O autor agradece a Dr. Jin Gao para PGS síntese, o Dr. Peter Crapo para perspicaz discussão para biorreator de instalação, os drs. Mohamed Ezzelarab e Wei Wu para explanting artérias carótidas babuíno. Este estudo foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (R01 HL089658).

1. Andaime Tubular Fabricação <ol><li> Prepare tubos de vidro (comprimento = 70 mm, diâmetro externo = 9,0 mm, espessura da parede = 1,0 mm; peças pequenas, Miramar, FL) como um molde para andaime. </li><li> Prepare 1,0 wt / vol% ácido hialurônico (AH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pela dissolução de 100 mg de HA em 10 ml de água deionizada. Misture usando um rotator durante a noite até que não haja bolhas de ar na solução. </li><li> Despeje solução de HA de 1,0% no topo do tubo de vidro. Deixe-a fluir lentamente ao longo da parede interna do molde. Vire o tubo quando a solução atingiu o fundo do molde usando o rotator e repita este passo até que a parede interna do molde é revestido uniformemente pela solução. </li><li> Após o revestimento, seque todas as tubulações de vidro no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. </li><li> Moer e partículas de sal peneira (size = 25-32 mm) usado como porogens. </li><li> Montar um tubo de vidro (interior revestido com 1,0% HA solução), mandril (aço inoxidável revestido por tubo de PTFE), calor shrinkable luva (HS), e PTFE anel, conforme descrito anteriormente 8. </li><li> Adicionar partículas de sal do tamanho desejado para o molde de vidro com uma espátula através do funil de borracha de silicone. Toque o molde com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme de partículas de sal. Raspe as partículas excesso de sal na parte superior do molde usando o lado da espátula. </li><li> Ligue a hibridização incubadora por 30 minutos antes de transferir o molde de sal embalado. Desligue a hibridização incubadora e Coloque o sal-embalados molde para a hibridização incubadora para a fusão de sal. </li><li> Remove os moldes da hibridação incubadora e seque-as no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. </li><li> Remove os moldes de sal-embalados do forno a vácuo e deixe esfriar em temperatura ambiente. Remova o mandril de aço inoxidável, empurrando-a para baixo com segurando o anel PTFE. Se o mandril é demasiado apertado para o molde, use o alicate para puxá-lo para fora. Remova o anel de PTFE a partir do fundo do molde. </li><li> Coloque os moldes no forno a 120 ° C por 5 min para termoencolhíveis HS. Verificar se a luva HS é encolhido. Remova a luva HS a partir dos moldes de sal embalado e deixe esfriar em temperatura ambiente. Manter os moldes para o exsicador até que eles são usados. </li><li> Prepare a solução PGS dissolvendo 3 g de PGS em 15 ml de tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar um wt 20 / vol solução%. </li><li> Adicionar a solução PGS para o lúmen de sal-embalados moldes, largando-o usando um spoid na capa hume. Magra o molde de vidro cerca de 45 ° e soltar a solução PGS em lúmen interno com rotação do molde lentamente. Verifique se a solução PGS flui para baixo ao longo da parede do molde. Se lugar seco é observado, adicione mais solução. </li><li> Após a adição da solução PGS, coloque os moldes no bairro hume por pelo menos 30 min para a evaporação THF. </li><li> Coloque os moldes no forno a vácuo para pré-determinado o tempo de cura (ex. 24/36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C para a PGS cura. </li><li> Após a cura, tire os moldes e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Dip cada molde para a água deionizada com posição vertical lentamente. Não mergulhe-os na água rapidamente, porque as bolhas de ar podem causar desgaste ao cadafalso. </li><li> Transferir os moldes para o banho de água com cuidado e coloque-os em um ângulo de 1 h usando tubo de silicone para dissolver HA facilmente. Verifique se HA é dissolvido a partir do molde. Se não HA é liberado a partir do molde, empurre a uma extremidade do andaime lentamente usando a espátula para soltá-la do molde. Repita este passo na outra extremidade do andaime e agitar o molde e para trás lentamente em banho-maria. Verifique se o andaime é movido dentro do molde. </li><li> Transferir o andaime para outro banho-maria com agitador com cuidado. Não pegue o andaime firme, o que pode rachar o cadafalso. Coloque o andaime no banho de água por pelo menos três dias com a mudança de água para lixiviar as partículas de