Ich danke Anthony Taylor für die Erstausbildung in in vivo intrazelluläre Aufnahme und A Brown und David Maxwell für die Hilfe bei der anfänglichen Entwicklung des intrazellulären Maltechnik. Ich danke M. Silver für die Hilfe bei der collocalization Makro. Viele Wissenschaftler, mit denen ich einen Einblick in die Entwicklung dieser Technik einschließlich R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar zusammengearbeitet. Diese Technik wurde mit erheblicher Unterstützung von NIH gewährt DE10132, DE15386 und RR017971 entwickelt.

1. Tierische Vorbereitung <ol><li> Anesthetize Ratte mit Natrium-Pentobarbital (50mg/kg IP) und auf ein Heizkissen. Shave die Haut über der hinteren Schädel mit Tierschermaschinen. Überprüfen Sie das Tier zu gewährleisten, dass eine chirurgische Maß an Niveau der Narkose durch die Prüfung wurde für das Fehlen eines Rücktritts Reflex und Vokalisation erhalten, wenn die Zehen geklemmt sowie das Fehlen einer Augenlidreflexe sind. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie alle 15 Minuten und Aufrechterhaltung einer chirurgischen Niveau anesthetisa durch die Injektion von Natrium-Pentobarbital 15mg/kg alle 45 Minuten. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen arbeiten und einen Einschnitt in der Leistengegend direkt distal der Falte durch den Bauch und Innenseite der Oberschenkel gebildet und legen Sie eine Kanüle (1 mm Durchmesser, Clay Adams) in die V. femoralis und A. femoralis. Machen Sie einen Medianschnitt in der Submandibulärregion, spiegeln die infrahyoideus. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre und legen Sie eine Kanüle (2 mm Durchmesser), um Belüftung zu ermöglichen. Tye eine Naht um den trachael cannual, um es in place.Monitor systemischen systolischen und diastolischen Blutdrucks über die arterielle Kanüle zu sichern. Neben der Überwachung der Rücknahme-und Augenlidreflexe jetzt den Blutdruck zu beobachten, um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verwalten zusätzliche Betäubung, wenn über die venöse Kanüle nötig. </li><li> Legen Sie die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen und führen Sie eine Kraniotomie an das Kleinhirn freizulegen. Bringen Sie die Trachealkanüle ein Nagetier Ventilator. Lüften Sie das Tier mit einem Volumen von 2 cm 3 mit einer Geschwindigkeit von 100/min mit feuchter Luft. Eine positive endexspiratorischer Druck von 1 cm H 2 O sollte beibehalten werden, um Lungen-Kollaps zu verhindern. Alle 15 Minuten Hyperinflation der Lunge zu Atelektasen zu verhindern. Dann bedecken die Oberfläche des Gehirns mit warmen Mineralöl (30 ° C). Achten Sie darauf, die großen venösen Sinus direkt unter der Kreuzung zwischen der parietalen und interparietalen Knochen entfernt zu vermeiden. </li><li> Bewerben Sekundenkleber auf einen Stab gekoppelt mit einem elektromagnetischen Vibrator und befestigen Sie die Stange in das Diastema des Kiefers. Bewegen Sie den Unterkiefer mit dem Befehl signalisiert dem Vibrator entweder von einem A / D-Computer-Ausgang oder einen Signalgenerator. </li><li> Legen Sie eine siliver-Silberchlorid Erdungselektrode unter die Haut neben der Kraniotomie. </li></ol> 2. Electrode Vorbereitung <ol><li> Fertigen Mikroelektroden aus Quarz oder Aluminosilicatglas mit einer horizontalen Mikroelektroden Abzieher. </li><li> Füllen Sie den Mikroelektroden mit 5-10% biotinamide in 0,25 M KCl und 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) oder 2% tetramethlyrhodamine in Kochsalzlösung (pH 6) aufgelöst. Überprüfen Sie Elektrodenimpedanz mit einer Elektrode Tester. Zur Aufnahme von großem Durchmesser Axone machen Elektroden mit einer Impedanz von 60-80M Ω, für kleine Axone und Interneuronen machen Elektroden mit einer Impedanz von 80-150MΩ. </li><li> Legen Sie die Mikroelektroden in den Kopf der Bühne des Elektrometers. Visualisieren Sie die Elektrode durch ein kleines Teleskop (20X mit einer geschlossenen Absehen), die in der Position hinter den Kopf des Tieres fixiert ist. Mit dem Teleskop ist wichtig, weil sie Elektroden an stereotaxically mit großer Präzision positioniert werden können. </li></ol> 3. Elektrophysiologische Aufzeichnung und intrazelluläre Färbung <ol><li> Machen Sie eine kleine Öffnung in der pia mater und überkompensieren die Kapazität Feedback, so dass, wenn die Elektrode im Gehirn berührt ein Feedback-Signal erzeugt wird. Dies ermöglicht die genaue Lage der Oberfläche des Gehirns. </li><li> Produce wiederholt mandibuläre Verlagerung und vor der Elektrode in das Gehirn mit einem Schrittmotor. </li><li> Erkennen neuronalen Pfählungen durch plötzliche DC-Potential und identifizieren intrasomatic neuronalen Pfählungen durch laufende synaptische Aktivität. Buzzing die Elektrode mit einer Überkompensation der Kapazität oder Klopfen selten zu einem erfolgreichen Zellpenetration. Aufgrund der hohen Impedanz der Elektroden sind neuronale Reaktionen selten vor, um das Eindringen beobachtet. </li><li> Nachdem Sie ein Neuron und spießen das Eindringen gilt als stabil, charakterisieren die neuronale Antwort mit Rampe und halten und sinusförmige Kieferbewegungen. 