Agradeço Anthony Taylor para a formação inicial em gravação no intracelular vivo e A Maxwell e David Brown para ajudar com o desenvolvimento inicial da técnica de coloração intracelular. Agradeço M. Prata ajuda com a macro collocalization. Muitos estudiosos com quem tenho colaborado desde insight para o desenvolvimento desta técnica, incluindo R. Donga, Moritani M., P. Luo, Ambalavanar R.. Esta técnica foi desenvolvida com o apoio considerável de NIH concede DE10132, DE15386 e RR017971.

1. Preparação dos animais <ol><li> Anestesiar ratos com pentobarbital sódico (50mg/kg IP) e coloque sobre uma almofada de aquecimento. Raspar a pele que recobre o crânio posterior com clippers animal. Verifique o animal para assegurar que um nível cirúrgica do nível de anestesia foi obtida por meio de testes para a ausência de um reflexo de retirada e vocalização quando os dedos são comprimidos, bem como a ausência de reflexo palpebral. Verificar o nível de anestesia a cada 15 minutos e manter um nível cirúrgico de anesthetisa por injeções de pentobarbital sódico 15mg/kg a cada 45 minutos. </li><li> Use uma técnica asséptica e fazer uma incisão na região inguinal imediatamente distal à prega formada pelo abdômen e parte interna da coxa e inserir uma cânula (1mm de diâmetro, Clay Adams) na veia femoral e da artéria femoral. Faça uma incisão mediana na região submandibular, refletem os músculos infra-hióideos. Fazer uma pequena incisão na traquéia e inserir uma cânula (2mm de diâmetro) para permitir a ventilação. Tye uma sutura em torno do trachael cannual para fixá-lo na pressão arterial sistêmica place.Monitor sistólica e diastólica através da cânula arterial. Além de monitorar a retirada e reflexo palpebral agora monitor de pressão arterial para avaliar o nível de anestesia. Administrar anestesia adicionais quando necessário através da cânula venosa. </li><li> Coloque o rato em uma moldura estereotáxica e realizar uma craniotomia para expor o cerebelo. Anexar a cânula traqueal a um ventilador de roedores. Ventilar o animal com um volume de 2 cm 3 a uma taxa de 100/min com ar umidificado. A pressão expiratória final positiva de 1 cm H 2 O deve ser mantida para evitar o colapso do pulmão. A cada 15 minutos hyperinflate dos pulmões para prevenir atelectasias. Em seguida, cobrir a superfície do cérebro com óleo mineral aquecido (30 ° C). Tenha cuidado para evitar o seio venoso grande localizado diretamente sob a junção entre o parietal e ossos interparietal. </li><li> Aplique cola de cianoacrilato a uma haste acoplada a um vibrador eletromagnético e anexar a vara no diastema da mandíbula. Mover a mandíbula sinais de comando usando o vibrador de qualquer um A saída do computador / D ou um gerador de sinal. </li><li> Coloque um siliver-prata cloreto de eletrodo de aterramento sob a pele adjacente à craniotomia. </li></ol> 2. Preparação do eletrodo <ol><li> Fabricar microeletrodos de vidro de quartzo ou de alumínio usando um extrator de microeletrodos horizontal. </li><li> Preencher o microeletrodo com biotinamide 5-10% dissolvido em 0,25 m e KCl 0.5M Tris HCl (pH 7,6) ou tetramethlyrhodamine 2% em solução salina (pH 6). Verificação da impedância eletrodo com um testador de eletrodo. Para gravar a partir de axônios de grande diâmetro tornar eletrodos com uma impedância de 60-80M Ω, por axônios de pequeno e interneurônios fazer eletrodos com impedância de 80 150MΩ. </li><li> Coloque o microeletrodo no palco cabeça do eletrômetro. Visualize o eletrodo através de um pequeno telescópio (20x com retículo em anexo) que é fixado na posição atrás da cabeça do animal. Usando o telescópio é importante porque permite que os eletrodos para ser stereotaxically posicionados com grande precisão. </li></ol> 3. Gravação eletrofisiológicos e coloração intracelular <ol><li> Faça uma pequena abertura na pia-máter e compensar o feedback capacitância de modo que quando o eletrodo toca o cérebro um sinal de realimentação é produzida. Isto permite a localização exata da superfície do cérebro. </li><li> Produzir repetido deslocamento mandibular e avançar o eletrodo no cérebro com um motor de passo. </li><li> Reconhecer impalements neuronal por quedas bruscas no potencial DC e identificar intrassomáticas impalements neuronal pela atividade sináptica em curso. Zumbindo o eletrodo com uma sobrecompensação dos capacitância ou tocando raramente produzem uma penetração celular de sucesso. Devido à alta impedância dos eletrodos, as respostas neuronal raramente são observados antes da penetração. </li><li> Depois de empalar um neurônio ea penetração é considerado estável, caracterizar a resposta neuronal usando rampa e segurar e movimentos da mandíbula sinusoidal. 5 Mapa do campo receptivo do neurônio sondando a pele ao redor da cabeça e cavidade oral intra com uma sonda não-condutor como um palito de madeira. Se relevantes para o estudo, examinar a resposta do neurônio para outro funcionalmente estímulos relevantes, tais como a contração muscular e estímulos nocivos. Aferentes nociceptivos primários seis receptores neuronais responder a estímulos nociceptivos. Anesthesetics geral, tais como pentobarbital sódico não bloqueio da condução axonal em neurônios aferentes primários, mas sim diminuir a transmissão sináptica. Assim condução axonal no axônio aferente primário neuronal é preservada. </li><li> Injetar corrente contínua (DC, 1-4NA) para um tempo de injeção total de 15 70nA minutos. Monitorar a penetração do eletrodo durante a injeção de corrente e interromper o potencial de membrana se torna mais positivo do que-30mV.</li></ol> 4. Processamento de tecidos <ol><li> Eutanásia do animal por overdose de pentobarbital (140mg/kg IV) e perfundir com um enxágüe vascular (0,9% NaCl 38 ° C, contendo 500 unidades de heparina e 1 ml de xilocaína 2% seguido de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) . </li><li> Remover o cérebro e seção, em 50-100μm usando um vibratome em qualquer plano, frontal sagital ou horizontal. Secions são coletados livre flutuação em 25 ° C PBS. </li><li> Processo do cérebro para DAB, incubando em soro de cabra normal e 1-2% 1% Triton X-100 em PBS 0,01 M seguido de incubação em avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reagir seções usando níquel DAB com H 2 O 2. Ao processo de Texas Red, seções incubar no complexo avidina-biotina (1:50) em PBS overnight a 4 ° C e incubar em 4% Texas Red avidina DCS em PBST a 4 ° C durante a noite. Contracoloração seções com uma fluorescente Nissl mancha (NeuroTrace) 20min a 23 ° C. </li><li> Se neurônio foi injetado com rodamina, visualize o neurônio injetado diretamente com um microscópio de fluorescência (Ex 545nm). </li></ol> 5. Combinando com o método de rotulagem retrógrada, imunocitoquímica, imagem confocal, análise quantitativa co-localização O sucesso de combinar esta técnica com outros métodos, é em grande parte dependente de rotulagem intracelular bom. <ol><li> O método visualizadas aqui podem ser facilmente combinados com rotulagem neuronal retrógrada. 