אני מודה אנתוני טיילור להכשרה ראשונית בהקלטה תאיים vivo ו בראון מקסוול לעזרה עם הפיתוח הראשוני של טכניקת צביעה תאיים. אני מודה כסף מ לעזרה עם המאקרו התגודדות. חוקרים רבים שאיתם אני שיתפו פעולה סיפק תובנה לתוך בפיתוח טכניקה זו, כולל ר דונגה, מ Moritani, פ &#39;לואו, ר&#39; Ambalavanar. טכניקה זו פותחה בסיוע ניכר של NIH מענקים DE10132, DE15386 ו RR017971.

1. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש עם נתרן pentobarbital (IP 50mg/kg) ומניחים על משטח חימום. לגלח את העור המכסה את הגולגולת האחורי עם קוצץ בעלי חיים. בדוק את בעלי החיים כדי להבטיח רמה כירורגית של רמת הרדמה התקבל על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה הניקוד כאשר האצבעות הן צבט כמו גם העדר רפלקס palpebral. בדוק את רמת הרדמה כל 15 דקות לשמור על רמה כירורגית של anesthetisa על ידי זריקות של 15mg/kg נתרן pentobarbital כל 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה aseptic ולעשות חתך באזור המפשעה דיסטלי רק כדי הקפל שנוצר על ידי הבטן והירך הפנימית להוסיף צינורית (1 מ&quot;מ קוטר, קליי אדמס) לתוך וריד הירך, והוא עורק הירך. ביצוע חתך קו האמצע באזור submandibular, משקפים את השרירים infrahyoid. ביצוע חתך קטן קנה הנשימה להוסיף צינורית (2 מ&quot;מ קוטר), כדי לאפשר אוורור. טיי תפר סביב trachael cannual לאבטח אותו בלחץ הדם הדיאסטולי מערכתית place.Monitor ו הסיסטולי דרך צינורית העורקים. בנוסף ניטור נסיגה רפלקס palpebral כעת לנטר את לחץ הדם על מנת להעריך את רמת הרדמה. ניהול הרדמה נוספות בעת הצורך דרך צינורית ורידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חולדה לתוך מסגרת stereotaxic ולבצע craniotomy לחשוף את המוח הקטן. חבר את צינורית לקנה הנשימה אל הנשמה מכרסמים. לאוורר את חיה עם נפח של 2 ס&quot;מ 3 בקצב של 100/min עם אוויר humidified. לחץ חיובי בסוף הנשיפה של 1 ס&quot;מ H 2 O יש לשמור כדי למנוע התמוטטות ריאה. כל 15 דקות hyperinflate לריאות כדי למנוע atelectasis. ואז לכסות את פני השטח של המוח עם שמן מינרלי מחומם (30 מעלות צלזיוס). היזהר, כדי למנוע את סינוס ורידי גדול הממוקם ישירות מתחת לצומת בין הקודקודית ועצמות interparietal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל דבק cyanoacrylate למוט מצמידים את הויברטור אלקטרומגנטי ולצרף את המוט diastema של הלסת. הזז את הלסת התחתונה אותות באמצעות הפקודה כדי ויברטור מ או פלט / מחשב D או מחולל אותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים siliver-כסף כלוריד אלקטרודה הארקה מתחת לעור הסמוך craniotomy. </li></ol> 2. אלקטרודה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק microelectrodes מ זכוכית קוורץ או aluminosilicate באמצעות חולץ microelectrode אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את microelectrode עם biotinamide 5-10% מומס 0.25M KCl ו 0.5m טריס HCl חיץ (pH 7.6) או tetramethlyrhodamine 2% מלח (pH 6). בדוק עכבה אלקטרודה אלקטרודה עם הבוחן. כדי להקליט מן האקסונים בקוטר גדול להפוך אלקטרודות עם עכבה של 60-80m Ω, עבור אקסונים קטנים interneurons לעשות אלקטרודות עם עכבה של 80 150MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microelectrode לשלב ראש electrometer. דמיינו את האלקטרודה מבעד לטלסקופ קטן (20X עם reticle סגורה), אשר מקובע בעמדה מאחורי הראש של החיה. באמצעות הטלסקופ חשוב משום שהוא מאפשר אלקטרודות להיות ממוצבת stereotaxically בדייקנות רבה. </li></ol> 3. הקלטה אלקטרו והכתים תאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתח קטן מאטר פיא מפצים את המשוב קיבול, כך שכאשר האלקטרודה נוגעת המוח אות משוב מיוצר. זה מאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצרת עקירה mandibular חזר ולקדם את האלקטרודה לתוך המוח עם מנוע צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיר impalements העצבית על ידי טיפות פתאומית פוטנציאל DC ולזהות impalements העצבית intrasomatic ידי פעילות סינפטית מתמשך. מזמזמים את האלקטרודה עם לפיצוי יתר של קיבול או הקשה לעתים רחוקות לייצר חדירה לתא מוצלח. בגלל העכבה הגבוהה של האלקטרודות, תגובות עצביות הם נצפו לעתים נדירות לפני החדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדקור תא עצב ואת החדירה נחשבת יציבה, לאפיין את התגובה העצבית באמצעות רמפה ארוכה ותנועה הלסת סינוסי. 