5 Karte der rezeptiven Feld des Neurons durch Untersuchung der Haut rund um die Kopf-und intra Mundhöhle mit einem nicht leitenden Sonde wie einen Holzstab. Wenn die für die Studie untersuchen die Reaktion des Neurons an andere funktionell relevanter Reize wie Muskelkontraktion und Schmerzreize. 6 primären afferenten nozizeptiven neuronalen Rezeptoren reagieren auf nozizeptive Reize. Allgemeine anesthesetics wie Natrium-Pentobarbital nicht blockieren axonalen Leitung in primären afferenten Neuronen, sondern drücken die synaptische Übertragung. So axonalen Leitung in der primären afferenten neuronalen Axon ist erhalten geblieben. </li><li> Inject Gleichstrom (DC, 1-4NA) für insgesamt Einspritzzeit von 15-70nA Minuten. Monitor-Elektrode Penetration während Stromeinspeisung und einzustellen, wenn Membranpotential positiver als-30mV.</li></ol> 4. Tissue Verarbeitung <ol><li> Euthanize das Tier durch Überdosis Pentobarbital (140mg/kg IV) und perfuse mit einer vaskulären spülen (0,9% NaCl 38 ° C mit 500 Einheiten Heparin und 1 ml 2% Xylocain gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) . </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und § es bei 50-100 um mit einer Vibratom entweder in der Frontal-, Sagittal-oder Horizontalebene. Secions frei schwebend in 25 ° C PBS gesammelt. </li><li> Prozess im Gehirn für DAB durch Inkubation bei 1-2% normalem Ziegenserum und 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS gefolgt von einer Inkubation in Avidin Biotin-Komplex (1:50 Elite Vectastain). React Abschnitte mit Nickel-DAB mit H 2 O 2. Zur Bearbeitung für Texas Red, inkubieren Abschnitte in Avidin-Biotin-Komplex (1:50) in PBS über Nacht bei 4 ° C und dann in 4% Texas Red Avidin DCS in PBST bei 4 ° C über Nacht inkubieren. Gegenfärbung Abschnitte mit einem fluoreszierenden Nissl-Färbung (NeuroTrace) 20min bei 23 ° C. </li><li> Wenn Neuron mit Rhodamin injiziert wurde, visualisieren die injizierten Neuron direkt mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Ex 545nm). </li></ol> 5. Die Kombination Methode mit retrograde Markierung, Immunzytochemie, konfokale Bildgebung, quantitative Kolokalisationsanalyse Den Erfolg dieser Kombination dieser Technik mit anderen Methoden ist weitgehend abhängig von guten intrazellulären Kennzeichnung. <ol><li> Die Methode visualisiert hier kann leicht mit retrograde neuronale Markierung kombiniert werden. 7-10 Um dies zu tun, betäuben das Tier und unter aseptischen Bedingungen injizieren eine neuronale Tracer wie Meerrettichperoxidase (20% Meerrettichperoxidase. Sigma VI, Sigma) und 1% Weizenkeimöl aggultinated Meerrettichperoxidase (Sigma) in peripheren Zielregionen wie M. masseter. Diese neuronale Tracer wird bis in die peripheren Axone aufgenommen und transportiert werden via axonalen Transport zu den Motoneuronen Somata. Für die Kaumuskel ist 15μl der Tracer in den Muskel mit einer sterilen 10 Mikroliter Mikrospritze injiziert. Die Tiere werden dann auf einem Heizkissen gelegt und überwacht werden, bis aus der Narkose erholt und dann in ihren Käfigen für die Verwertung gelegt. Nach 24 Stunden, betäuben Tiere und physiologisch charakterisieren Neuronen und intrazellulär anzufärben. Dann versorgen die Tiere, wie oben und Prozess Gewebeschnitten für die Anwesenheit von HRP mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromagen und Natriumwolframat als Stabilisator und verstärkte mit Kobalt beschrieben. Legen Sie Abschnitte in 1% Natriumwolframat in 0,1 M PBS (pH 6,5) und 0,0007% TMB in absolutem Ethanol und Aceton bei 15, gelöst ° C für 20 min. Dann reagieren Gewebeschnitten durch Zugabe von 1,0 ml von 0,3% H 2 O 2 pro 100ml Inkubation für 60 min. Das Gewebe spülen in 0,1 M PBS (pH 6,5) und in 0,05% Diaminobenzidin (pH 7,4), 0,02% Kobalt und 0,01% H 2 O 2 in 0,1 M PBS (pH 7,4) für 10 min. bei 37 ° C. Prozess des Gewebes für die Visualisierung des Neurons mit biotinamide injiziert, wie beschrieben und visualisiert die Beziehungen zwischen der markierten sensorischen Neuronen und eine Vielzahl von Motoneuronen. </li><li> Die Technik hier gezeigt können auch leicht mit immnocytochemistry kombiniert werden. 