7-10 Para fazer isso, anestesiar o animal e utilizando uma técnica asséptica, injetar um traçador neuronal, tais como peroxidase (20% peroxidase. Sigma VI, Sigma) e 1% gérmen de trigo aggultinated peroxidase (Sigma) em regiões-alvo periféricos, tais como o músculo masseter. Este marcador neuronal será retomada em axônios periféricos e transportados através de transporte axonal ao somata motoneurônio. Para o músculo masseter, 15μl de traçador é injetado no músculo, utilizando uma micro microlitro estéril 10. Os animais são então colocados em uma almofada de aquecimento e monitorado até a recuperação anestésica e, em seguida, colocados em suas gaiolas para a recuperação. Após 24h, anestesiar animais e caracterizar fisiologicamente neurônios e intracelularmente manchá-las. Então perfundir o animal, como descrito acima e cortes de tecidos processo para a presença de HRP utilizando tetrametilbenzidina (TMB) como o Chromagen e tungstato de sódio como estabilizador e intensificou-se com cobalto. Seções lugar no tungstato de sódio a 1% dissolvida em 0,1 M PBS (pH 6,5) e TMB 0,0007% dissolvida em etanol absoluto e acetona a 15 ° C por 20 min. Então reagir cortes de tecidos, adicionando 1,0 ml de 0,3% H 2 O 2 por 100 ml de solução de incubação por 60 min. Enxaguar tecido em 0,1 M PBS (pH 6,5) e coloque em diaminobenzidina 0,05% (pH 7,4), cobalto 0,02% e 0,01% H 2 O 2 0,1 M em PBS (pH 7,4) por 10 min. a 37 ° C. Processo o tecido para a visualização do neurônio injetados com biotinamide como descrito e visualizar as relações entre o neurônio sensorial rotulados e uma variedade de motoneurônios. </li><li> A técnica mostrada aqui também pode ser facilmente combinada com immnocytochemistry. 6 Como exemplo, immunocytochemically processo do cérebro para sinaptofisina para localizar com precisão as sinapses nos neurônios marcados (Fig. 3). Para fazer isso, incubar seções do cérebro do rato em anticorpos anti-sinaptofisina (1:10.000) para 2 dias a 4 ° C e incubar em anti-camundongo FITC (1:400) por 1h a 23 ° C. </li><li> Neurônios marcados com marcadores fluorescentes ou processados ​​para imagens fluorescentes são ideais para imagens confocal. Figura 3 é um exemplo de uma secção óptica obtidos por microscopia confocal através de um bouton axônio. (Fig. 3). Gerar animações de neurônios rotuladas através da aquisição de várias secções ópticas através do neurônio rotulada (Fig. 4). </li><li> Neurônios marcados com este método pode ser usado para a análise de co-localização quantitativa. Para fazer isso, use uma macro software disponíveis publicamente em conjunto com o NIH Imagem (encontrado em http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Localize sinaptofisina dentro de terminais de axônio único, combinando rotulagem intracelular com imunocitoquímica sinaptofisina 6. </li></ol> 6. Resultados representativos: Uma visão geral dos resultados representativos que podem ser obtidos através deste método são ilustrados na Figura 1. Este único neurônio do tronco cerebral foi eletrofisiologicamente registrados durante o movimento da mandíbula e, como pode ser visto claramente, a resposta deste neurônio (Figura 1 inferior esquerdo, azul claro) foi modulada durante o movimento. Este neurônio foi injetado com biotinamide após caracterização eletrofisiológica e posteriormente processadas para visualização. O neurônio reconstruído (Figura 1 médio, verde) pode ser realted de um marco anatômico, neste caso, o núcleo motor do trigêmeo designado (contorno vermelho). Com base na resposta neuronal durante o movimento ea reconstrução deste neurônio pode ser identificado como um neurônio secundário do fuso muscular aferentes. A figura 2 ilustra um exemplo representativo da resposta fisiológica de um neurônio durante o deslocamento da mandíbula. A resposta do neurônio é representado como frequência de disparo instantâneo. Note-se que a resposta neuronal imita o deslocamento mandibular, indicando que esse neurônio particular oferece feedback sensorial relacionado à posição mandibular. Figura 3 é uma imagem de alta ampliação de um axônio intracelularmente manchada combinado com coloração para sinaptofisina e uma mancha de Nissl. Observe a co-localização de sinaptofisina (amarelo) dentro da bouton axônio. Figura 4 é uma animação de um neurônio único, caracterizado fisiologicamente e intracelularmente rotulados. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Figura 1"/> A Figura 1. Visão geral do método. Superior esquerdo: deslocamento mandibular. Gravação Intracelular meio (verde) de único neurônio (amarelo). A morfologia deste neurônio foi reconstruída após a gravação intracelular e injeção. Contorno vermelho indica a localização do núcleo motor do trigêmeo. Canto inferior esquerdo: resposta fisiológica deste neurônio durante o movimento da mandíbula. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Resposta fisiológica Representante de um neurônio único músculo sensoriais gravadas in vivo durante o movimento da mandíbula. Observe a semelhança da resposta neuronal com deslocamento da mandíbula. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Terminal arborização axonal com boutons sináptica (inchaços vermelhos) de um neurônio sensorial intracelularmente manchada que responderam durante muscular sondagem. Processamento imunocitoquímicos subseqüentes para sinaptofisina mostra localização de sinaptofisina no bouton axonal (amarelo). Verde é uma mancha fluorescente Nissl. Figura 4. Animation do músculo axônio neurônio fusiforme aferentes primários cuja resposta fisiológica foi gravado in vivo durante o movimento mandibular, o axônio foi então intracelularmente manchadas e processados ​​para visualização. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Download de um vídeo de alta resolução da Figura 4 aqui</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Download de um vídeo de média resolução Figura 4 aqui</a>

