Este trabalho foi financiado pela Fundação Coulter, Fundação Beyster, a oportunidade de Pesquisa de Graduação (UROP) programa de verão para ATA e um National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant DGE não 0718128; ID:. 2010101926) para JBW.

1. Caracterização fase do sistema: Limiares determinante para a Separação de Fase <ol><li> Preparar soluções contendo PEG e DEX no tampão desejado, ou meio de cultura celular, como mostrado na Figura 1 (pontos roxos) em 15 ml ou 50 ml de tubos cónicos. Daqui por diante, o PEG e DEX se referirá a 35 kDa PEG e DEX 500 kDa, no entanto, concentrações críticas vão mudar dependendo dos dois polímeros usados. Registar a massa de PEG e DEX em cada solução. Soluções de alta concentração de polímeros pode levar várias horas para dissolver. Vórtice pode ser utilizado para as soluções isentas de soro. Para meios contendo soro ou proteínas, colocar os tubos em um estágio de balanço até que ambos os polímeros são completamente dissolvido. Registar o peso dos meios de comunicação utilizados para dissolver os polímeros e tomar nota das concentrações iniciais. </li><li> Uma vez que os polímeros estão completamente dissolvidos, as soluções devem aparecer turva. Esta é a primeira indicação de que a separação de fases ocorreu. Para confirmar isso, permitir que osoluções de polímero a descansar numa posição vertical à temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugação a 1000 xg pode ser utilizado para acelerar o processo de separação de fases. A fase inferior mais densa será DEX-rico e a fase de topo será PEG-rico. </li><li> Lentamente, adicionar tampão adicional ou de mídia para os tubos. Pequenos incrementos deverá ser utilizado de modo a não ultrapassar o ponto de separação de fases. </li><li> Quando a solução torna-se clara e não se separa da fase após a centrifugação, o limiar para a separação de fases foi atingido. Registar o peso final do tubo. </li><li> Utilizando os pesos anteriores registadas para os polímeros, juntamente com o peso final após a adição de meios de comunicação, determinar a% em peso / peso de cada um dos dois polímeros em que a separação de fase não ocorre. </li><li> Traçar estes valores como PEG% p / p sobre o eixo y e% wt / wt DEX sobre o eixo x. Esta trama, conhecido como a curva binodal, pode ser usado para determinar a concentração de limiar de separação de fases para Concentrati diferenteComplementos de PEG / DEX em um meio de cultura de células específico. </li></ol> 2. Configuração 1: Padronização de exclusão (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparar soluções separadas de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células. Use ATPS soluções de pelo menos duas vezes o ponto crítico para assegurar que um ATPS permanece após os polímeros de equilibrar-se com respeito ao outro. Há uma pequena quantidade de fluxo de DEX para a fase rica em PEG e vice-versa, por isso, trabalhar muito perto da concentração crítica pode resultar em perda de fase do sistema em termos de concentração gota abaixo do ponto crítico. Da mesma forma, a transferência da placa de cultura de células para uma incubadora com humidade e temperatura controlada pode alterar as propriedades de duas fases e tornar as duas soluções miscíveis. Nota: Algumas células podem ter um melhor desempenho com outras formulações ATPs. Formulações aceitáveis ​​podem ser seleccionados com base nas curvas de binodais determinados a partir da parte 1. </li><li> Colheita das células a serem usadas para a exclusão patterning. Determinar o número total / concentração de células disponíveis. Opcional: rotular as células com CellTracker ou outros não-citotóxicos rótulos para microscopia de fluorescência. </li><li> Agregar as células e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células por exclusão. Por exemplo, um poço de uma placa de 96 poços requer 37500 células de fibroblastos de ser ressuspensas em 200 ul de PEG para produzir confluência no dia seguinte. Dimensionar estes números como apropriado para outros tipos de células e tamanhos de substratos de cultura. </li><li> Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Gotas maiores volumes maiores produzem zonas de exclusão. Que variam em tamanho de gotículas 0,1-1 ul são recomendados para micropatterning exclusão. Opcional: DEX gotículas podem ser depositados 24 hr antes do tempo permitido para desidratar e à temperatura ambiente. Isso pode produzir padrões mais limpas. </li><li> Pipetar 200 ul de suspensão de células em PEG tele bem para cobrir as gotículas de DEX. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células para a zona de exclusão. </li></ol> 3. Configuração 2: Padronização Island (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima. </li><li> Colheita das células a serem usadas para padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis. </li><li> Pellet e ressuspender as células em um volume apropriado de 12,8% DEX para alcançar a concentração desejada de células por patterning ilha. As concentrações de 5000 cells / ul ou menos são recomendados para os tipos de células fortemente aderentes. Para as células que têm dificuldade em fixar ou células que aderem fracamente, concentrações de até 10.000 células / uL pode ser considerada. </li><li> Trabalhar rapidamente, para evitar a secagem, as gotas de pipeta 0,5 ul de DEX sobre um substrato seco de células de cultura, como descrito acima. Não permitir que as gotas para secar. Opcional: 200 ul de solução de PEG pode ser adicionado ao poço antes do tempo. DEX gotículas pode então ser depositado na solução de PEG, onde irá afundar para o fundo e a superfície de contacto da cultura. Isso pode produzir padrões mais limpas da ilha. </li><li> Cobrir as gotículas DEX com 200 uL de PEG. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar nova culturamédio e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células e para fora de proliferação das ilhas. </li></ol> 4. Configuração 3: Exclusão Co-culturas (formato de 96 poços Plate) <ol><li> Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima. </li><li> Colheita das células a serem usadas para a exclusão e padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis para cada tipo de célula. Opcional: Alguns pares de células podem exibir índices de proliferação significativamente diferentes. Para evitar que as células excluídas superpopular as células insulares estampados (especialmente para culturas de longo prazo), o tratamento das células utilizadas para a exclusão com mitomicina C, durante 2 horas ou irradiar-los antes da colheita. Isto irá evitar a proliferação. CellTracker corantes fluorescentes podem ser usadas para distinguir as duas populações de células, se necessário. </li><li> Agregar as células e ressuspender o sedimento de exclusion padronização em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células, como descrito acima. Ressuspender o sedimento em patterning ilha em um volume apropriado de 12,8% DEX para conseguir a concentração desejada de células, como descrito acima. </li><li> Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de suspensão de células de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Não permitir que as gotas para secar. </li><li> Cobrir as gotículas DEX com 200 ul de suspensão de células PEG. </li><li> Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões. </li><li> Remover a solução de PEG e lavar três vezes em 200 ul de meio de cultura. </li><li> Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora. </li><li> Monitorar as co-culturas de observar a interação entre populações de células. Opcionais: Os controles podem ser preparados através da realização de exclusão ou ilha padronização individually, por co-cultura de células que não interagem ou bloqueando as vias de interesse em uma ou ambas as populações de células antes ou depois da modelação. </li></ol>

