Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health conceder R01HL086939 (NCC).

Neste protocolo, demonstramos um isolado, ventilado, preparação de pulmão perfundido de rato que tenha sido utilizado para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica em pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações (Tuchscherer, Webster, e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). Em breve, os pulmões do rato são cirurgicamente isolada dos tecidos adjacentes, colocados em uma câmara climatizada (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilado (Módulo de Controle Ventilatório (VCM)-R com timer módulo contador (TCM); Harvard aparelhos). A vasculatura pulmonar é perfundido com aquecida meio de cultura RPMI 1640 celular com Ficoll 3,5% usando uma bomba de seringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para gerar o constante fluxo de formas de onda ou uma bomba de alta freqüência oscilatória (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN) em paralelo com a bomba de seringa para criar pulsátil de fluxo vascular pulmonar formas de onda. Transdutores de pressão (P75, Aparelho Harvard) medir a pressão da artéria pulmonar instantânea (PAP) ea pressão atrial esquerda (PAE). Vazão instantânea (Q) é medido com um medidor de fluxo de in-line (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos são derivados a partir dessas medições, que fornecem insights sobre vascular pulmonar fisiologia e patologia e pós-carga do ventrículo direito. 1. Equipamento: <ol><li> Pulmão isolado set-up, incluindo ventilador do mouse </li><li> Sistema de aquisição de dados e computador com programa LabView </li><li> Dois transdutores de pressão e medidor de vazão para o fluxo de perfusato </li><li> Transdutor de pressão e medidor de vazão (pnemotachometer) para o fluxo das vias aéreas </li><li> Bomba de alta freqüência oscilatória e computador com Win programa de teste </li><li> Lança / zoom microscópio da lâmpada, </li><li> Banho de aquecimento com bomba de alto débito para o sistema IL-1 </li></ol> 2. Preparando o sistema IL-1 <ol><li> Água destilada aquecida a 37 ° C por banho de aquecimento é distribuída para o interior da IL-1 do sistema. </li><li> Todas as bombas, e transdutores a IL-1 cânula são conectados através de tubos limpos e toda a tubulação é lavada com água destilada aquecida a 37 ° C. Bolhas de ar, o que poderia viajar para o pulmão e causar edema, deve ser removido. Tubulação da bomba de fluxo oscilatório para o sensor de fluxo e do sensor de fluxo para a cânula da artéria pulmonar são lavados com PBS 1%. </li><li> O P75 transdutores de pressão são zerados, fechando a válvula para a cânula, a abertura das válvulas para a atmosfera e, em seguida, apertar o botão automático de zero do amplificador PLUGSYS. Então, a válvula para a atmosfera é fechada ea válvula para a cânula aberto. </li><li> A peça de cerâmica porosa na via de ventilação do sistema de IL-1 é molhada para fornecer umidade. </li></ol> 3. Soluções <ol><li> Prepare 3,5% por volume de solução de Ficoll-RPMI filtro estéril e os meios de comunicação. Filtragem a mídia garante que não haja grandes partículas que poderiam involuntariamente embolize o pulmão. Usando meios estéreis também reduz a probabilidade de edema súbito desenvolvimento no pulmão. Preencher uma seringa de 10 ml com RPMI para cirurgia e uma seringa de 60 ml com RPMI para cada ensaio experimental. Aqueça o perfusato a 37 ° C banho-maria. </li><li> Prepare 1ml de peso corporal heparina 500IU/100g do mouse (aproximado). O sal de heparina é 158IU/mg. Para um rato g ~ 25, mix 1,25 mg de sal heparina com 1ml solução PBS em um tubo de microcentrífuga de pequeno porte. </li></ol> 4. Ventilar um rato <ol><li> Após uma injeção intraperitoneal de pentobarbital 150 mg em solução por quilograma para o mouse, garantir a anestesia profunda, realizando uma pitada rígido em uma pata. Se não houver reação, preparar o mouse para a cirurgia fixando suas patas da frente para corkboard para a estabilidade. Nota: Durante todo o experimento profundidade anestésica é monitorado observando cuidadosamente o animal. Os pinos nas patas e incisões freqüentes atuar como estímulos nocivos, a falta de resposta a que confirma que o animal permanece em um plano cirúrgico de anestesia. </li><li> Pulverizar o peito com álcool a 95% para molhar as de pele e utilize uma pinça reta para agarrar a pele no pescoço. Corte de 1 cm de abertura na pele com a tesoura reta. </li><li> Uma vez que o interior do gargalo está exposta, remover todo o tecido glandular e músculo branco superficial, olhando para o esôfago e traquéia. Isolar o esôfago e traquéia do tecido em ambos os lados e posteriormente. </li><li> Inserir a pinça pequena dobrada sob a traquéia e pegar um pedaço de fio do outro lado. Puxe a sutura sob a traquéia e dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó. </li><li> Um pequeno corte em ângulo &quot;v&quot; na traquéia com uma tesoura pequena, não cortar todo o caminho através da traquéia. Mover a placa da cortiça e do rato para a IL-1 aquecida sistema. Usando as duas pinças blunt, pegue a cânula traqueal e da traquéia abaixo do &quot;v&quot;. Então, deslize a cânula traqueal no tracheA através do &quot;v&quot; de abertura. Aperte a sutura em torno de traquéia e cânula traqueal para garantir a cânula dentro da traquéia. Amarrar o nó. </li><li> Iniciar ventilação (inspiração de 50%, 90 respirações / min, com a inspiração profunda) com ar ambiente. </li></ol> 5. Perfusão um rato ventilado 5.1. Acessar o ventrículo direito para injetar heparina <ol><li> Pulverizador do peito do rato com álcool novamente para re-molhar a pele. Retire toda a pele no peito acima das costelas com a pinça em linha reta e tesoura reta. Corte para cima ao longo do esterno. Levante a pele em cada lado e depois cortar a pele, seguindo a linha das costelas inferiores. </li><li> Compreender o processo xifóide, na parte inferior do esterno com uma pinça e cortar um buraco no diafragma usando a tesoura reta. Agarre o diafragma com a pinça e corte-o longe das costelas. </li><li> Compreender o processo xifóide novamente com a pinça (mão esquerda) e use a bola ponta, tesoura angulada para cortar o esterno e costelas por meio, tomando cuidado para não cortar os pulmões, coração ou dos vasos sanguíneos (use a bola ponta-on a tesoura para guiá-lo). Haverá sangue, mas desde que a ponta da tesoura é contra o esterno, o coração e os pulmões não será cortado. </li><li> Segure as costelas do lado esquerdo e cortar o máximo de costelas, conforme necessário para expor o coração. Injecte lentamente o ventrículo direito com 0,1 ml solução de heparina. Este passo é importante para prevenção de coágulos de sangue no pulmão, que danificam as células endoteliais e irá prejudicar a perfusão. A heparina deve ser injetado enquanto o coração ainda está batendo. </li></ol> 5.2. Canular a principal artéria pulmonar <ol><li> Cortar o resto das costelas (lado esquerdo e direito), usando as costas (arredondado) final do fórceps para empurre os pulmões de distância da parede torácica. Agarrando os pulmões se irá danificar o tecido delicado. Contato acidental entre as pontas de tesoura eo tecido pulmonar também irá causar danos. </li><li> Mover o microscópio no lugar sobre pulmão. Cortar o tecido glandular e gordura na parte superior do coração. Use a pinça para retirá-lo longe das artérias e veias e depois corte com a tesoura primavera, enquanto o tecido é em tensão. </li><li> Usando um outro conjunto de pinças blunt, colher da direita para a esquerda da parte superior do coração sob átrio esquerdo / ventrículo para chegar a ponta da pinça sob a aorta ea artéria pulmonar (PA). Faça isso com cuidado, não deve haver resistência para as pinças. Usando uma pinça sem corte reduz a probabilidade de acidentalmente punção da artéria pulmonar ou aorta. </li><li> Uma vez que a ponta pinça está sob a aorta e AP, pegue um pedaço de sutura e sobreviver. Dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó. </li><li> Opcional: use a tesoura angulada para remover a metade inferior do corpo. Cortar através das costelas e coluna vertebral; corte a aorta ea veia cava fará com que uma quantidade significativa de sangue flua - use um Q-dica para estancar o fluxo. Coloque em um saco para descarte. </li><li> Primeiro-PA cânula com 4 ml de uma seringa de 10 ml de RPMI. Verifique se toda a tubulação está livre de bolhas de ar. Perfusão do pulmão com água destilada ou bolhas resultará em edema. </li><li> Corte um pequeno entalhe na parede livre do ventrículo direito e inserir a cânula PA, que aponta para baixo e à direita. A ponta da cânula deve ser visível através da parede transparente do PA. Infundir uma pequena quantidade de RPMI para confirmar a sua localização. Aperte a sutura ao redor da cânula aorta, e PA e amarrar o nó. Note que, neste ponto, a aorta também é amarrado para perfusão real não deve começar até o átrio esquerdo canulado é. </li></ol> 5.3. Canular o átrio esquerdo <ol><li> Corte um entalhe na parte inferior do ventrículo esquerdo e inerte do átrio esquerdo (LA) cânula, visando cima. Leve pressão pode ser necessário para abrir a válvula mitral nessa direção. No local correto, a ponta da cânula vai escorregar completamente e ser seguro, sem sutura. </li></ol> 5.4. Comece a perfusão <ol><li> Manualmente infundir RPMI da seringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto até RMPI é evidente na tubulação de saída (rosa-ish cor em contraste com o PBS claro). Se não há fluxo na saída de tubulação, re-posição da cânula LA. Se nenhuma saída pode ser obtida com re-posicionamento, verifique se há um vazamento na artéria pulmonar. Um vazamento ou ruptura na artéria pulmonar não pode ser reparado, o que é motivo para abortar o experimento. </li><li> Conecte uma seringa de 60 ml para a cânula PA através da IL-1 do sistema e começar a infusão 1mL/min de perfusato, verificação de vazamentos e certificando-se nos pulmões ficam brancos, o que mostra que RPMI está substituindo o sangue nos pulmões. Perfundir com fluxo lento por dois minutos. </li></ol> 6. Medição pulsátil e constante pressão pulmonar Fluxo de Relacionamentos <ol><li> Para os estudos de fluxo pulsátil, primeiro defina os deslocamentos de pistão oscilatório bomba emos níveis desejados para cada freqüência