<ol>
	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com o guidlines e regulação estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985) e da Universidade de Maryland Animal Care e Use Comitê.

O método ilustrado aqui é uma poderosa técnica que fornece informação importante sobre a função dos neurônios individuais e como a resposta de neurônios individuais contribui para circuitos neuronais. 9 Este conhecimento é fundamental para a compreensão da função sensório-motor. A maior força desta técnica é que permite a determinação é de um grande número de parâmetros sobre um neurônio, incluindo a fisiologia, a morfologia ea morfologia e distribuição sináptica. Quando combinado co...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> vibrador eletromagnético </td><td> Ling Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> gerador de sinal </td><td> Sistemas de Medição </td><td> PFG605 </td><td> capaz de produzir o sinal de saída trapezoidal </td></tr><tr><td> eletrodo de vidro </td><td> Sutter Instruments </td><td> AF100-68-10 </td><td> com filamento </td></tr><tr><td> extrator eletrodo </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-2000 ou P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Vector Laboratories </td><td> SP-1120 </td><td> armazenados a 4 ° C </td></tr><tr><td> Texas Red avidina DCS </td><td> Vector Laboratories </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Sondas moleculares </td><td> D-3308 </td><td> 3000 o peso molecular, lisina fixable </td></tr><tr><td> rato de anticorpos anti-sinaptofisina </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> fluorescentes mancha Nissl </td><td> Neurotrace, Molecular Probes </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> testador de eletrodo </td><td> Winston Eletrônica </td><td> BL-1000-B </td><td> para medir a impedância do eletrodo </td></tr><tr><td> eletrômetro </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