6 Als ein Beispiel, immuncytochemisch Prozess des Gehirns für Synaptophysin, um genau zu lokalisieren Synapsen innerhalb markierter Neuronen (Abb. 3). Um dies zu tun, inkubieren Hirnschnitten in Maus-anti-Synaptophysin-Antikörper (1:10.000) für 2 Tage bei 4 ° C und dann in anti-Maus-FITC (1:400) inkubiert 1 h bei 23 ° C. </li><li> Neuronen mit fluoreszierenden Markern versehen oder verarbeitet für Fluoreszenz-Imaging sind ideal für die konfokale Bildgebung. Abbildung 3 ist ein Beispiel für einen optischen Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie durch ein Axon bouton erhalten. (Abb. 3). Generieren Sie Animationen der markierten Neuronen durch den Erwerb mehrerer optische Schnitte durch die markierte Neuron (Abb. 4). </li><li> Neuronen mit dieser Methode markiert werden können für quantitative Kolokalisationsanalyse verwendet werden. Um dies zu tun, verwenden Sie einen öffentlich zugänglichen Software Makro in Verbindung mit NIH Image (gefunden bei http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Localize Synaptophysin innerhalb einzelner Axonterminalen durch die Kombination von intrazellulären Markierung mit Synaptophysin Immunzytochemie. 6 </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Eine Übersicht über die repräsentative Ergebnisse, die unter Verwendung dieser Methode werden können, sind in Abbildung 1 dargestellt. Diese einzelne Neuron Hirnstamms elektrophysiologisch war während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet und, wie deutlich zu sehen ist, war die Antwort des Neurons (Abbildung 1 unten links, hellblau) moduliert während der Bewegung. Dieses Neuron wurde mit biotinamide nach elektrophysiologischen Charakterisierung injiziert und anschließend zur Visualisierung verarbeitet. Die rekonstruierten Neuron (Abbildung 1 Mitte, grün) können realeTed einer anatomischen Landmarke, in diesem Fall den Trigeminus Nucleus bezeichnet (rote Umrandung). Basierend auf den neuronalen Reaktion während der Bewegung und des Wiederaufbaus dieses Neuron kann als sekundäre Muskel afferenten Neuron identifiziert werden. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Beispiel für die physiologische Reaktion eines Neurons im Kiefer Verschiebung. Die Reaktion des Neurons ist als Momentanwerte Schussfrequenz vertreten. Beachten Sie, dass die neuronale Antwort ahmt mandibuläre Verlagerung darauf hinweist, dass diese besondere Neuron sensorisches Feedback in Bezug auf die Lage des Unterkiefers bietet. Abbildung 3 ist ein hoher Vergrößerung Bild eines intrazellulär gefärbt Axon mit Färbung für Synaptophysin und Nissl-Färbung kombiniert. Beachten Sie die Kolokalisation von Synaptophysin (gelb) in das Axon bouton. Abbildung 4 ist eine Animation aus einem einzigen, physiologisch charakterisiert und intrazellulär markierten Neuronen. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Übersicht über die Methode. Oben links: mandibuläre Verlagerung. Middle Intrazelluläre Aufnahme (grün) aus einzelnen Neurons (gelb). Die Morphologie dieses Neuron wurde nach intrazellulärer Aufnahme und Injektion rekonstruiert. Rote Umrandung zeigt Lage der Trigeminus-motorischen Kern. Unten links: physiologische Reaktion dieser Neuronen während der Kieferbewegungen. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Representative physiologische Reaktion eines einzelnen Muskels sensorischen Neuronen in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet. Man beachte die Ähnlichkeit der neuronalen Antwort mit Kiefer Verschiebung. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Terminal-axonale Verzweigung mit synaptischen boutons (rote Schwellungen) eines intrazellulär gefärbt sensorischen Neuronen, die bei Muskel-Probing reagiert. Nachfolgende immunzytochemische Verarbeitung für Synaptophysin zeigt Lokalisierung von Synaptophysin in der axonalen bouton (gelb). Grün ist eine fluoreszierende Nissl-Färbung. Abbildung 4. Animation der Muskelspindel primären afferenten Neuron Axon, dessen physiologische Reaktion wurde in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet wurde Das Axon dann intrazellulär gefärbt und verarbeitet für die Visualisierung. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Laden Sie ein hochauflösendes Video der Abbildung 4 hier</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Laden Sie eine mittlere Auflösung Video von Abbildung 4 hier</a>

