Integrar essa metodologia com microfluidos à base de gotículas ajuda a responder questões-chave relacionadas ao campo da imunologia de sistemas para codificar a heterogeneidade celular e a comunicação entre células únicas ou patógenos. A principal vantagem dessa técnica que desenvolvemos é que este procedimento de carregamento de ponta permite o encapsulamento de células raras em gotículas que correspondem intimamente à distribuição percentual prevista. A demonstração visual deste método é fundamental para compreender como usar dicas de pipeta para carregar células em gotículas de gênero e para recuperar células das gotículas.
Para o carregamento de ponta para a geração aquosa de gotículas, primeiro adicione três mililitros de surfactante a dois mililitros de óleo flourinado e desenhe a mistura da fase do óleo em uma seringa de 2,5 mililitros. Remova quaisquer bolhas de ar da seringa e conecte a seringa a um pedaço de tubo de Teflon de um comprimento apropriado. Carregue duas seringas de amostra com um óleo mineral bicompatível apropriado e conecte a seringa a um segundo pedaço de tubo de Teflon de comprimento apropriado.
Em seguida, perfurar um plugue de polidimimetilatilato de cinco milímetros de diâmetro ou PDMS de uma laje EDMS curada, e perfurar um buraco de um milímetro pelo centro do plugue. Insira o plugue firmemente na extremidade superior de uma ponta de pipeta de 200 microliter e insira a tubulação presa à seringa de óleo mineral bicompatível no plugue. Deprimir lentamente o êmbolo da seringa para encher a ponta da pipeta com óleo mineral empurrando todo o ar residual.
Coloque cuidadosamente as seringas de amostra e a seringa de óleo enfarinhada, em uma bomba de seringa. Quando todo o ar tiver sido removido, abaixe cada ponta de pipeta na solução amostral e aspire cerca de 100 microliters de amostra celular nas pontas. Em seguida, insira ambas as pontas de pipeta contendo amostras nas duas entradas internas do chip PDMS e insira o tubo contendo a mistura da fase do óleo na entrada externa.
Defina as taxas de fluxo na bomba de seringa conforme indicado E digite e defina as dimensões de cada seringa. Inicie a bomba para lavar a solução amostral através dos canais internos do dispositivo e a fase de óleo através do canal externo do dispositivo. Em seguida, conecte um pedaço de tubo de um comprimento apropriado na tomada para começar a coletar as gotículas quando a formação de gotículas estiver estável, coletando as gotículas em um tubo de bloqueio.
Quando todas as gotículas tiverem sido coletadas, adicione 200 microliters de meio RPMI, sem soro, em cima das gotículas e incubar a amostra com o orifício na tampa do tubo de bloqueio para o período experimental adequado. Para quebrar a emulsão, primeiro adicione dois mililitros de PFO a oito mililitros de óleo flouiado e use uma seringa para remover o excesso de óleo do fundo do tubo de coleta de gotículas. Em seguida, adicione 100 microliters de solução 20% PFO à emulsão para liberar as células encapsuladas na fase aquosa, e toque o tubo brevemente para misturar.
Não se esqueça que o PFO pode ser prejudicial para as células. E, portanto, mantenha o contato com pfo ao mínimo. Após um a dois minutos, gire a solução na menor força centrífuga relativa possível por 30 segundos e transfira imediatamente 550 microliters da fração aquosa em um novo tubo bloqueado contendo 500 microliters de PBS frio, complementados com soro de bezerro fetal de 2%, ou FCS.
Deixe qualquer óleo residual afundar até o fundo do novo tubo de bloqueio e transfira cuidadosamente 950 microliters da célula contendo fase aquosa para um novo tubo de bloqueio. Certifique-se de que o óleo não é transferido juntamente com a fase aquosa para o novo tubo de bloqueio. Em seguida, colete as células por centrifugação e suspenda novamente a pelota em 300 microliters de PBS fresco e frio complementado com 2% de FCS.
Usando a abordagem de carregamento de ponta como apenas demonstrado, as taxas de encapsulamento celular Jurkat T coincidentemente com os valores estatisticamente previstos podem ser obtidas. Notavelmente, mesmo com células aderentes como células tumorais, que tendem a se aglomerar, ou células raras, como células dendríticas platicóides, observa-se uma melhor eficiência de encapsulamento. Durante este encapsulamento representativo, as gotículas regeneraram-se usando agarose temperatura de gelagem ultra-baixa e gelou após a produção para formar contas de hidrogel agarose que permitiram a análise subsequente a jusante via microscopia e citometria de fluxo.
A análise microscópica revelou que o emparelhamento celular foi alcançado em diferentes combinações indicativas de alto alcance celular e análise da mesma população de contas de hidrogel por citometria de fluxo, revelou que contas sem células poderiam ser separadas das contas com células baseadas em seus distintos padrões de dispersão para frente e para o lado. De fato, a gating sobre a população de contas sem células confirmou a falta de encapsulamento celular pela ausência de sinais fluorescentes enquanto gating na população de contas com células revelou a existência de múltiplas sub-populações indicativas do encapsulamento de células Jurkat T diferentemente rotuladas. Ao trabalhar com esse método, é importante lembrar que a concentração celular é um fator limitante, e deve ser otimizada para garantir o encapsulamento celular eficiente e o emparelhamento celular.
Após este procedimento, não só uma ou duas células podem ser encapsuladas em gotículas com alta eficiência, mas várias células, ou tipos de células, podem ser encapsuladas para uma replicação mais precisa do micro ambiente celular. Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores das áreas de imunologia e disciplinas relacionadas para a utilização ideal das populações de células cicatrizas e seu encapsulamento eficiente em gotículas, para estudar o comportamento celular em um ambiente livre de ruídos.