sal. </li><li> Depois de lixiviação de partículas de sal, a transferência de cada cadafalso para o tubo de centrifugação de 15 ml preenchido com a água deionizada e coloque-os na caixa de gelo seco por 1 h para congelar. Colocar tubos de centrífuga para o liofilizador (todos os táxis do tubo devem ser abertas) e lyophilize-los durante 2 dias. </li><li> Coloque todos os andaimes para o dessecador antes até que elas são usadas. </li></ol> 2. Preparação para o cadafalso Seeding celular <ol><li> Retire andaimes do exsicador e cortá-los até 25-30mm de comprimento. </li><li> Prepare duas rolhas de borracha de silicone (diâmetro = 20 mm, espessura da parede = 6,35 mm, diâmetro do furo do meio = 3 mm) e conectar dois tubos de PTFE (diâmetro externo = 3,97 milímetros, diâmetro interno = 2,38 milímetros, espessura da parede = 0,79 mm, comprimento = 60 mm e 40 mm) através dos furos meio de cada rolha. </li><li> Corte um anel como um HS 1.5 mm de comprimento e colocá-lo em cima de uma das extremidades do andaime. Empurrar um tubo de PTFE (ligado rolha de borracha de silicone) em uma extremidade de andaime como parte sobreposição menor possível. </li><li> Coloque o tubo de andaime e PTFE para o forno a 120 ° C por 10 min a encolher anel HS. Verifique se o anel de HS é encolhido e andaimes são conectados a tubagem de PTFE com firmeza. </li><li> Retire o tubo de andaime e PTFE e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Coloque o conjunto tubo de andaime-PTFE para dentro do tubo de policarbonato (diâmetro externo = 15,5 mm, diâmetro interno = 9 mm, comprimento = 50 mm) como uma câmara de biorreator. </li><li> Conectar outro final de tubagem de PTFE para o cadafalso como passos 2.3) e 2.4). </li><li> Ajustar duas rolhas de borracha de silicone para fixar suas superfícies internas de ambas as extremidades do tubo de policarbonato. Prenda as duas superfícies externas de rolhas de borracha de silicone para duas placas de liga de alumínio (superior e inferior; width = 20 mm, comprimento = 70 mm, espessura = 6,35 mm). Coloque duas varas enfiadas no buraco do lado da placa e fixar o tubo de policarbonato (incluído o interior andaime) para placas apertando o parafuso porca polegar no prato. </li><li> Medir o comprimento de cada seedable andaime (comprimento entre dois anéis HS) e calcular a área da superfície interna (π x comprimento x diâmetro interior seedable) de cada andaime para a semeadura de células. </li><li> Enrole uma unidade de câmara de biorreator com papel alumínio e esterilizar em autoclave a 120 ° C por 30 min. Esterilizar cada parte (reservatório de meio, a tubulação da bomba, trocador de gás, manifolds, e válvula de agulha) do biorreator em autoclave a 120 ° C por 30 min e montá-los dentro do capô de cultura de células. </li><li> Pré-tratamento e enxaguar andaimes com uma série de perfusões (70, 50 e 25% de etanol para 1 h, tampão fosfato (PBS; Mediatech, Herndon, VA) por 2 h, e meio de cultura SMC por 24 h, utilizando uma bomba peristáltica em 1,0 ml / min no circuito de fluxo. </li></ol> 3. Seeding celular e Cultura <ol><li> Isolar arterial primária células musculares lisas (PMEs) das artérias carótidas de juvenis de babuínos machos (Papio anubis) e caracterizá-los em duas dimensões da cultura (2D) antes passaging e semeadura, como descrito anteriormente 9. </li><li> Expandir SMCs usando o MCDB 131 médio (Mediatech, Herndon, VA) com 10% de soro fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mcg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e uma solução antibiótica-antimicótica (10.000 UI / ml de penicilina, 10.000 mg / ml, estreptomicina e 25 mg / ml anfotericina B; Mediatech). </li><li> Retire cada câmara biorreator do circuito de fluxo no biorreator. SMCs semente (passagem 4-6) para o cadafalso com uma densidade de 2x10 6 células / cm 2 através da injeção de suspensão com 5 ml no lúmen de andaimes, após cortar os abluminal (entrada) e luminal (saída) os fluxos. </li><li> Coloque todas as câmaras de biorreatores para a hibridização incubadora a 37 ° C e gire-a 2 rpm por 4 h para permitir que as células a se espalhar uniformemente no cadafalso. </li><li> Retire câmaras biorreator da hibridação incubadora anexá-los ao fluxo de circuito do biorreator na capa. Transferência de todo o sistema de cultura de células em biorreatores incubadora. </li><li> Conecte a tubulação da bomba (diâmetro interno = 1,6 mm) para a cartilagem da bomba peristáltica e carregar meio de cultura novo no