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	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den guidlines und Regulierung, die in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publication No 86-23, revised 1985) gesetzt und der University of Maryland Animal Care durchgeführt und Verwenden Committee.

Das dargestellte Verfahren hier ist eine leistungsstarke Technik, die wichtige Einblicke in die Funktion der einzelnen Neuronen und wie die Reaktion einzelner Nervenzellen trägt zur neuronalen Schaltkreisen. 9 Dieses Wissen ist grundlegend für das Verständnis Sensomotorik. Die größte Stärke dieser Technik ist, dass es erlaubt die Bestimmung einer Vielzahl von Parametern zu einem Neuron einschließlich Physiologie, Morphologie und synaptische Morphologie und Verteilung. In Verbindung mit anderen Technike...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens oder Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> elektromagnetischen Vibrator </td><td> Ling Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> Signalgenerator </td><td> Feedback-Systeme </td><td> PFG605 </td><td> in der Lage, trapezförmigen Ausgangssignal </td></tr><tr><td> Elektrodenglas </td><td> Sutter Instruments </td><td> AF100-68 bis 10 </td><td> mit Filament </td></tr><tr><td> Elektrode puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-2000 oder P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Vector Laboratories </td><td> SP-1120 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Texas Red Avidin DCS </td><td> Vector Laboratories </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Molecular Probes </td><td> D-3308 </td><td> 3000 Molekulargewicht, Lysin feststellbar </td></tr><tr><td> Maus-anti-Synaptophysin-Antikörper </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> fluoreszierende Nissl-Färbung </td><td> Neurotrace, Molecular Probes </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrode Tester </td><td> Winston Electronics </td><td> BL-1000-B </td><td> zu Elektrodenimpedanz messen </td></tr><tr><td> Elektrometer </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

Die Rolle der einzelnen Neuronen und ihre Funktion in neuronalen Schaltkreisen ist grundlegend für das Verständnis der neuronalen Mechanismen der sensorischen und motorischen Funktionen. Die meisten Untersuchungen des sensomotorischen Mechanismen beruhen entweder auf Untersuchung von Neuronen während eines Tieres ist statisch 1,2 oder aufzeichnen extrazelluläre neuronale Aktivität während einer Bewegung. 3,4 Während diese Studien der fundamentale Hintergrund für Sensomotorik Verfügung gestellt haben, sie entweder nicht beurteilen funktionelle Informationen die auftritt, während einer Bewegung oder sind in ihrer Fähigkeit zur vollständigen Charakterisierung der Anatomie, Physiologie und neurochemischen Phänotyp des Neurons begrenzt. Eine Technik ist hier die erlaubt umfangreiche Charakterisierung von einzelnen Neuronen während einer in vivo Bewegung gezeigt. Diese Technik kann nicht nur zur primären afferenten Neuronen zu studieren, sondern auch für Motoneuronen und sensomotorischen Interneuronen zu charakterisieren. Zunächst die Antwort eines einzelnen Neurons aufgezeichnet wird mit elektrophysiologischen Methoden bei verschiedenen Bewegungen des Unterkiefers durch die Bestimmung der rezeptiven Feld für das Neuron gefolgt. Eine neuronale Tracer wird dann intrazellulär in das Neuron injiziert und das Gehirn ist so verarbeitet, dass das Neuron kann visualisiert werden mit Licht-, Elektronen-oder konfokalen Mikroskopie (Abb. 1). Die detaillierte Morphologie des Neurons charakterisiert wird dann umgebaut, so dass neuronale Morphologie mit der physiologischen Reaktion des Neurons (Abb. 2,3) korreliert werden können. In dieser Mitteilung wichtiger Schlüssel Details und Tipps für eine erfolgreiche Umsetzung dieser Technik sind vorhanden. Können wertvolle Zusatzinformationen für das Neuron unter Studie durch die Kombination dieser Methode mit anderen Techniken bestimmt werden. Retrograde neuronale Markierung kann verwendet werden, um Neuronen zu bestimmen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen; so dass detaillierte Bestimmung der neuronalen Schaltkreise. Immunocytochemistry Mit dieser Methode können kombiniert werden, um Neurotransmitter innerhalb der markierten Neuronen zu untersuchen und die chemische Phänotypen von Neuronen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen bestimmen. Die markierten Neuron kann auch für die Elektronenmikroskopie aufbereitet werden, um die ultrastrukturelle Merkmale und Mikrotechnik der markierten Neuronen zu bestimmen. Insgesamt dieser Technik ist eine leistungsfähige Methode, um gründlich zu charakterisieren Neuronen während in vivo Bewegung wodurch erhebliche Einblick in die Rolle des Neurons in Sensomotorik.

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  University of Maryland. Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.

