Os autores gostariam de agradecer o laboratório do Prof Anthony Windebank para compartilhar os seus conhecimentos sobre DRG dissecção e cultura, bem como o Prof Shaochen Chen para discussões úteis a respeito da configuração do DMD. Esta pesquisa foi financiada em parte pela Tulane University e subvenções do Conselho de Regentes Louisiana (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) e os NIH (NS065374).

1. Setup DMD <ol><li> A placa DMD, guia de luz UV (com colimador) e lente objetiva de 4x são todos montados verticalmente sobre uma mesa de isolamento de vibração. </li><li> A guia de luz UV deve ser ajustada de modo que a luz atinge a matriz espelho em um ângulo de 45 ° em relação ao plano dos espelhos, e 24 ° abaixo do plano dos espelhos (Figura 1). </li><li> A lente objetiva é montado de modo que a distância do DMD para a lente objetiva corresponde ao comprimento focal associada com a lente. </li><li> Um microscópio invertido é colocado abaixo da lente objetiva, de tal forma que a luz refletida do foco DMD pode ser visualizado através do microscópio. A distância entre a lente objetiva para a superfície de polimerização deve corresponder aproximadamente à distância de trabalho da lente. O estágio no microscópio pode então ser usado para ajustar essa distância para finamente focalizar a imagem. Esta distância pode variar de acordo com a superfície de polimerização escolhido. </li></ol> 2. Constrói dupla Hydrogel de Culturas Remoção Tissue A. adesão explante DRG <ol><li> Revestimento das paredes de 6 bem-colágeno insere célula revestido de cultura (Corning) com X-chuva, tendo o cuidado de evitar a própria membrana. (Como alternativa, uma caneta barreira hidrofóbica pode ser usado.) </li><li> Insere hidratar durante a noite com 1,5 ml de meio de adesão em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. Média de adesão é de médio neurobasal com 10% de soro fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, e 20 mcg / mL NGF. </li><li> Colheita gânglios da raiz dorsal embrionária (DRG) de E-15 filhotes de rato. DRG deve ser banhado em colágeno revestido 6-bem inserções, até quatro por pastilha. </li><li> Incubar inserções por 2 horas para permitir DRG adesão à membrana. </li></ol> B. fotopolimerização máscara dinâmica Um dispositivo de microespelhos digitais (DMD) é uma 1024 x 768 conjunto de espelhos individuais, semelhante ao de televisores de projeção, que reflete a luz seletivamente com base na posição do espelho. Para os nossos propósitos, a DMD é usada para acender padrão de radiação ultravioleta (UV) em hidrogéis photocrosslinkable, criando geometrias hidrogel especificáveis ​​de uma maneira simples e rápida. A Figura 1 mostra a configuração do caminho DMD e luz UV. Embora a nossa DMD é uma unidade autônoma, o dispositivo também pode ser integrado para uso com muitos microscópios existentes. <ol><li> Retire o excesso de líquido de inserir e adicionar 500 mL de meio de polimerização dentro da pastilha. Meio da polimerização contém PEG 10% (1000 MW) e 0,5% IRGACURE 2959 dissolvidos em meio neurobasal suplementada com 20 mg / mL e NGF Pen 1% / Strep. </li><li> Coloque a inserção por baixo do aparelho DMD numa lâmina de vidro chuva X-tratada. </li><li> Carregar a imagem apropriada preto e branco para ser usado como um &quot;fotomáscara&quot; na DMD, através do uso do programa gráfico incluído ALP-3 básicos. Para nossos propósitos, uma forma bifurcando foi escolhido para permitir a implementação de sistemas de orientação neurite. </li><li> Usando um microscópio invertido para visualização, alinhar os explantes de tecido com o local apropriado no fotomáscara usando uma fonte de luz visível, refletindo a DMD. </li><li> Mudar a fonte de luz visível para a fonte de luz UV, e iluminar a solução PEG até crosslinking é suficiente. (Para as condições dadas e 5,0 Watts / cm 2 incidente sobre a DMD, de reticulação pode ser concluída em menos de 55 segundos.) Repita o procedimento para todos os DRG quatro no insert. </li><li> Lave cada inserir três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Adicionar 1,5 ml meio de crescimento abaixo do inserções cultura de células, e deixar equilibrar em uma incubadora por 30 minutos. Meio de crescimento é médio neurobasal contendo B-27 2% Pen, 1% / Strep, 0,5 mM L-glutamina, e 20 mcg / mL NGF. </li></ol> C. hidrogel Secundária Puramatrix <ol><li> Para aplicações neuronal, Puramatrix 1% é diluída de acordo com as instruções do fabricante para 0,15% em estéril H 2 O e suplementado com 1 laminina mcg / mL solúvel. </li><li> Todos os meios em excesso devem ser removidos dos vazios