Este protocolo descreve nossa tecnologia de austopforese microfluidica que pode ser usada para a rápida e eficiente separação de bactérias Gram-negativas de um meio usando micro contas modificadas por aptámero. Os sistemas de acoustopforese microfluídica permitem a separação das bactérias Gram-negativas com rendimento razoável e isolamento celular sem contato. A austopforese microfluida pode ser otimizada para isolar bactérias de amostras médicas e ambientais.
Para começar, projete um chip de acoustopforese microfluida que coleta contas de PS na tomada alvo e descarta o resto depois de injetar uma mistura de amostra de PS na entrada da amostra. Prepare um chip com as camadas acima e abaixo da camada de silício ligada ao vidro borossilicato. E uma terceira camada de vidro borossilicato, usando anodização, adiciona 1000 volts e 400 graus Celsius.
Conecte um PZT à camada de vidro borossilicato ao longo do canal microfluido usando menos de 10 microliters de adesivo de cianoacrilato. Inocular as bactérias GN e GP em luria-bertani médio e incuba-lo a 37 graus Celsius e 220 revoluções por minuto durante 16 horas. Centrifugar as bactérias cultivadas a 9.056 RCF por um minuto à temperatura ambiente.
Em seguida, lave duas vezes com tampão PBS 1X. Prepare as bactérias GN e GP selecionadas para análise, reutilizando-as no buffer de ligação. Resuspenda a mistura de micromedese revestida de micrometárida antes de usar.
Vórtice a mistura por 20 segundos. Prepare o aptamer desnaturando-o a 95 graus Celsius por três minutos, e depois redobrando-o a zero graus Celsius por dois minutos. Transfira 250 microliters da mistura de micro contas revestida de streptavidin resuspended para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 100 microliters de aptamer de DNA biotinilado ao tubo.
Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos enquanto gira a 25 revoluções por minuto. Centrifugar a mistura de reação a 9.056 RCF por 40 segundos em temperatura ambiente. Em seguida, lave o tubo duas vezes com 200 microliters de tampão Tris-HCl.
Adicione 10 microliters de 100 miligramas por mililitro BSA ao tubo de amostra lavado e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente enquanto gira a 25 rotações por minuto. Finalmente, lave as micro contas modificadas do aptamer duas vezes no buffer Tris-HCl por centrifugação a 9.056 RCF por 40 segundos à temperatura ambiente. Conecte os tubos PEEK às duas entradas para injetar duas amostras e tampão, e as duas tomadas para coleta e descarga de resíduos.
Usando uma seringa de 10 mililitros, encha o canal de aoustopforese microfluidic com água desmineralizada livre de bolhas. Prepare um controlador de pressão de precisão com dois ou mais canais de saída para controlar o fluxo de fluidos. Após o preparo do dispositivo, injete a amostra e o buffer aplicando uma pressão de dois quilopascals na entrada da amostra e quatro quilopascals na entrada do buffer usando o dispositivo de controle de pressão de precisão.
Usando um microscópio, concentre-se em uma conta e mova-a para o centro do canal microfluido usando o PZT. Gere uma frequência de ressonância de 3,66 mega-hertz usando um gerador de função de um único canal e amplie um sinal típico por 16 decibéis usando um amplificador de energia. Observe os processos de separação e enriquecimento no chip acoustofluidic com um microscópio de fluorescência e uma câmera de alta velocidade operando a 1.200 quadros por segundo.
O chip acoustopforético introduzido neste estudo confirmou que, à medida que a tensão do PZT aumentava, a concentração central das contas de 10 micrômetros aumentava. A cinco volts da tensão PZT, a maioria das contas de 10 micrômetros estava concentrada no centro. A razão do número de contas coletadas na tomada para o número total de contas injetadas de 10 micrômetros foi referida como a taxa de recuperação.
A razão do número de 10 contas de tamanho micrômetro para o número total de contas coletadas foi referida como pureza. Os resultados indicaram que o dispositivo tinha alta eficiência de separação para contas com um tamanho de 10 micrômetros. Os números de bactérias GN e GP ligadas a cada micro contas modificadas aptamer foram medidos usando um microscópio com uma câmera de alta velocidade.
Todas as cinco bactérias GN estavam ligadas às contas, enquanto significativamente menos bactérias GP estavam ligadas às substâncias testadas. A força do sinal difere significativamente entre as bactérias GN e GP. O adesivo utilizado para fixar o PZT deve ser usado o mínimo possível para a precisão da corrugação e o PZT e o microcanal devem ser paralelos.
Este dispositivo pode ser usado para detectar bactérias vivas ou biomarcadores derivados de bactérias no período de diagnóstico precoce de doenças infecciosas bacterianas.