reservatório. Iniciar a perfusão através de parede (luminal para abluminal) em 1,0 ml / min para 15 min seguido de fluxo luminal só. </li><li> Aumentar a taxa de fluxo e pressão gradualmente a partir de 1,0 ml / min (estresse de cisalhamento luminal: 1.1 dinas / cm 2) e 20 mmHg no dia 1-14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) e 120 mmHg no dia 21, respectivamente. Alterar a tubulação da bomba (diâmetro interno = 3,2 mm) no dia 4 e meio uma vez por semana. </li></ol> 4. A colheita de tecidos e Preparação de Amostras para Análise <ol><li> Após o cultivo de 21 dias, parar a bomba e tubulações braçadeira (entrada e saída) do reservatório de médio porte. Separar a tubulação da bomba a partir da cartilagem da bomba peristáltica e um sistema de biorreator transferência para o capô. </li><li> Braçadeira de entrada e tubulações de saída de cada câmara de reactores biológicos e retirá-la da alça fluxo. Abra o tubo de admissão e preparar um prato de petri-na tubulação de saída para coletar meio de cultura no interior do tubo de policarbonato. Abrir a tubulação de saída de forma lenta e remova a mídia da câmara. </li><li> Separar agulha abluminal e tubos de silicone luminal da câmara e retire placas de alumínio, liberando parafusos. Retire o tubo de policarbonato e retire uma das extremidades do tecido construção da tubulação de PTFE. </li><li> Prepare um prato de petri preenchida com 10 ml de PBS e retire outro lado da construção da tubulação de PTFE. Coloque construir no PBS e lavar três vezes. </li><li> Corte a construir com uma lâmina de barbear como 5 mm de comprimento. Congelar a -80 ° C para o congelador bioquímica ou transferi-lo para 15 tubo de centrifugação ml preenchida com 5 ml de meio fresco para testes mecânicos ou congelar encaixem no composto temperatura Tissue-Tek ideal de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para histologia / immunoflucoloração orescence. </li></ol> 5. Resultados representativos: Os andaimes tubular PGS foram confeccionadas em elastômeros biodegradáveis ​​pelo método de sal de fusão (Fig. 1A). Cada câmara biorreator desde andaimes com os fluxos tanto luminal e abluminal e poderia ser destacado como uma unidade separada de um loop de fluxo principal (Figura 1B). Biorreator sistema foi projetado para cultura quatro andaimes de uma vez por meio do controle e monitoramento de fluxo, bem como a pressão (Fig. 1C e D). Esquemática da cultura biorreator foi mostrado na figura. 2. Após a semeadura SMCs, cada câmara biorreator foi rodado a 37 ° C por 4 h para distribuir uniformemente as células no lúmen do andaime. E, em seguida, o fluxo pulsátil foi aplicado para andaimes até o dia 14 com taxa de fluxo aumentando gradualmente (Fig. 2A) e pressão (Fig. 2B). Após o dia 14, o fluxo ea pressão mantida constante até o final da cultura (dia 21). Morfologia da superfície do andaime PGS foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Microscopia eletrônica de varredura mostrou que andaime tinha parede consistente espessuras (539 ± 18 mm) (Fig. 3A) e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros na superfície luminal (Fig. 3B). Parâmetros morfométricos do andaime foi medido a partir microcomputed tomografia (micro-CT) e análise de imagem. Tamanho dos poros média é de 23,3 ± 3,9 mm e interconectividade dos poros é 99,4 ± 0,62%, o que significa que todos os poros estão totalmente interligados em andaime. Porosidade medidos pelo deslocamento de etanol é de 75,6 ± 2,7%. Morfologia celular da construção PGS foi examinado por MEV (Fig. 4). SMCs multicamadas completamente coberto a superfície luminal e eles foram orientados perpendicularmente ao sentido do fluxo. Estes resultados mostram que o condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil suporta orientação SMC no cadafalso. A presença de matriz extracelular (ECM) e fibras elásticas foram examinadas por H &amp; E e coloração autofluorescência elastina (Fig. 5). Coloração H &amp; E demonstraram que as células e proteínas ECM completamente coberto do lúmen do PGS construir. Elastina autofluorescência também mostrou organizadas circunferencialmente fibras elásticas na superfície luminal do construto. Produção de proteínas ECM em construções PGS foram medidos a partir ensaios bioquímicos. A elastina e conteúdo de colágeno insolúvel foram 20,2 ± 9,1 mg / mg de tecido e de 6,3 ± 1,9 mg / mg de tecido, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Scaffold fabricação e sistema de