido a um campo não-uniforme, a polarização da partícula se torna não-uniforme e isso cria uma DEP positiva (+ DEP) a força que atrai a célula para a região com maior intensidade de campo elétrico. Se uma célula tem uma menor permissividade do que a mídia em torno, ou a parte real do fator de Clausius-Mosotti torna-se negativo, ele será submetido a DEP negativo (-DEP), ea célula é forçado para a região de campo mínima. Se a célula e mídia têm aproximadamente a mesma permissividade complexa, nenhuma força pode ser gerada para manipular a célula. Por esta razão, a água pura é uma mídia preferida para a manipulação de partículas DEP. No entanto, para evitar o estresse osmótico sobre a célula de água pura, media baixa condutividade foi formulado para manter inalterada a condutividade, mas para aumentar a osmolaridade para diminuir o estresse osmótico para as células. Mídia celular convencional cultura ou buffers fisiológicas, tais como DMEM ou PBS, tem alta condutividade, o que não é adequado para a manipulação DEP. Nós também já demonstraram que as células podem ser capturados em sensores com DEP usando meios de baixa condutividade. Após um breve período para adesão celular, a mídia de baixa condutividade pode ser substituído para o meio de cultura de células necessárias para suportar o crescimento de células para dia 11. Pela nossa experiência, partículas fluorescentes são muito brilhantes no que diz respeito à fluorescência de células vivas, portanto, pode ser um desafio para coincidir com a intensidade do grânulo com a intensidade de uma célula viva e fluorescentes. Para melhorar a visualização de ambas as células e as contas, nós usamos a microscopia DIC em um microscópio vertical para geração de imagens de ambos. Para exibir as células e os grânulos, apresentamos os dados em uma escala de intensidade de brilho de imagem, que mantém os dados em um vasto leque de cores para facilitar a visualização. Assim, ao projetar o estudo de interesse, os parâmetros de imagem e recursos devem ser considerados. Em resumo, demonstramos a capacidade de atuar seletivamente grânulos e células em canais separados usando DEP. Com o utilitário crescente de canais microfluídicos para biologia celular, bioquímica e aplicações de bioengenharia, DEP é uma opção desejável para a coleta de células, de colocação e classificação. O PCB fabricação de eletrodos é barato e conveniente, os eletrodos são fáceis de usar, e os tempos de fabricação rápida são ideais para a implementação da DEP.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard 184 kit (PDMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elsworth Adhesives</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>Dow Corning Sylgard</td>
</tr>
<tr>
<td>16 awg hook-up wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Belden</td>
<td>8521</td>
<td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold seal Cover Glass </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>260320</td>
<td>No. 0 thick, 24 x 60 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Miltex Biopsy Punch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>95039-104</td>
<td>Miltex, assorted sizes</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom PCB electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bay Area Circuits </td>
<td>Custom parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>O121-1 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>House DI water supply</td>
<td>None</td>
<td>Use filtered DI water</td>
</tr>
<tr>
<td>D-Glucose Anhydrous Granular AR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals </td>
<td>4912-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose, Crystal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>8360-06 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent polymer microspheres </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Bangs Laboratories</td>
<td> FS07F/9277</td>
<td>15&mu;m Dragon green microspheres</td>
</tr>
<tr>
<td>HT-29 cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-38D</td>
<td>Human colon adenocarcinoma</td>
</tr>
<tr>
<td>Typsin 0.05% EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>25300054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eclipse E600FN upright microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Nikon</td>
<td>Eclipse E600FN </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phantom V310 High-speed imaging camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phantom</td>
<td> V310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX51 upright research microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus </td>
<td>BX51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpotFlex high resolution color camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diagnostic Instruments </td>
<td>FX1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Function generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent </td>
<td>3325A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RF Power amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EIN</td>
<td>2100L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar flow

Dispositivos microfluídicos têm avançado estudos de células, fornecendo um ambiente dinâmico fluídica na escala da célula para estudar, manipulação, classificação e contagem de células. No entanto, a manipulação da célula dentro do domínio fluídico continua sendo um desafio e requer protocolos de fabricação complicadas para as válvulas e eletrodos formando, ou exige equipamentos especiais, como pinças ópticas. Aqui, demonstramos que convencional placas de circuito impresso (PCB) pode ser usado para a manipulação sem contato de células, empregando dieletroforese (DEP) para manipulação de contas e de células em áreas de fluxo laminar para bioactuation, e para celular e talão de separação em microfluídicos multicanal dispositivos. Primeiro, apresentamos o protocolo para a montagem dos eletrodos DEP e dispositivos microfluídicos, e preparar as células para o DEP. Então, nós caracterizam a operação DEP com esferas de poliestireno. Por fim, mostramos resultados representativos de separação de contas e celular em um dispositivo de múltiplos canais microfluídicos. Em resumo, a DEP é um método eficaz para a manipulação de partículas (grânulos ou células) dentro de dispositivos microfluídicos.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Dieletroforese (DEP) é um método eficaz para manipular células. Placas de circuito impresso (PCB) pode fornecer eletrodos de baixo custo, reutilizáveis ​​e eficaz para o contato livre de manipulação de células dentro de dispositivos microfluídicos. Ao combinar PDMS baseado canais microfluídicos com lamelas em PCBs, demonstramos a manipulação de contas e celular e separação dentro multicanal dispositivos microfluídicos.

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.3K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Dieletroforese (DEP) é um método eficaz para manipular células. Placas de circuito impresso (PCB) pode fornecer eletrodos de baixo custo, reutilizáveis ​​e eficaz para o contato livre de manipulação de células dentro de dispositivos microfluídicos. Ao combinar PDMS baseado canais microfluídicos com lamelas em PCBs, demonstramos a manipulação de contas e celular e separação dentro multicanal dispositivos microfluídicos.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bioengenharia

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabricação de dispositivos microfluídicos tridimensional baseados em papel para imunoensaios

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...