na WinTest programa baseado em experiências anteriores. Variabilidade devido na estrutura pulmonar e mecânica, os deslocamentos devem ser ajustados para cada rato. Definir fluxo constante para o nível desejado. Abra a válvula na bomba oscilatório e começar a gravação de dados direito antes de executar o perfil de fluxo oscilatório (programa Wintest). Abra o arquivo de dados e traçar o fluxo experimental (Q) em Excel. Ajuste os deslocamentos de pistão oscilatório bomba em cada frequência (programa Wintest) de modo que Q e Q max min são tão desejado. </li><li> Para ensaios de fluxo constante, fechar a válvula na bomba oscilatório. Se essa válvula é deixada aberta, a bomba oscilatório age como um capacitor, amortecendo as mudanças de uma taxa de fluxo para o outro. Coletar dados para pelo menos 10 segundos a cada taxa de fluxo ou até que a pressão PA não muda por mais de 5%. </li><li> Para medições de vazão ou pulsátil ou contínuo, ventilação velhos a uma pressão constante antes da coleta de dados. Retomar a ventilação imediatamente após a coleta de dados. </li><li> Preste atenção para RPMI na tubulação das vias aéreas, isto é evidência de edema e é motivo para abortar o experimento. Além disso, não deixe RPMI atingir a pressão das vias aéreas ou sensores de fluxo, pois irá danificar os transdutores. </li></ol> 7. Resultados representativos: Resultados representante constante: No pulmão isolado set-up o pesquisador tem a capacidade de controlar de forma independente, não só o fluxo pulmonar Q mas também as vias aéreas pressão P do ar e deixou LAP pressão atrial. Isto é vantajoso porque Q, P ar e LAP influenciar a vasculatura pulmonar e consequente PAP pressão da artéria pulmonar. Outra vantagem é que os resultados obtidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático 1, status de volume e anestesia 2. PAP alterações induzidas pela escada-Q para mudanças na fixa P ar e fixa ou variável LAP são mostrados na Figura 1. Note-se que na preparação de pulmão isolado, a cânula LAP está normalmente ligado ao tubo que direciona o perfusato em um recipiente de resíduos. Com este tubo no lugar, LAP é linearmente dependente Q devido ao fluxo de Poiseuille. No entanto, a altura da tomada e recipiente de resíduos pode ser ajustado manualmente para fornecer uma constante, LAP não-zero ou a tubulação pode ser removido para permitir de zero LAP que é independente de Q. Representante Resultados pulsátil: Enquanto arbitrária pulsátil do fluxo de onda pode ser gerada com este sistema, que normalmente geram fluxo da forma Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min, nas freqüências de f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz para avaliar a impedância linearizada da vasculatura pulmonar (Figura 2: painel superior). A partir das medições resultantes LAP PAP, e Q, magnitude da impedância vascular pulmonar (Z) e fase (θ) são calculados pela primeira decomposição um ciclo completo da AP sinusoidal = PAP LAP-Q e em cada frequência sinusoidal taxa de fluxo de impostos em uma série de harmônicos sinusoidal usando uma transformada de Fourier. A relação da pressão de transformar a fluir rendimentos transformar a impedância vascualar pulmonar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), que tem magnitude Z e fase θ. Impedância de entrada Z 0, impedância característica Z C, e índice de reflexão da onda R W, são calculados a partir da magnitude da impedância. Em particular, Z 0 é calculado a partir de Z a 0 harmônica (f = 0 Hz), calculados sobre todas as freqüências, Z C é calculada como a média de Z entre o mínimo primeiro (5 Hz) e 20 Hz, e R W é calculado como (Z-Z 0 C) / (Z + Z 0 C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 constante fluxo de formas de onda (linha superior) e as pressões resultantes. (Segunda linha: PAP, P ar, LAP) em função do tempo com diferentes combinações de LAP e ar P. A linha inferior mostra PAP vs P. Em (A) e (B), aumenta e diminui com LAP Q porque a tubulação de saída foi no lugar. Esta tubulação foi removido para (C) de modo que LAP é constante e independente de P. Em (D) e (E) a altura da tubulação de saída foi ajustada manualmente para que LAP é maior, mas independente do Q. P ar era tanto a inspiratório final (A, C, D) ou pressão expiratória final (B, E). <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 fluxo pulsátil forma de onda Q (painel superior) e as pressões resultantes (painel inferior: PAP LAP, e P ar). Como uma função do tempo. A partir dessas pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos, PVZ pode ser calculado, o que reflete a pós-carga ventricular total direita.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Etapas críticas na cirurgia É fundamental que se tenha o cuidado ao cortar a caixa torácica longe dos pulmões. Os pulmões devem ser completamente expostos e desinibida por tecidos em volta durante a inflação, mas não danificada durante o processo de isolamento. O uso de um objeto liso como o back-end da pinça pode ser usada para manter os pulmões de distância da parede torácica para que haja um caminho claro para a tesoura para cortar. Outro passo fundamental é a colocação da sut...