PEG, que contêm os explantes DRG, usando um aplicador de ponta de algodão esterilizado, Kimwipe, ou micropipeta. </li><li> Puramatrix é adicionado ao vazios PEG com uma micropipeta, a fim de preencher o espaço vazio, sem transbordar. Dependendo do volume vazio, tipicamente ~ 1 mL é usado por construir. </li><li> Puramatrix começa o processo de auto-montagem imediatamente após o contato com uma solução salina fisiológica, ou seja, o PEG inchado, mas 1,5 mL de meio de crescimento é adicionado abaixo da inserção e colocado na incubadora por uma hora para garantir a gelificação total. </li><li> Inicialmente, Puramatrix é ligeiramente ácido, por isso alterar a mídia depois de uma hora para permitir que o pH para equilibrar. </li><li> Mudanças de mídia são necessários aproximadamente a cada 48 horas. Tenha cuidado para que toda a mídia éadicionada por baixo da inserção, para proteger a integridade de Puramatrix mecanicamente fraco. </li></ol> Agarose <ol><li> Para aplicações neuronal, agarose é diluída para uma solução a 1% em meio de crescimento e colocado em banho-maria a 60 ° C até a agarose dissolve completamente (~ 1 hr). A solução é, então, suplementado com 1 mg / mL laminina solúveis. </li><li> Todos os meios em excesso devem ser removidos dos vazios PEG. </li><li> Agarose é adicionado ao vazios PEG, a fim de preencher o espaço vazio, sem transbordar. Dependendo do volume de vazio, tipicamente ~ 1 mL é usado por construir. </li><li> 1,5 mL de meio de crescimento é pré-refrigeradas (8 ° C) em uma placa de 6 poços, e as pastilhas contendo agarose são transferidos para a mídia refrigerado e mantido em geladeira a 8 ° C por pelo menos três minutos para permitir que a agarose gel. </li><li> Finalmente, as inserções são transferidos para 1,5 mL de pré-aquecido meio de crescimento (37 ° C) e mantido na incubadora a 37 ° C, com mudanças mídia necessária a cada 48 horas. </li></ol> 3. Dupla Hydrogel encapsulamento de células em 3D Encapsulamento hidrogel dupla é apropriado quando se usa qualquer gel de auto-montagem. O gel photocrosslinkable, neste PEG caso, serve como um suporte estrutural para a apresentação geométrica do gel de auto-montagem, por exemplo Puramatrix ou agarose. Alguns dos métodos, especificamente o tipo de gel e escolha de fotomáscara, vai depender da aplicação específica desejada. <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. Para a nossa sobrevivência celular, aplicação, nós simplesmente escolhemos uma apresentação cilíndrica de Puramatrix para ajudar na criação de imagens de células. Pesquisadores que estudam a sinalização celular poderia estar interessado em uma geometria compartimental para permitir a difusão de moléculas quimiotáticas. Além disso, uma aproximação grosseira de uma artéria foi mostrado para representar possível aplicação para a investigação dos vasos sanguíneos. </li><li> Tratar as paredes de uma inserção da cultura de células de poliéster com Rain-X, e de local em DMD no slide Rain-X revestido. </li><li> Adicionar 500 mL de meio de polimerização para a inserção. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV por 55 segundos. </li><li> Lavar três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Remova toda a mídia em excesso dos vazios PEG. </li><li> Spin down células na densidade desejada em um pellet. Cuidados devem ser tomados para remover todas as médias do pellet de células antes da mistura, como Puramatrix começa a auto-montagem imediatamente após o contato com uma solução salina. Suspender as células dentro Puramatrix 0,15% diluído em H 2 O estéril suplementada com sacarose 10%. </li><li> Injetar o Puramatrix / célula / sacarose mistura dentro vazios em PEG. </li><li> Adicionar 1,5 mL de meio de crescimento abaixo da inserção, e deixe gel dentro da incubadora por uma hora. </li><li> Alterar mídia após uma hora, e ~ a cada 48 horas depois. </li></ol> 4. Hidrogel único encapsulamento de células em 3D Um único encapsulamento hidrogel seria apropriado para qualquer situação onde as células podem ser examinados dentro de um hidrogel photocrosslinkable. <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. Para estudos de sobrevivência da célula, mais uma vez escolheu uma máscara circular básicos para representar um cilindro. Máscaras semelhantes às mostradas no método 4 poderia voltar a ser aplicada para o campo de pesquisa apropriado. </li><li> Tratar um poliéster inserir cultura de células com Rain-X, e de local em DMD no slide Rain-X revestido. </li><li> Células em qualquer concentração desejada pode ser adicionado diretamente à solução de PEG 10%, misturando bem para garantir a distribuição homogênea. </li><li> Adicionar 500 mL de meio de polimerização para a inserção. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV por 55 segundos. </li><li> Lavar três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. </li><li> Preencha com o meio de crescimento ambos abaixo e em cima do insert, mudando a cada ~ 2 dias. </li></ol> 5. Polimerização Hydrogel Thin Film <ol><li> Carregar uma máscara adequada na DMD. </li><li> Tratar uma colágeno revestido de poliéster inserir cultura de células com chuva X-, e colocar no slide Rain-X revestido. </li><li> Adicionar meio da polimerização suficiente para apenas cobrir o fundo da inserção (~ 250-300 mL para inserções 6 bem-plate). Permitir que os meios de comunicação a permear a membrana de inserção para 30-45 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova o meio de polimerização em excesso da pastilha com uma micropipeta ou Kimwipe. Adicionar uma quantidade suficiente de UV-transparente do petróleo para cobrir completamente a parte inferior da pastilha. Permitir a inserção de sentar para 15-30 minutos em temperatura ambiente, tempo suficiente para que o óleo forma uma camada distinta acima do meio da polimerização saturando a membrana de inserção. </li><li> Coloque a inserção e deslize sob a DMD. Induzir a reticulação PEG pela exposição à luz UV. Devido à pequena espessura da camada PEG, de reticulação pode ser concluída em menos de 15 segundos a 5,0 Watts / cm 2 incidente sobre a DMD. </li><li&gt; Lave a inserir três vezes com DPBS estéril e 1% Pen Strep. (Se a persistência de um resíduo oleoso é uma preocupação, um detergente suave, como Tween 20 (1%) pode ser adicionado ao tampão de lavagem). </li><li> Armazenar os inserir em uma placa de cultura de 6 bem tecido. Adicionar meio de crescimento para as células em suspensão, na concentração desejada, e pipetar um volume suficiente de suspensão de células dentro do insert de cultura de células para obter a densidade de célula desejada. Em seguida, adicione meio de crescimento bastante abaixo da inserção para manter a viabilidade celular completamente (~ 1,5 mL). </li><li> Após 48 horas se passaram, lave a inserir três vezes com DPBS estéril e 1% Pen-Strep para desalojar quaisquer células unadhered. Alterar media aproximadamente uma vez a cada 48 horas. </li></ol> 6. Resultados representante Exemplos de hidrogel contendo dupla constrói explantes DRG são mostrados na Figura 2. Observe que a migração celular e extensão neurite está limitada à região de células permissivas do hidrogel dupla construir. A Figura 3 mostra células dissociadas encapsulado dentro da mesma forma as construções de hidrogel dual. Devido à natureza dinâmica do fotomáscara DMD, a geometria disponíveis para encapsulamento é limitada apenas pelas dimensões e resolução da óptica. Encapsulamento de células foi também possível dentro de um hidrogel único fotopolimerizável, PEG, e um teste de viabilidade ao vivo / morto foi realizada conforme evidenciado na Figura 4. Encapsulamento em PEG destina-se apenas como um exemplo, como PEG não representa um ambiente ideal para células neurais. Portanto, a viabilidade celular realizado em construções de nossa PEG é compreensivelmente baixo. Finalmente, utilizando exemplos de filmes PEG fina como uma camada padrão restritivo para adesão celular em inserções de cultura de células são mostrados na Figura 5. Além disso, exemplos de possíveis &quot;maus&quot; resultados são oferecidas na Figura 6. Os resultados representam apenas uma pequena fração dos possíveis usos dos métodos desenvolvidos em nosso laboratório. Elas são destinadas a demonstrar a facilidade, versatilidade e viabilidade de nossa abordagem, e poderia ser tratado como &quot;prova de princípio&quot; para os pesquisadores a desenvolver seus próprios possíveis adaptações. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ilustração esquemática do caminho de luz usado para fotolitografia. Detalhe: A luz UV ilumina a DMD em um ângulo de 45 ° e 24 ° abaixo do plano da matriz espelho. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rotuladas de crescimento e proliferação de construções de hidrogel contendo DRG dual. AD) Imagens que retratam construções polimerizado PEG (cinza) com neurites rotulados com Beta-tubulina III (verde), núcleos de células manchadas DAPI (azul). Os explantes DRG estão contidos em Puramatrix e localizados nas regiões circular do padrão, com neurites crescente para a bifurcação (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Constrói hidrogel duplo contendo células marcadas com calceína AM, um marcador de células vivas, após 48 horas em meio de crescimento. AD) formas PEG Various, cheio de Puramatrix contendo neurônios dissociados DRG (~ 5x10 3 células / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Hidrogel única construção que contém células vivas rotulados com calceína AM (verde) e células mortas rotulados com homodímero de etídio-1 (vermelho) após 24 horas em meio de crescimento (5x10 3 células / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. PEG celular restritivas polimerizado como um filme fino utilizando um &quot;padrão de teste&quot; para seletivamente células dissociadas aderir à membrana de colágeno revestido de suporte permeável. A, B) células vivas são rotulados depois de 48 horas com calceína AM (verde), enquanto as células mortas são rotulados com homodímero de etídio-1 (vermelho). Adesão celular mínima ocorre na área do PEG contendo o filme fino. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Imagens representativas de resultados indesejáveis. A) polimerização parcial de PEG, levando a um PEG inutilizável construir. Polimerização inadequada pode ocorrer devido à presença de um menisco no meio de pré-polímero, quantidades insuficientes de meio da polimerização, a exposição UV insuficiente ou inadequada foco da óptica. B) Imagem retratando construções polimerizado PEG (cinza) com neurites rotulados com Beta-tubulina III (verde), núcleos de células manchadas DAPI (azul). O neurites foram capazes de crescer fora dos canais padronizados PEG. Isso geralmente ocorre na condição de que transborda Puramatrix em cima da porção PEG durante a injeção.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui pode ser usado por qualquer pesquisador que procuram sistemas de cultura de células simples e reprodutível. Teoricamente, devido à grande variedade de hidrogéis fotopolimerizável disponíveis, o ambiente pode ser adaptado para permitir o uso com qualquer tipo de célula, incluindo explantes tecido inteiro. Além disso, o sistema de hidrogel dupla permite o controle espacial melhorada na apresentação de auto-polimerização hidrogéis, que tendem a formar formas amorfas por conta própria. O resultado do &quot;2.5D&quot; constrói hidrogel micropatterned fornecer uma matriz 3D para o crescimento neural apresentado em uma configuração 2D que permite a avaliação microscópica conveniente. O substrato sobre o qual os géis são polimerizados também podem ser variadas, permitindo maior controle no delineamento experimental. Nossos métodos são otimizados para uso com suportes de cultura de células permeáveis, como vimos melhoria da viabilidade (Figura 4), em comparação com a polimerização em lâminas de vidro (dados não mostrados). No entanto, outras superfícies de polimerização pode ser mais aplicável para diferentes aplicações: fabricação em lâminas de vidro utilizado em experimentos microfluídica ou formações agregado de células, por exemplo. Nossa experiência com esses sistemas de cultura levou à identificação de áreas potenciais de dificuldade. Primeiro, as técnicas de cuidado são necessários para manter a esterilidade das construções. Devido à natureza volumosos da configuração do DMD, é difícil de operar as etapas de polimerização sob condições estéreis. Para combater este problema, a etapa de lavagem descrito nos métodos é útil, e os antibióticos devem ser usados ​​em todas as mídias. Além disso, a espessura final e forma da construção polimerizado é altamente dependente do comportamento do fluido da pré-mistura de polímeros, ea presença de um menisco pode resultar em construções de gel que são muito finas ou incompleta polimerizadas (Figura 6). Dois passos podem ser tomadas para minimizar a formação de um menisco no interior insere cultura de células. Para hidrogéis de espessura (&gt; 200 mm), um revestimento simples de X-Chuva volta a parede interna da pastilha é suficiente. No entanto, como brevemente descrito acima, para construções finas (&lt;200 mm), uma camada de óleo é necessária para minimizar tanto o menisco e nega extinção de oxigênio da polimerização de radicais livres. Resolução foi encontrado para ser dependente de espessura, com uma diminuição no tamanho do recurso cada vez mais realizado com gel mais espesso. A resolução também variou dependendo se o recurso representou um alívio positivo ou negativo no hidrogel. No entanto, conseguimos uma resolução suficiente para construções com tamanhos traço mínimo na escala de ~ 100 mm usando objetivos microscópio apenas como foco óptica. Nossos experimentos mostraram que o hidrogel dupla constrói aqui descritos representam uma excelente base para a formação de base