5 מפת שדה פתוח של הנוירון ידי חיטוט העור סביב הראש תוך חלל הפה עם החללית הלא מוליך כגון מקל עץ. אם רלוונטי המחקר, לבחון את התגובה של הנוירון אחרים גירויים רלוונטיים מבחינה תפקודית כגון התכווצות שרירים גירוי מזיק. ראשיים מביא 6 קולטנים עצביים nociceptive להגיב לגירויים nociceptive. Anesthesetics כללי כגון נתרן pentobarbital לא לחסום את ההולכה axonal בנוירונים מביא העיקרי אלא לדכא את ההולכה הסינפטית. לפיכך הולכה axonal ב האקסון העיקרי העצבית מביא נשמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הנוכחי (DC, 1-4nA) במשך זמן הזרקה הכולל של 15-70nA דקות. צג חדירת האלקטרודה במהלך הזריקה הנוכחית ולהפסיק אם פוטנציאל הממברנה נהיה יותר חיובי-30mV.</li></ol> 4. עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו על ידי מינון יתר של pentobarbital (140mg/kg IV) perfuse עם כלי דם ולשטוף (0.9% NaCl 38 ° C המכיל 500 יחידות של הפרין ו 1ml 2% xylocaine ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח סעיף זה ב 50-100μm באמצעות vibratome באחת המטוס, חזיתית sagittal או אופקי. Secions נאספים צף חופשי 25 ° C-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך המוח DAB ידי דוגרים בסרום 1-2% עז רגיל 1% Triton X-100 ב 0.01M PBS ואחריו הדגירה ב avidin ביוטין מורכב (01:50 עלית Vectastain). להגיב חלקים באמצעות ניקל DAB עם H 2 O 2. כדי תהליך טקסס האדום, חלקים דגירה avidin ב-ביוטין מורכב (01:50) ב-PBS לילה בשעה 4 ° C ו דגירה אז 4 ° C במשך הלילה 4% טקסס האדום avidin DCS ב PBST. Counterstain קטעים עם ניאון Nissl כתם (NeuroTrace) 20min ב 23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוירון הזריקו rhodamine, לדמיין את נוירון מוזרק ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אקס 545nm). </li></ol> 5. שילוב השיטה עם תיוג immunocytochemistry מדרדר, הדמיה confocal, ניתוח כמותי colocalization ההצלחה של שילוב בטכניקה זו עם שיטות אחרות תלויה במידה רבה על תיוג תאיים טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה דמיינו כאן יכול בקלות להיות משולבת עם תיוג העצבית מדרדר. 7-10 כדי לעשות זאת, להרדים את החיה באמצעות הטכניקה aseptic, להזריק נותב עצבי כגון peroxidase חזרת (20% peroxidase חזרת. Sigma השישי, Sigma) ו -1% נבט חיטה aggultinated peroxidase חזרת (Sigma) לאזורים היעד היקפי כגון שריר masseter. נותב זה העצבית יילקחו לתוך האקסונים הפריפריה מועבר באמצעות תחבורה axonal כדי somata motoneuron. עבור השריר masseter, 15μl של נותב מוזרק לתוך השריר באמצעות microsyringe סטרילי 10 microliter. בעלי חיים ממוקמות אז על כרית חימום במעקב עד התאושש מההרדמה והניח אז בכלובים שלהם להחלמה. לאחר 24 שעות, להרדים בעלי חיים פיזיולוגית לאפיין נוירונים intracellularly כתם אותם. אנקב את החיה כפי שתואר לעיל ורקמות סעיפים תהליך נוכחות של HRP באמצעות tetramethylbenzidine (TMB), כמו כרומגן ו tungstate נתרן כמו מייצב והתגברה עם קובלט. סעיפים מקום נתרן 1% tungstate מומס 0.1M PBS (pH 6.5) ו TMB 0.0007% מומס באתנול אצטון מוחלט על 15 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ואז להגיב סעיפים רקמה ידי הוספת 1.0 מ&quot;ל של 0.3% H 2 O 2 לכל 100 מ&quot;ל של תמיסת הדגירה של 60 דקות. לשטוף רקמות 0.1M PBS (pH 6.5) ומניחים diaminobenzidine 0.05% (pH 7.4), קובלט 0.02% ו 0.01% H 2 O 2 ב 0.1M PBS (pH 7.4) עבור 10 דקות. בשעה 37 ° C. תהליך הרקמה להדמיה של הנוירון הזריקו biotinamide כמתואר ולדמיין את יחסי הגומלין בין הנוירון חושית שכותרתו ועוד מגוון של motoneurons. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטכניקה המוצגת כאן יכול גם בקלות להיות משולבת עם immnocytochemistry. 6 כדוגמה, immunocytochemically תהליך המוח synaptophysin במדויק לאתר סינפסות בתוך הנוירונים שכותרתו (איור 3). כדי לעשות זאת, דגירה חלקים במוח נוגדן אנטי synaptophysin העכבר (1:10,000) של 2 ימים 4 ° C ולאחר מכן מדגירים את האנטי עכבר FITC (1:400) עבור 1h על 23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים שכותרתו עם סמנים ניאון או מעובדים דימות פלואורסצנטי הם אידיאליים עבור הדמיה confocal. איור 3 הוא דוגמה סעיף אופטי שהושגו עם מיקרוסקופיה confocal באוטון דרך האקסון. (איור 3). יצירת אנימציות של נוירונים שכותרתו באמצעות רכישת חלקים אופטיים מרובים באמצעות נוירון שכותרתו (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים שכותרתו בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך ניתוח כמותי colocalization. כדי לעשות זאת, להשתמש במאקרו תוכנה זמינים לציבור בשיתוף עם NIH Image (למצוא http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). בתרגום synaptophysin בתוך מסופי האקסון אחת על ידי שילוב של תיוג תאיים עם immunocytochemistry synaptophysin. 6 </li></ol> 6. נציג תוצאות: סקירה של נציג את התוצאות שניתן להשיג בשיטה זו הם באיור 1. זה גזע המוח נוירון יחיד נרשם electrophysiologically במהלך התנועה של הלסת התחתונה, וכפי ניתן בבירור לראות את התגובה של נוירון זה (איור 1 השמאלית התחתונה, כחול בהיר) היה מווסת במהלך התנועה. נוירון זה היה מוזרק עם biotinamide לאחר אפיון אלקטרו ומעובד לאחר מכן להדמיה. נוירון משוחזר (1 איור באמצע, ירוק) יכול להיות אמיתיטד לציון אנטומית, במקרה זה הגרעין מנוע trigeminal המיועד (מתאר אדום). בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה ושיקום נוירון זו ניתן לזהות כ נוירון ציר משני שרירים מביא. איור 2 ממחיש דוגמה מייצגת של התגובה הפיזיולוגית של נוירון במהלך עקירה בלסת. התגובה של הנוירון מיוצג תדירות ירי מיידי. שים לב התגובה העצבית מקרוב מחקה תזוזה mandibular המעיד על כך נוירון מסוים מספק משוב תחושתי הקשורים במצבו mandibular. באיור 3 היא תמונה בהגדלה גבוהה של האקסון מוכתם intracellularly בשילוב עם מכתים עבור synaptophysin ו Nissl כתם. שים לב colocalization של synaptophysin (צהוב) בתוך באוטון האקסון. באיור 4 הוא הנפשה של נוירון יחיד, המאופיינת פיזיולוגית ומסומן intracellularly. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירה כללית של השיטה. העליון השמאלי: עקירה mandibular. הקלטה תאיים התיכון (ירוק) נוירון יחיד (צהוב). מורפולוגיה של נוירון זה שוחזר לאחר ההקלטה הזרקת תאיים. מתאר האדום מציין מיקום של גרעין מנוע trigeminal. התחתון השמאלי: התגובה הפיזיולוגית של נוירון זה במהלך התנועה הלסת. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. התגובה הפיזיולוגית נציג תא עצב שריר בודד חושית רשמה in vivo במהלך התנועה של הלסת התחתונה. הערה הדמיון של התגובה העצבית עם עקירה בלסת. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Arborization Terminal axonal עם boutons הסינפטי (נפיחויות אדום) של נוירון intracellularly מוכתם חושי אשר הגיבו במהלך חיטוט שריר. לאחר עיבוד immunocytochemical עבור synaptophysin מראה לוקליזציה של synaptophysin בתוך באוטון axonal (צהוב). הירוק הוא Nissl פלורסנט הכתם. איור 4. אנימציה של כישור השריר העיקרי האקסון נוירון אשר מביא פיזיולוגיים התגובה נרשמה in vivo במהלך התנועה mandibular, האקסון היה אז מוכתם intracellularly ומעובד להדמיה. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">הורד וידיאו ברזולוציה גבוהה של איור 4 כאן</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">הורד וידיאו ברזולוציה בינונית של איור 4 כאן</a>

<ol>
	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם guidlines ורגולציה שנקבעו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (NIH פרסום מס &#39;86-23, מתוקנת 1985) ואוניברסיטת מרילנד Animal Care השתמש הוועדה.

השיטה מאויר כאן היא טכניקה רבת עוצמה אשר מספק תובנה חשובה לתוך הפונקציה של נוירונים בודדים איך התגובה של נוירונים בודדים תורם מעגלים עצביים. 9 הידע הזה הוא היסוד להבנת תפקוד הסנסורית. הכוח הגדול ביותר של טכניקה זו היא כי הוא מאפשר קביעה של מספר רב של פרמטרים על נ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> אלקטרומגנטית ויברטור </td><td> לינג Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> האות גנרטור </td><td> מערכות משוב </td><td> PFG605 </td><td> מסוגל לייצר אות פלט טרפז </td></tr><tr><td> אלקטרודת הזכוכית </td><td> סאטר מכשירים </td><td> AF100-68-10 </td><td> עם נימה </td></tr><tr><td> אלקטרודה חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-2000 או P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> וקטור מעבדות </td><td> SP-1120 </td><td> מאוחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> טקסס האדום avidin DCS </td><td> וקטור מעבדות </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> D-3308 </td><td> 3000 משקל מולקולרי, ליזין ניתן לתקן </td></tr><tr><td> עכבר אנטי synaptophysin נוגדן </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> פלורסנט Nissl כתם </td><td> Neurotrace, בדיקות מולקולריות </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודה הבוחן </td><td> וינסטון אלקטרוניקה </td><td> BL-1000-B </td><td> כדי למדוד עכבה אלקטרודה </td></tr><tr><td> electrometer </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Axoprobe 1A, Axoclamp 2B </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