<table><tbody><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>RPMI with GLN 6/PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-57</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 70</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2878-100g</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Angled Ball Iris scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14109-09</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors - straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>14106-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Medical Biology Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Lauda E100 ECO-line 003 </td><td>VWR international</td><td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td><td>Harvard Apparatus</td><td>739904</td><td></td></tr><tr><td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730020</td><td></td></tr><tr><td>TS410 Flow Modules</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td><td>Transonic</td><td>ME 4 PXN</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74900-20</td><td></td></tr><tr><td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td><td>Amatheon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

O isolado, ventilado e instrumentado preparação de pulmão do rato permite constante e pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relacionamentos para ser medido com controlo independente sobre a taxa de fluxo arterial pulmonar, forma de onda vazão, pressão das vias aéreas e da pressão atrial esquerda. Resistência vascular pulmonar é calculado com base multi-ponto, constante pressão de fluxo de curvas; impedância vascular pulmonar é calculado a partir pulsátil da pressão do fluxo de curvas obtidas em uma faixa de freqüências. Como agora reconhecida clinicamente, impedância é uma medida superior de pós-carga ventricular direita do que a resistência, pois inclui os efeitos da complacência vascular, que não são desprezíveis, principalmente na circulação pulmonar. Três métricas importantes de impedância - o zero hertz impedância Z 0, a impedância característica Z C, eo índice de reflexão da onda R W - fornecer a introspecção em distal área transversal disponível para o fluxo arterial, rigidez arterial proximal e da impedância a montante ea jusante incompatibilidade, respectivamente. Todos os resultados obtidos no isolado, ventilado e pulmões perfundidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático, o estado do volume e os efeitos da anestesia. Temos utilizado esta técnica para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica sobre a resistência e impedância, e para diferenciar entre sítios de ação (ie, proximal versus distal) de drogas vasoativas e doenças usando a dependência da pressão de Z C. Além disso, quando estas técnicas são usadas com os pulmões de linhagens geneticamente modificadas de ratos, os efeitos do nível molecular defeitos na estrutura e função vascular pulmonar pode ser determinada.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