in-vitro modelos de crescimento neurite e orientação. A técnica empregada micropatterning é uma adaptação dos métodos existentes 18,19, mas o nosso set-up enfatizou uma concepção simples de implementar e foi otimizado para a produção de construções de hidrogel dupla insere em cultura de células; insere cultura de células foram vitais para melhorar a viabilidade das células, assim como crosslinking torno explantes tecidos anteriormente aderente. O alcance dos resultados apresentados é limitada pelos interesses de nosso laboratório, no entanto, acreditamos que os métodos descritos nesta publicação serão úteis para os pesquisadores à procura de um método relativamente barato, rápido e fácil de usar para a fabricação de cultura celular 3D modelos.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Cada vez mais, ambientes de cultura de células padronizadas estão se tornando uma técnica relevante para estudar características celulares, e muitos pesquisadores acreditam na necessidade de ambientes 3D para representar experimentos in vitro que imitar melhor em qualidades vivo 1-3. Estudos em áreas como a pesquisa do câncer 4, engenharia neural 5, fisiologia cardíaca 6, e célula-matriz de interação 7,8 têm mostrado o comportamento das células difere substancialmente entre as culturas tradicionais monocamada e construções em 3D. Hidrogéis são utilizados como ambientes 3D devido à sua diversidade, versatilidade e capacidade de composição molecular sob medida através de funcionalização 9-12. Numerosas técnicas existem para a criação de construções como células de suporte matrizes, incluindo electrospinning 13, selos de elastômero 14, impressão jato de tinta 15, photopatterning aditivo 16, fotomáscara estática litografia de projeção-17, e microstereolithography máscara dinâmica 18. Infelizmente, esses métodos envolvem várias etapas de produção e / ou equipamentos não é facilmente adaptável a célula e métodos convencionais de cultura de tecidos. A técnica empregada neste protocolo adapta os dois últimos métodos, usando um dispositivo de microespelhos digitais (DMD) para criar máscaras dinâmicas para crosslinking geometricamente específicas poli (etileno glicol) (PEG) hidrogéis, induzida através da polimerização UV iniciada de radicais livres. O resultado do &quot;2.5D&quot; estruturas de fornecer um ambiente restrito em 3D para o crescimento neural. Nós empregamos uma abordagem dual-hidrogel, onde PEG serve como uma estrutura de células-região restritivas para fornecer uma outra maneira disforme, mas células permissivas gel auto-montagem feita a partir de qualquer Puramatrix ou agarose. O processo de fabricação é uma etapa rápida e simples um que é altamente reprodutível e facilmente adaptado para uso com métodos convencionais de células de cultura e substratos. Explantes tecido inteiro, como gânglios da raiz dorsal embrionária (DRG), podem ser incorporadas ao hidrogel constrói dupla para ensaios experimentais, tais como crescimento de neuritos. Além disso, células dissociadas pode ser encapsulado no hidrogel photocrosslinkable ou auto-polimerização, ou seletivamente aderidas à membrana suporte permeável usando células-restritivas photopatterning. Usando o DMD, criamos hidrogel construções até ~ 1 mm de espessura, mas de película fina (&lt;200 mm) estruturas PEG foram limitados pela têmpera de oxigênio da reação de polimerização por radicais livres. Nós posteriormente desenvolveu uma técnica utilizando uma camada de óleo acima do líquido de polimerização que permitiu a polimerização estrutura fina PEG. Neste protocolo, descrevemos a criação rápida de sistemas de hidrogel 3D para a produção de células neurais e microfabricated culturas de tecidos. As construções de hidrogel dupla demonstrou aqui representam versáteis modelos in vitro que podem ser úteis para estudos em neurociência que envolvem a sobrevivência da célula, migração e / ou crescimento neurite e orientação. Além disso, como o protocolo pode funcionar para muitos tipos de hidrogéis e células, as possíveis aplicações são variadas e vastas.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K visualizações.  Tulane University. Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabricação e Implantação de miniatura de elemento duplo Medidores de tensão para medição<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinal Contrações em roedores.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

A transfecção Gene direção Células Spheroid em placas micropadronadas Cultura para Transplante de Células geneticamente modificados

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...