O papel dos neurônios individuais e sua função nos circuitos neuronais é fundamental para a compreensão dos mecanismos neuronais das funções sensoriais e motoras. A maioria das investigações de mecanismos sensório-motor dependem, quer o exame de neurônios ao mesmo tempo um animal é 1,2 estática ou atividade neuronal registro extracelular durante um movimento. 3,4 Embora esses estudos forneceram a base fundamental para a função sensório-motor, que não quer avaliar as informações funcionais que ocorre durante um movimento ou estão limitados na sua capacidade de caracterizar plenamente o fenótipo anatomia, fisiologia e neuroquímica do neurônio. A técnica é mostrada aqui, que permite a caracterização extensa de neurônios individuais durante um em movimento vivo. Esta técnica pode ser usada não só para estudar neurônios aferentes primários, mas também para caracterizar os motoneurônios e interneurônios sensório-motor. Inicialmente, a resposta de um único neurônio é gravado usando métodos eletrofisiológicos durante vários movimentos da mandíbula seguido por determinação do campo receptivo para o neurônio. Um traçador neuronal é, então, intracelularmente injetado no neurônio e do cérebro é processada de modo que o neurônio pode ser visualizado com microscopia de luz, elétron ou confocal (Fig. 1). A morfologia detalhada do neurônio é caracterizado depois reconstruída de modo que a morfologia neuronal pode ser correlacionada com a resposta fisiológica do neurônio (Figs. 2,3). Nesta comunicação detalhes importantes e dicas importantes para a implementação bem sucedida dessa técnica são fornecidos. Informações adicionais valiosas pode ser determinada para o neurônio em estudo através da combinação deste método com outras técnicas. Rotulagem neuronal retrógrada pode ser utilizada para determinar os neurônios com que as sinapses dos neurônios rotuladas, permitindo assim a determinação detalhada dos circuitos neuronais. Imunocitoquímica pode ser combinado com este método para examinar neurotransmissores no neurônio rotulados e para determinar os fenótipos químicos de neurônios com que as sinapses dos neurônios marcados. O neurônio marcado também podem ser processados ​​para microscopia eletrônica para determinar as características ultra-estruturais e micro circuitos do neurônio rotulados. Geral esta técnica é um método poderoso para caracterizar completamente os neurônios durante em movimento vivo, permitindo assim uma visão substancial sobre o papel do neurônio em função sensório-motor.

Watch this Scientific Journal Video about Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement at JoVE.com

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K visualizações.  University of Maryland. A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Vídeo: Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Neurociência

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Introduction to Neurophysiology

Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous systems at the level of whole organs, cellular networks, single cells, or even subcellular compartments. A unifying feature of this wide-ranging discipline is an interest in the mechanisms that lead to the generation and propagation of electrical impulses within and between neurons. This subject is important not only for our understanding of the fascinating processes driving human thought, but also for our ability to diagnose and treat disorders related to nervous system malfunction. This video will provide an introduction to the field of neurophysiology, beginning with a brief history of neurophysiological research that showcases landmark studies like Galvani&#8217;s observations of twitching frog legs and Eccles&#8217;s discovery of the chemical synapse. Next, key questions asked by neurophysiologists are introduced, followed by an overview of some prominent experimental tools used to answer those questions. The methods presented range from techniques used to investigate single cells, like patch clamping, to those that can measure activity across large regions of the brain, like electroencephalography (EEG). Finally, applications of neurophysiological research are discussed, including the development of brain-machine interfaces that allow for device control using thought.

Introduction to Neurophysiology: Methods &amp; Applications

Uma Introdução à Neurofisiologia

 Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Avançada

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, signaling molecules, and cellular morphology, researchers in this field uncover crucial insights into normal brain development and function, as well as the root causes of many pathological conditions.
This video introduction to the fascinating world of cellular and molecular neuroscience begins with a timeline of landmark studies, from the discovery of DNA in 1953 to more recent breakthroughs like the cloning of ion channels. Next, key questions in the field are introduced, such as how genes influence neuron activity and how the nervous system is modified by experience. This is followed by brief descriptions of some prominent methods used to analyze genetic material in neurons, manipulate expression of genes, and visualize neurons and their parts. Finally, several applications of molecular and cellular neuroscience are presented to demonstrate how cellular and molecular approaches can be used to profile neuron populations and explore their functions.

Cellular and Molecular Neuroscience Research

Uma Introdução à Neurociência Celular e Molecular

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo