Demonstramos um método simples para criar e implementar uma configuração pulmonar ex vivo do zero. Isso permite uma configuração acessível e modular que pode ser implementada para uma variedade de configurações. A técnica apresentada aqui é acessível, modular e adaptável aos laboratórios que configuram o protocolo.
A operação ex vivo pode ser usada para complementar modelos in vivo para ajudar a elucidar novos mecanismos. Esta configuração DIY foi projetada para estudar os pulmões em um ambiente controlado. Ele se alinha com o foco principal de pesquisa do nosso laboratório, que é investigar várias abordagens para melhorar o resultado após a RCP.
No entanto, a configuração pode ser adaptada para atender a diferentes objetivos de pesquisa, tornando-a altamente versátil, A cirurgia requer um conhecimento básico de anatomia e fisiologia respiratória e pode ser rapidamente dominada seguindo o protocolo. No entanto, é vital seguir diligentemente os passos descritos em nosso protocolo e, acima de tudo, proteger os pulmões, especialmente ao remover as costelas. Para realizar uma traqueostomia, aperte a pele de um rato anestesiado acima da traqueia com uma pinça e corte a pele.
Disseque sem rodeios o músculo e o tecido para alcançar a traqueia, garantindo que não haja sangramento. Em seguida, passe uma pinça curva por baixo da traqueia e abra-a para permitir que haja espaço para passar suturas 3-0 por baixo. Em seguida, pré-amarre as suturas em um nó de caixa.
Faça uma pequena incisão entre os anéis de cartilagem da traqueia e insira a cânula traqueal. Amarre a sutura para evitar que o ar escape da incisão traqueal e para garantir que a cânula não esteja sobrecarregando a traqueia. Assim que a cânula traqueal estiver presa, comece a ventilar o rato.
Usando uma tesoura cirúrgica grande e uma pinça, remova o pelo do abdômen do rato. Segure o processo xifóide com a pinça e faça uma pequena incisão horizontal abaixo das costelas, tomando cuidado para manter o diafragma intacto. Amplie o corte horizontal para expor todo o diafragma.
Com uma seringa de calibre 22, injete heparina na veia cava inferior, tomando cuidado para não perfurar os pulmões. Segure o processo xifóide com uma pinça e corte cranialmente ao longo do esterno, visualizando constantemente os pulmões para evitar cortá-los. Afaste a caixa torácica usando duas pinças grandes e corte a veia cava inferior para sacrificar o rato por exsanguinação.
Apare qualquer excesso de timo para permitir uma visualização mais fácil da vasculatura pulmonar. Localize a artéria pulmonar e passe uma pequena pinça curva por baixo. Novamente, passe uma sutura 3-0 por baixo e pré-amarre em um nó de caixa.
Em seguida, faça uma pequena incisão no ventrículo direito do coração e insira a cânula PA. Prenda a cânula usando a sutura e comece a perfundir a 1,5 mililitros por minuto. Extirpar imediatamente o ápice do coração para evitar o acúmulo de pressão nos pulmões.
Usando uma pequena pinça curva, rompa a válvula mitral e confirme visualmente se a pinça pode entrar no átrio esquerdo sem obstrução. Enrole firmemente uma sutura 3-0 ao redor do coração abaixo do átrio e insira a cânula PV no átrio esquerdo, garantindo que o tampão possa fluir para fora dela antes de amarrar a sutura. Em seguida, usando uma tesoura de ponta romba, corte qualquer excesso de tecido entre a cavidade torácica e a incisão da traqueostomia para evitar danificar a traqueia.
Certifique-se de que a traqueia abaixo da cânula traqueal e todo o bloco coração-pulmão estejam visíveis. Para remover o bloco coração-pulmão e a traqueia, segure a cânula traqueal e use uma tesoura curva de ponta romba para extirpar o tecido conjuntivo atrás da traqueia. A viabilidade pulmonar após isquemia e reperfusão é apresentada.
O maior tempo de isquemia para permitir 150 minutos de reperfusão foi de oito minutos. É crucial canular adequadamente a vasculatura para que os pulmões isolados permaneçam viáveis durante todo o experimento. Os pulmões permanecem intactos após o procedimento, permitindo que medidas básicas, como peso úmido ou seco ou histologia, sejam realizadas após o experimento.