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Os autores não têm concorrência de interesses financeiros.

A ATPS método micropatterning célula exige conhecimentos muito pouco além de proficiência em técnicas de cultura de células e podem ser rapidamente dominado. As vantagens desta abordagem são que é barato, rápido e compatível com uma variedade de tipos de células e formatos de cultura. Por estas razões, o nosso protocolo deve ser adotada facilmente por cientistas da vida, particularmente aqueles que estudam a proliferação celular, migração e quimiotaxia, e da influência de interações juxtacrine e pará...

De duas fases aquosas sistemas (ATPSs) formam-se quando as soluções de dois polímeros incompatíveis são misturados em conjunto em concentrações suficientemente elevadas. A separação de fases é influenciada por uma série de factores que incluem o peso molecular e polaridade dos polímeros, a temperatura da solução, pH e teor iónico do solvente aquoso de 1, 2. O ponto em que as duas soluções poliméricas separadas, é determinada pelas propriedades físico-químicas do sistema de fase escolhida, mas geralmente ocorre em baixas concentrações de polímero (inferiores a 20% wt / wt), sob condições não desnaturantes, permitindo ATPSs a ser utilizado para a biotecnologia 3-9 aplicações. De longe, os mais extensivamente estudados ATPS é o polietileno glicol (PEG) / dextrano sistema (DEX). Os ATPS formadas por estes polímeros de baixo custo e biocompatível foi originalmente descrita para a purificação de biomoléculas por meio de particionamento molecular de 2, 10. Particionamentoocorre quando as moléculas ou partículas adicionais que não contribuem para o sistema de fases são misturadas com PEG e DEX. Com base nas suas afinidades relativas para ou DEX ou PEG, as moléculas ou partículas será preferencialmente residir dentro de uma das duas fases, ou na interface. Outra propriedade do SDFA PEG / DEX é a existência de tensão interfacial entre as duas fases de polímero. ATPSs formados por PEG e DEX geralmente exibem as tensões interfaciais, que são muito mais baixos do que outras fases líquido-líquido e dois sistemas, tais como óleo e água, no entanto, as forças de tensão interfacial ainda exercem efeitos em pequenas partículas, tais como vírus, células e agregados de proteína 2 , 11-13. Finalmente, visto que um maior peso molecular de PEG e DEX separado em concentrações baixas (inferiores a 5% em peso / peso para polímeros de alto peso molecular variedades), na presença de concentrações fisiológicas de sais, há poucos ou nenhuns efeitos nocivos sobre as células de mamíferos incorporado dentro destas sistemas14-16. Recentemente, as propriedades interfaciais e efeitos de particionamento de ATPSs foram aplicadas por nosso laboratório para padronização de células 14, 16-20. Isto foi conseguido por uma densa micropatterning solução DEX em substratos de cultura de células na presença de PEG. Quando as células são incorporados na fase de PEG, são excluídos de entrar nas gotículas de DEX, devido a PEG / DEX tensão interfacial 20. Quando as células são modelados na fase de DEX, eles são retidos na superfície do substrato de cultura de células por tensão interfacial e partição 16, 17, 19. Em contraste com outros métodos de padronização celular, ATPS padronização celular é fácil de aprender e requer apenas conhecimentos rudimentares sobre os polímeros em si, e da capacidade de realização de cultura de células e usar uma micropipeta. Outros métodos para padronização de células muitas vezes envolvem equipamentos especializados e treinamento que não são facilmente traduzidos para poe ciências da vida. Por exemplo, alguns métodos (microcontact impressão ou impressão a jacto de tinta) células padrão indirectamente mediante a aplicação de padrões de biomoléculas adesivas de células a um substrato de cultura que, posteriormente, servir como locais para ligação de células 21, 22. Embora as abordagens indirectas são úteis para alguns tipos de células, elas requerem um elevado grau de destreza do utilizador e equipamento especializado para fabricar a ferramenta de modelação, e pode carecem de especificidade, dependendo do tipo específico de célula padrão / biomolécula. Alternativamente, as células podem ser depositadas com uma especificidade elevada padrão por meio de métodos de modelação directos, que incluem padrões de fluxo laminar stenciling, e impressão jacto de tinta 23-26. No entanto, essas técnicas também requerem perícia do utilizador e equipamento especializado e podem danificar as células durante o processo de impressão. Embora estes métodos geralmente produzem padrões precisos de células, para padronização célula para ser uma ferramenta útil nas ciências da vida, deve ser rentável umª simples de implementar. Relatamos aqui um protocolo detalhado para a geração de culturas de células utilizando os estampados ATPSs descritos nos nossos pedidos anteriormente publicados-. Usando apenas micropipetas, os usuários podem gerar zonas de exclusão de células ou ilhas de células para os ensaios de migração. Isto é conseguido por meio de PEG / DEX tensão interfacial ou que retém as células na fase de DEX ou exclui células depositadas na fase de PEG de DEX. Combinando estas duas técnicas fundamentais de modelação, é possível gerar rapidamente co-culturas de células, tais como fibroblastos de células de fígado de co-culturas. Métodos de padronização, os parâmetros e os resultados esperados ATPS são descritos em detalhe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fabricante </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Dinamarca </td></tr><tr><td> Polietilenoglicol 35000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Rastreador de celular </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

Padronização de tecnologias de células que são rápido, fácil de usar e acessível será necessário para o futuro desenvolvimento de ensaios de alto rendimento, plataformas de celulares para o estudo de interações célula-célula e sistemas de engenharia de tecidos. Este protocolo detalhado descreve um método para a geração de co-culturas de células utilizando soluções biocompatíveis de dextrano (DEX) e polietileno glicol (PEG), que separada da fase quando combinado acima das concentrações de limiar. As células podem ser estampados em uma variedade de configurações que usam este método. Patterning exclusão de células pode ser realizada através da impressão de gotículas de DEX sobre um substrato e cobrindo-os com uma solução de PEG que contêm as células. A tensão interfacial formada entre as duas soluções poliméricas de células faz com que a cair em torno do lado de fora da gotícula de DEX e formar uma clareira circular que pode ser usado para ensaios de migração. Ilhas de células pode ser modelado por meio da supressão de uma célula fase rica DEX em uma solução de PEG ou cobrindo o DEXgota com uma solução de PEG. Co-culturas podem ser formados directamente através da combinação de exclusão de células com DEX patterning ilha. Estes métodos são compatíveis com uma variedade de abordagens para manipulação de líquidos, incluindo micropipetting manual, e pode ser usado com virtualmente qualquer tipo de célula aderente.

Para selecionar uma combinação apropriada de PEG e DEX para padronização de células é importante para determinar a curva binodal. Esta curva de delineia os pontos em que se podem formar um ATPS e pode variar para um dado conjunto de polímeros com base em temperatura, pH e teor iónico. Para a cultura de células que requerem formulações médias personalizadas que podem ser necessários para determinar experimentalmente a curva binodal. Isto é conseguido através da geração de uma série de ATPSs que estão l...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

De duas fases aquosas sistemas foram usados ​​para as populações em simultâneo múltiplos padrões de células. Este método fácil e rápido para a padronização de células tira vantagem da separação de fases de soluções aquosas de dextrano e polietileno glicol e a tensão interfacial que existe entre as duas soluções poliméricas.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K visualizações.  University of Michigan. De duas fases aquosas sistemas foram usados ​​para as populações em simultâneo múltiplos padrões de células. Este método fácil e rápido para a padronização de células tira vantagem da separação de fases de soluções aquosas de dextrano e polietileno glicol e a tensão interfacial que existe entre as duas soluções poliméricas.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Bioengenharia

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...