biorreatores. (A) Esquema de andaime tubular de fabricação. (B) da câmara biorreator. Andaimes foram conectados a tubagem de PTFE, colocadas dentro do tubo de policarbonato, e fixado por rolhas de borracha de silicone e placas de liga de alumínio. Cada câmara tem dois caminhos de fluxo: fluxo luminal (por tubo de silicone) e abluminal (por agulha). (C) sistema de biorreator colocado dentro da incubadora. Inclui reservatório de meio, módulo de bomba peristáltica, trocador de gás, transdutores de pressão, dois manifolds (superior e inferior), e válvula de agulha. (D) sistema de biorreator colocado fora da incubadora. Ele inclui monitor de pressão, unidade de controle de fluxo, dados do sistema, aquisição e computador. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquemática da cultura biorreator. (A) protocolo de Cultura. (B) Aplicada perfis de pressão em cada ponto do tempo (dia 1, 4, 7 e 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Morfologia da superfície do andaime PGS. (A) Corte transversal. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Morfologia celular da PGS construir. (A) Lumen. (B) Seção transversal de corte 45 °. Setas em ambos os números representam a direção do fluxo. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Histologia e elastina autofluorescência do PGS construir. (A) coloração H &amp; E. (B) autofluorescência elastina correspondentes. L: lúmen. Ampliação: 40X. Barra de escala: 50 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica de fabricação utilizando um elastômero biodegradável descrito aqui tem várias características. (1) Foi utilizado ácido hialurônico (HA) como uma desmoldagem. Desde HA é solúvel em água, andaime foi facilmente liberado do molde de vidro após imersão em água. Neste relatório, foram utilizados 1,0% wt / vol de solução de HA, porque baixa concentração (&lt;0,5% wt / vol) de solução não é viscoso e flui tão rápido quando coloca-lo em cima do tubo de vidro. Para solução de HA revestimento uniforme, que virou o tubo de vidro quando a solução voou baixo na parte inferior do tubo e repetiu esta etapa. Este revestimento HA é uma crítica ao nosso procedimento de fabricação para liberar andaimes final. (2) Usamos calor shrinkable luva (HS) para a retenção de sais no tubo de vidro. Desde sais foram densamente no espaço entre a parede interna do tubo de vidro ea luva HS, manga HS sais retidos após a remoção do mandril eo anel de PTFE no fundo da tubulação. Poderíamos remover manga HS facilmente colocando o molde em um forno a 120 ° C por 5 min, e então obter modelos sal tubular. (3) Foi utilizado o método de fusão de sal. É sabido que o método de fusão de sal pode aumentar a interconectividade dos poros e propriedades mecânicas, variando o tempo de fusão 10. Além disso, como usamos PGS, macro-poros foram produzidas pelas partículas de sal durante o processo de lixiviação, enquanto a micro-poros foram provavelmente gerado por vapor glicerol formado durante PGS cura como descrito anteriormente 11. Assim, este método tem um potencial para fabricar andaimes tubular poroso com macro e micro-estruturas diferentes, variando partículas de sal, bem como PGS cura condição. O condicionamento mecânico do biorreator forneceu fluxo de perfusão pulsátil (média máxima de fluxo = 14 ml / min, tensão de cisalhamento máxima = 15,3 dina / cm 2, freqüência = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressão relevante com o andaime PGS, o que levou a SMC crescimento e orientação (Fig. 4). Estes resultados são consistentes com estudos anteriores relatórios que se estendem cíclico nessa freqüência e tensão de cisalhamento aumenta a proliferação SMC 12, e ECM produção de proteína 13,14. Além de SMC crescimento e orientação, PGS construir apoiado ECM produção de proteína, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de 3 semanas de cultura no biorreator. Alguns estudos usando um andaime elastomérica como uma construção de pequeno diâmetro arterial têm demonstrado resistência mecânica e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas 15, SMC e integração rápida em andaimes compatível usando giratório frasco 16,17, enquanto as fibras elásticas não foram encontrados nessas construções. Nossos resultados sugerem que a distensão cíclica radial do biorreator melhorou a transdução do sinal mecânico mais eficaz para PMEs no PGS andaime, o que provavelmente contribuiu para a síntese de elastina e organização. Desde SMCs vasculares foram as únicas células que produzem proteínas ECM na nossa abordagem endotélio, repouso e melhorar a resistência mecânica são necessários para desenvolver uma clínica de sucesso pequeno diâmetro constrói arterial. Temos relatado que as células endoteliais co-cultivados com SMCs gerado uma monocamada confluente e expressão da proteína apoiado fenótipo em condições de nossa cultura e condicionamento mecânica 9. Portanto, com base em nossa abordagem descrita aqui, modificação das condições de co-cultura experimento seria um próximo passo para melhorar as funções de construções resultantes e gerar não-trombogênica, robusto e compatível arterial construção semelhante às artérias nativas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Sal sódico do ácido hialurônico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CV </td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico antimicótico solução </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Tissue Tek compostos temperatura ideal de corte, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomeric pgs scaffolds in arterial tissue engineering

Doença cardiovascular é uma das principais causas de mortalidade em os EUA e, especialmente, a doença arterial coronariana aumenta com o envelhecimento da população e aumento da obesidade 1. Atualmente, a cirurgia de bypass utilizando navios autólogos, enxertos e enxertos sintéticos são conhecidos como comumente usado para substitutos arterial 2. No entanto, esses enxertos tem aplicações limitadas quando um diâmetro interno das artérias é menos de 6 mm, devido à baixa disponibilidade, complicações trombóticas, incompatibilidade de conformidade, e hiperplasia intimal final 3,4. Para superar essas limitações, a engenharia de tecidos tem sido aplicado com sucesso como uma alternativa promissora para desenvolver construções de pequeno diâmetro arterial, que são não-trombogênica, robusto, e compatível. Vários estudos anteriores desenvolveram construções de pequeno diâmetro arterial com tri-estrutura lamelar, excelentes propriedades mecânicas e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas 5,6. Enquanto elevada resistência à tração e pressão de ruptura de colágeno, aumentando a produção de um material rígido ou camada de células andaime, essas construções ainda tinham a produção de elastina baixa e de conformidade, que é um problema grave para causar a falência do enxerto após o implante. Considerando essas questões, a hipótese de que um biomaterial elastometric combinado com o condicionamento mecânico daria elasticidade e conduzir sinais mecânicos de forma mais eficiente de células vasculares, que aumentam a produção de matriz extracelular e apoio de orientação celular. O objetivo deste relatório é apresentar uma técnica de fabricação de materiais porosos andaimes tubulares e um condicionamento dinâmico mecânica de aplicação para a engenharia de tecidos arterial. Usamos um elastômero biodegradável, poli (sebacato glicerol) (PGS) 7 para a fabricação de andaimes tubular poroso a partir do método de fusão de sal. Adulto primário babuíno células musculares lisas (PMEs) foram semeadas na luz de andaimes, que cultivadas em nosso biorreator de fluxo pulsátil projetado para 3 semanas. PGS andaimes tinham uma espessura consistente e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros. Condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil apoiado SMC orientação e maior produção de ECM em andaimes. Estes resultados sugerem que andaimes elastomérico e condicionamento mecânica da cultura biorreator pode ser um método promissor para a engenharia de tecidos arterial.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Andaimes elastomérico PGS com células musculares lisas vasculares cultivadas em biorreator fluxo pulsátil pode levar a promissora construções de pequeno diâmetro arterial com a produção de ECM nativas em um período relativamente curto cultura.

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

elastomeric-pgs-scaffolds-in-arterial-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K visualizações.  University of Pittsburgh. Andaimes elastomérico PGS com células musculares lisas vasculares cultivadas em biorreator fluxo pulsátil pode levar a promissora construções de pequeno diâmetro arterial com a produção de ECM nativas em um período relativamente curto cultura.

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Bioengenharia

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...