characterization-isolated-ventilated-instrumented-mouse-lung-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K visualizações.  University of Wisconsin – Madison. O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Vídeo: Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform necropsies rapidly and efficiently from studies without sacrificing the quality of the tissues procured. The goal of this protocol is to present a method to rapidly perfuse, inflate, and fix mouse lungs for downstream histological analysis. This method does not standardize lung inflation; thus, it does not require any special procedures or equipment and instead simply instills fixative directly through the trachea following perfusion through the heart. This allows for sufficient estimation of tumor size, histology, and scoring. This also allows for the collection of frozen tissue prior to lung tissue fixation. This method is limited in that it does not allow for later morphometric quantification of the lung; however, it is more than sufficient for lung tumor analysis from genetically engineered mouse models (GEMMs), syngeneic models, as well as xenograft tumor and metastasis studies.

The purpose of this method is to present a simple and efficient method for the perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs for the examination of lung tumor pathology and evaluation of metastases to the lung.

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Pesquisa do câncer

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ventilation. Up to now, the underlying mechanisms are not fully understood. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. This vessel section is responsible for the blood supply of an individual acinus, which is defined as the portion of lung distal to a terminal bronchiole. Intra-acinar arteries are mostly located in that part of the lung that cannot be selectively reached by a number of commonly used techniques such as measurement of the pulmonary artery pressure in isolated perfused lungs or force recordings from dissected proximal pulmonary artery segments1,2. The analysis of subpleural vessels by real-time confocal laser scanning luminescence microscopy is limited to vessels with up to 50 &#181;m in diameter3.
We provide a technique to study HPV of murine intra-pulmonary arteries in the range of 20-100 &#181;m inner diameters. It is based on the videomorphometric analysis of cross-sectioned arteries in precision cut lung slices (PCLS). This method allows the quantitative measurement of vasoreactivity of small intra-acinar arteries with inner diameter between 20-40 &#181;m which are located at gussets of alveolar septa next to alveolar ducts and of larger pre-acinar arteries with inner diameters between 40-100 &#181;m which run adjacent to bronchi and bronchioles. In contrast to real-time imaging of subpleural vessels in anesthetized and ventilated mice, videomorphometric analysis of PCLS occurs under conditions free of shear stress. In our experimental model both arterial segments exhibit a monophasic HPV when exposed to medium gassed with 1% O2 and the response fades after 30-40 min at hypoxia.

Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is an important physiological phenomenon by which at alveolar hypoxia lung perfusion is matched to ventilation. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. Here, we describe our protocol for the analysis of HPV of murine pulmonary vessels with diameters of 20-100 &mu;m.

Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Medicina

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Biologia

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...

Establishment of an Ex Vivo Lung Perfusion Rat Model for Translational Insights in Lung Transplantation

Since the establishment of lung transplantation as a therapeutic strategy for advanced lung diseases, the scientific community is faced with the problem of a low number of lungs considered viable for the donation process. In recent decades, however, this scenario has been positively changed, given the development of ex vivo lung perfusion (EVLP) as a strategy for evaluating and reconditioning marginal lungs. The establishment of EVLP in large transplant centers has favored an increase in the number of lung transplants, both by increasing the diagnostic accuracy of lung function and by constituting an effective platform for the reconditioning of lung grafts. In this context, faced with ethical and logistical issues, as well as in the study of immunological factors associated with lung transplantation, the development of rodent EVLP models has become important, given their reliability, the possibility of genetic manipulation, and lower costs. This paper describes a protocol for establishing a rat EVLP model and shows the inflammatory profile associated with the perfused lungs. This will help propagate knowledge about the rat EVLP model, promoting our understanding of the biological responses associated with that revolutionary technique.

Establishment of an Ex Vivo Lung Perfusion Rat Model for Translational Insights in Lung Transplantation

Here, we describe the necessary steps for establishing a rat EVLP model and show the inflammatory profile associated with the perfused lungs. The aim is to propagate knowledge and experiences about the rat EVLP model, enabling the integral understanding of the biological responses associated with that revolutionary technique.

Since the establishment of lung transplantation as a therapeutic strategy for advanced lung diseases, the scientific community is faced with the problem ...

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after cardiac death (DCD). However, a critical challenge remains in maximizing the number of viable lungs that meet stringent criteria for clinical use. Ex vivo lung perfusion (EVLP) emerges as a promising technology to evaluate and potentially improve the function of donated lungs. This paper describes the development of a cost-effective and reproducible small animal experimental platform specifically designed for EVLP research. This platform offers a high degree of customization, enabling researchers to tailor experimental parameters to address specific research questions within the field of EVLP. The team established a rat model to simulate DCD and implemented a two-stage preservation approach. Lungs were subjected to static cold storage using a perfusate solution at 4 &#176;C for 4 h, followed by normothermic EVLP for another 4 h. Researchers evaluated various lung function parameters, including pulmonary vascular resistance, pulmonary dynamic compliance, blood gas measurements of the perfusate, and apoptotic cell death in lung tissues. The study demonstrates that EVLP could significantly improve the functional performance of DCD lungs compared to simple cold storage at 4 &#176;C, suggesting that EVLP has the potential to mitigate ischemia-reperfusion injury and enhance graft function following circulatory death, thereby increasing the pool of transplantable lungs.

The objective is to develop a new ex vivo lung perfusion (EVLP) model in rats that can sustain consistent lung function for 4 h throughout EVLP and furnish the industry with implementation specifics that will offer a sturdy method for applying EVLP to rodent models.

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro models. Laboratories wishing to use isolated lungs need to be aware of important steps and inherent challenges to establish a setup that is affordable, reliable, and that can be easily adapted to fit the topic of interest. This paper describes a DIY (do it yourself) model for ex vivo rat lung ventilation and perfusion to study drug and gas effects on pulmonary vascular tone, independent of changes in cardiac output. Creating this model includes a) the design and construction of the apparatus, and b) the lung isolation procedure. This model results in a setup that is more cost-effective than commercial alternatives and yet modular enough to adapt to changes in specific research questions. Various obstacles had to be resolved to ensure a consistent model that is capable of being used for a variety of different research topics. Once established, this model has proven to be highly adaptable to different questions and can easily be altered for different fields of study.

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lungs are useful for a variety of experiments to collect physiological data while excluding the confounding variables of in vivo experiments. Commercial setups are often expensive and limited in the types of data they can collect. We describe a method for building a fully modular setup, adaptable for various study designs.

Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...

Mouse Lung Preparation for Flow Cytometry: Generating Cell Suspension from Lung Tissue for Flow Cytometric Analysis

Source: Moll, H. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58101/orthotopic-transplantation-syngeneic-lung-adenocarcinoma-cells-to">Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the preparation of mouse lung cell suspension for flow cytometric analysis to study PD-L1 expression of lung adenocarcinoma cells.

Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

Source: Moll, H. P., et al. Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression. J. Vis. Exp. (2019).
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Câncer de Pulmão

Estudos ex vitro

Ex vivo Lung Perfusion: A Technique for Pulmonary Research in a Rabbit Model

Source: Pacheco-Baltazar, A., et al., <a href="https://www.jove.com/v/62734">Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video shows an ex vivo technique for isolated lung perfusion. It is a tool for pulmonary research that will aid studies of various physiological and pathological mechanisms involved in lung transplantation procedures.

Perfusão Pulmonar Ex vivo: Uma Técnica para Pesquisa Pulmonar em Modelo de Coelho

Source: Pacheco-Baltazar, A., et al., Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2021).
This video shows an ex vivo technique for ...

Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

Método de Isolado

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho

Establishment of an Ex Vivo Lung Perfusion Rat Model for Translational Insights in Lung Transplantation

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

Perfusão Pulmonar Ex vivo: Uma Técnica para Pesquisa Pulmonar em Modelo de Coelho