תפקידו של נוירונים בודדים והתפקוד שלהם מעגלים עצביים הוא היסוד להבנת מנגנונים עצביים של פונקציות החושי והמוטורי. רוב החקירות של מנגנוני הסנסורית להסתמך על בדיקה או של נוירונים בעוד חיה הוא 1,2 סטטי או פעילות תאית שיא העצבית במהלך תנועה. 3,4 בעוד מחקרים אלו סיפקו את הרקע הבסיסי לתפקוד הסנסורית, הם גם לא להעריך מידע פונקציונלי אשר מתרחשת במהלך תנועה או מוגבלים ביכולתם מלא לאפיין את הפנוטיפ, אנטומיה פיזיולוגיה neurochemical של הנוירון. טכניקה מוצג כאן המאפשרת אפיון נרחב של נוירונים בודדים במהלך בתנועה vivo. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק ללמוד הנוירונים מביא העיקרי, אלא גם לאפיין motoneurons ו interneurons הסנסורית. בתחילה התגובה של נוירון בודד נרשם בשיטות אלקטרו במהלך התנועות של הלסת התחתונה ואחריו להגדרה של שדה פתוח עבור הנוירון. נותב עצביים לאחר מכן מוזרק intracellularly לתוך תא העצב לבין המוח מעובד כך הנוירון ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ אור, אלקטרונים או confocal (איור 1). מורפולוגיה מפורט של הנוירון מאופיין הוא שיחזר אז כך מורפולוגיה העצבית יכולה להיות בקורלציה עם התגובה הפיזיולוגית של נוירון (איורים 2,3). בתקשורת זה פרטים מפתח חשוב טיפים ליישום מוצלח של טכניקה זו מסופקים. פרטים נוספים המוערכים ניתן לקבוע עבור נוירון הנחקרת על ידי שילוב שיטה זו עם שיטות אחרות. תיוג העצבית מדרדר ניתן להשתמש כדי לקבוע נוירונים עם סינפסות שבו נוירון שכותרתו: נחישות ובכך מאפשר מפורט של מעגלים עצביים. Immunocytochemistry ניתן לשלב עם שיטה זו לבחון נוירוטרנסמיטורים בתוך הנוירון שכותרתו כדי לקבוע את פנוטיפים הכימי של הנוירונים שבה צמתי נוירונים שכותרתו. הנוירון שכותרתו יכול גם להיות מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לקבוע את התכונות ultrastructural ו microcircuitry של הנוירון המסומן. בסך הכל טכניקה זו היא שיטה רבת עוצמה ביסודיות לאפיין נוירונים במהלך בתנועה vivo ובכך מאפשר תובנה משמעותית לתוך תפקיד של הנוירון בתפקוד הסנסורית.

Watch this Scientific Journal Video about Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement at JoVE.com

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Maryland. הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.

Video: Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank yesterday."), however such reports can often be unreliable or sensitive to response bias 1, and may be unobtainable in some participant populations. Furthermore, explicit reports only reveal when information has reached consciousness and cannot comment on when memories were accessed during processing, regardless of whether the information is subsequently accessed in a conscious manner. Eye movement monitoring (eye tracking) provides a tool by which memory can be probed without asking participants to comment on the contents of their memories, and access of such memories can be revealed on-line 2,3. Video-based eye trackers (either head-mounted or remote) use a system of cameras and infrared markers to examine the pupil and corneal reflection in each eye as the participant views a display monitor. For head-mounted eye trackers, infrared markers are also used to determine head position to allow for head movement and more precise localization of eye position. Here, we demonstrate the use of a head-mounted eye tracking system to investigate memory performance in neurologically-intact and neurologically-impaired adults. Eye movement monitoring procedures begin with the placement of the eye tracker on the participant, and setup of the head and eye cameras. Calibration and validation procedures are conducted to ensure accuracy of eye position recording. Real-time recordings of X,Y-coordinate positions on the display monitor are then converted and used to describe periods of time in which the eye is static (i.e. fixations) versus in motion (i.e., saccades). Fixations and saccades are time-locked with respect to the onset/offset of a visual display or another external event (e.g. button press). Experimental manipulations are constructed to examine how and when patterns of fixations and saccades are altered through different types of prior experience. The influence of memory is revealed in the extent to which scanning patterns to new images differ from scanning patterns to images that have been previously studied 2, 4-5. Memory can also be interrogated for its specificity; for instance, eye movement patterns that differ between an identical and an altered version of a previously studied image reveal the storage of the altered detail in memory 2-3, 6-8. These indices of memory can be compared across participant populations, thereby providing a powerful tool by which to examine the organization of memory in healthy individuals, and the specific changes that occur to memory with neurological insult or decline 2-3, 8-10.

Eye movement monitoring (or eye tracking) reveals where in space the eyes linger, when and for how long. Here, we demonstrate how eye tracking can be used to investigate the integrity of memory in multiple participant populations, without requiring verbal, or otherwise explicit, reports.

תנועת העין ניטור של זיכרון

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and focused on psychological aspects. Until now, objective observation of neurophysiological parameters has not been carried out - undoubtedly because the technical and methodological means have not been available -, investigations into the neurophysiological effects of weightlessness are in their infancy (Schneider et al. 2008).
While imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) would be hardly applicable in space, the non-invasive near-infrared spectroscopy (NIRS) technique represents a method of mapping hemodynamic processes in the brain in real time that is both relatively inexpensive and that can be employed even under extreme conditions. The combination with electroencephalography (EEG) opens up the possibility of following the electrocortical processes under changing gravity conditions with a finer temporal resolution as well as with deeper localization, for instance with electrotomography (LORETA).
Previous studies showed an increase of beta frequency activity under normal gravity conditions and a decrease under weightlessness conditions during a parabolic flight (Schneider et al. 2008a+b). Tilt studies revealed different changes in brain function, which let suggest, that changes in parabolic flight might reflect emotional processes rather than hemodynamic changes. However, it is still unclear whether these are effects of changed gravity or hemodynamic changes within the brain. Combining EEG/LORETA and NIRS should for the first time make it possible to map the effect of weightlessness and reduced gravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain. Initially, this is to be done as part of a feasibility study during a parabolic flight. Afterwards, it is also planned to use both techniques during medium- and long-term space flight.
It can be assumed that the long-term redistribution of the blood volume and the associated increase in the supply of oxygen to the brain will lead to changes in the central nervous system that are also responsible for anaemic processes, and which can in turn reduce performance (De Santo et al. 2005), which means that they could be crucial for the success and safety of a mission (Genik et al. 2005, Ellis 2000).
Depending on these results, it will be necessary to develop and employ extensive countermeasures. Initial results for the MARS500 study suggest that, in addition to their significance in the context of the cardiovascular and locomotor systems, sport and physical activity can play a part in improving neurocognitive parameters. Before this can be fully established, however, it seems necessary to learn more about the influence of changing gravity conditions on neurophysiological processes and associated neurocognitive impairment.

The effect of weightlessness and hypergravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain is going to be followed during parabolic flight by EEG and NIRS techniques. 
A feasibility study of a more complex experiment, which is planned to carry out during medium- and long-term space flight.

לכידות בין תפקוד המוח קליפתיים וביצועים נוירוקוגניטיבי במהלך תנאי הכבידה השתנה

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique known as electron probe microanalysis (EPMA) are described. Intramitochondrial calcium is a particular focus because of the critical role that mitochondrial calcium overload plays in neurodegenerative diseases. The method is based on the analysis of X-rays generated in an electron microscope (EM) by interaction of an electron beam with the specimen. In order to maintain the native distribution of diffusible elements in electron microscopy specimens, EPMA requires &#34;cryofixation&#34; of tissue followed by the preparation of ultrathin cryosections. Rapid freezing of cultured cells or organotypic slice cultures is carried out by plunge freezing in liquid ethane or by slam freezing against a cold metal block, respectively. Cryosections nominally 80 nm thick are cut dry with a diamond knife at ca. -160 &#176;C, mounted on carbon/pioloform-coated copper grids, and cryotransferred into a cryo-EM using a specialized cryospecimen holder. After visual survey and location mapping at &#8804;-160 &#176;C and low electron dose, frozen-hydrated cryosections are freeze-dried at -100 &#176;C for ~30 min. Organelle-level images of dried cryosections are recorded, also at low dose, by means of a slow-scan CCD camera and subcellular regions of interest selected for analysis. X-rays emitted from ROIs by a stationary, focused, high-intensity electron probe are collected by an energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometer, processed by associated electronics, and presented as an X-ray spectrum, that is, a plot of X-ray intensity vs. energy. Additional software facilitates: 1) identification of elemental components by their &#34;characteristic&#34; peak energies and fingerprint; and 2) quantitative analysis by extraction of peak areas/background. This paper concludes with two examples that illustrate typical EPMA applications, one in which mitochondrial calcium analysis provided critical insight into mechanisms of excitotoxic injury and another that revealed the basis of ischemia resistance.

This paper describes the application of cryoanalytical electron microscopy to the quantitative measurement of total calcium content and distribution at subcellular resolution in physiologically defined biological specimens.

מדידה של סידן סה&quot;כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...