Serie: Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank yesterday."), however such reports can often be unreliable or sensitive to response bias 1, and may be unobtainable in some participant populations. Furthermore, explicit reports only reveal when information has reached consciousness and cannot comment on when memories were accessed during processing, regardless of whether the information is subsequently accessed in a conscious manner. Eye movement monitoring (eye tracking) provides a tool by which memory can be probed without asking participants to comment on the contents of their memories, and access of such memories can be revealed on-line 2,3. Video-based eye trackers (either head-mounted or remote) use a system of cameras and infrared markers to examine the pupil and corneal reflection in each eye as the participant views a display monitor. For head-mounted eye trackers, infrared markers are also used to determine head position to allow for head movement and more precise localization of eye position. Here, we demonstrate the use of a head-mounted eye tracking system to investigate memory performance in neurologically-intact and neurologically-impaired adults. Eye movement monitoring procedures begin with the placement of the eye tracker on the participant, and setup of the head and eye cameras. Calibration and validation procedures are conducted to ensure accuracy of eye position recording. Real-time recordings of X,Y-coordinate positions on the display monitor are then converted and used to describe periods of time in which the eye is static (i.e. fixations) versus in motion (i.e., saccades). Fixations and saccades are time-locked with respect to the onset/offset of a visual display or another external event (e.g. button press). Experimental manipulations are constructed to examine how and when patterns of fixations and saccades are altered through different types of prior experience. The influence of memory is revealed in the extent to which scanning patterns to new images differ from scanning patterns to images that have been previously studied 2, 4-5. Memory can also be interrogated for its specificity; for instance, eye movement patterns that differ between an identical and an altered version of a previously studied image reveal the storage of the altered detail in memory 2-3, 6-8. These indices of memory can be compared across participant populations, thereby providing a powerful tool by which to examine the organization of memory in healthy individuals, and the specific changes that occur to memory with neurological insult or decline 2-3, 8-10.

Eye movement monitoring (or eye tracking) reveals where in space the eyes linger, when and for how long. Here, we demonstrate how eye tracking can be used to investigate the integrity of memory in multiple participant populations, without requiring verbal, or otherwise explicit, reports.

Eye Movement Überwachung von Speicher

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Forschung

Neurowissenschaften

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and focused on psychological aspects. Until now, objective observation of neurophysiological parameters has not been carried out - undoubtedly because the technical and methodological means have not been available -, investigations into the neurophysiological effects of weightlessness are in their infancy (Schneider et al. 2008).
While imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) would be hardly applicable in space, the non-invasive near-infrared spectroscopy (NIRS) technique represents a method of mapping hemodynamic processes in the brain in real time that is both relatively inexpensive and that can be employed even under extreme conditions. The combination with electroencephalography (EEG) opens up the possibility of following the electrocortical processes under changing gravity conditions with a finer temporal resolution as well as with deeper localization, for instance with electrotomography (LORETA).
Previous studies showed an increase of beta frequency activity under normal gravity conditions and a decrease under weightlessness conditions during a parabolic flight (Schneider et al. 2008a+b). Tilt studies revealed different changes in brain function, which let suggest, that changes in parabolic flight might reflect emotional processes rather than hemodynamic changes. However, it is still unclear whether these are effects of changed gravity or hemodynamic changes within the brain. Combining EEG/LORETA and NIRS should for the first time make it possible to map the effect of weightlessness and reduced gravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain. Initially, this is to be done as part of a feasibility study during a parabolic flight. Afterwards, it is also planned to use both techniques during medium- and long-term space flight.
It can be assumed that the long-term redistribution of the blood volume and the associated increase in the supply of oxygen to the brain will lead to changes in the central nervous system that are also responsible for anaemic processes, and which can in turn reduce performance (De Santo et al. 2005), which means that they could be crucial for the success and safety of a mission (Genik et al. 2005, Ellis 2000).
Depending on these results, it will be necessary to develop and employ extensive countermeasures. Initial results for the MARS500 study suggest that, in addition to their significance in the context of the cardiovascular and locomotor systems, sport and physical activity can play a part in improving neurocognitive parameters. Before this can be fully established, however, it seems necessary to learn more about the influence of changing gravity conditions on neurophysiological processes and associated neurocognitive impairment.

The effect of weightlessness and hypergravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain is going to be followed during parabolic flight by EEG and NIRS techniques. 
A feasibility study of a more complex experiment, which is planned to carry out during medium- and long-term space flight.

Die Kohärenz zwischen Gehirn Kortikale Funktion und neurokognitiven Leistungsfähigkeit während Changed Schwerelosigkeit

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Schnelle Bestimmung der Wärmeleistung und nozizeptiven Grenzwerts bei diabetischen Ratten

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations