O financiamento do BBSRC é gentilmente reconhecida (número de concessão BB H011293 / 1).

Visão global Secção 1 descreve a preparação de pH nanosensors reactivos e caracterização da resposta nanosensor para pH usando espectrometria de fluorescência e o seu tamanho usando SEM. Seção 2 descreve a preparação de suportes poliméricos electrospun e caracterização da sua morfologia e tamanho utilizando SEM. Seção 2 também descreve a preparação de andaimes de auto-relato que são andaimes electrospun com a inclusão dos pH nanosensors responsivos. Os andaimes resultantes de auto-relato são caracterizados por MEV para avaliar se as alterações morfológicas nas fibras electrospun ocorreu. A fluorescência a partir dos suportes de auto-relato resultantes das nanosensors incorporadas é avaliada por microscopia confocal. A seção 3 descreve a cultura de células em cima do andaime eo andaime electrospun auto-relato. Os andaimes são esterilizados em primeiro preparatíon para cultura celular após o que os andaimes são avaliados para determinar se a esterilização ea cultura de células afetam a capacidade de fluorescência dos andaimes de auto-relato. O protocolo também descreve a entrega de nanosensors de células que são cultivadas sobre andaimes electrospun. Corante Lysotracker é usado para garantir que nanosensors não foram tidas em compartimentos celulares ácidas. 1. Elaboração e análise de pH Responsive Nanosensors sol-gel 1.1 Preparação de pH Responsive Nanosensors sol-gel Nota: A preparação deve ser realizada numa hote. <ol><li> Preparar os fluoróforos para utilização nas nanosensors pH por dissolução de 5 - (e-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE) (1.5 mg) em dimetilformamida (DMF) (1 ml) em um balão de fundo redondo e 6-carboxitetrametilrodamina fundo , éster de succinimidilo (TAMRA-SE) (1,5 mg) em DMF (1 ml) num outro balão de fundo redondo.Adicionar 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (1,5 ml) a cada balão e agita-se sob uma atmosfera de azoto seco (21 ° C) durante 24 horas no escuro, ou seja, moldar as amostras em alumínio. </li><li> Adicionar tanto dos corantes acima (250 uL) a uma mistura de etanol (6 ml) e hidróxido de amónio (30% em peso, 4 ml), contida num balão de fundo redondo e agitou-se durante 1 hora (21 ° C). </li><li> Lentamente, adicionar tetraetilortossilicato (TEOS) (0,5 ml) à mistura, a continuar com agitação durante mais 2 horas. A mistura vai ficar turva. Os nano-sensores podem ser recolhidos por evaporação rotativa. Nano pode ser armazenado num frasco de vidro a 4 ° C para uso futuro. CUIDADO: subsequente manuseamento da nanosensors na sua forma seca, devem ser realizados em um exaustor ou no caso de pesagem lhes o equilíbrio deve ser colocado, por exemplo, em um Weighsafe. </li></ol> 1.2 nanosensor Resposta ao pH <ol><li> Preparar soluções de tampão fosfato de Sorensen que variam de 5,5-8,0 pH por mixing proporções específicas de fosfato monobásico de sódio (0,2 M) e fosfato de sódio dibásico soluções stock (0,2 M). Verifique o pH final usando um medidor de pH. Faça os ajustes menores ao pH utilizando hidróxido de sódio (NaOH) (4 M) ou ácido clorídrico (HCl) (2 M). </li><li> Suspender as nanosensors pH nas soluções tampão de pH (5 mg / ml), em primeiro lugar, segurando o recipiente contendo a solução nanosensor num vortex durante 3 minutos e depois da submersão do recipiente num ultrasonicator até a solução se tornar turva (aproximadamente 5 min). Repita essas etapas para suspender totalmente as nanosensors em solução. </li><li> Colocar a primeira solução a uma cuvete óptico e utilizar comprimentos de onda de excitação de 488 nm para a 5 - (e-6)-carboxifluoresceína (FAM) e 568 nm para a 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA). Recolha os comprimentos de onda de emissão de 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA usando um espectrômetro de fluorescência. </li><li> Mudar as soluções na cuvete óptico de modo a que o pH pode ser observada em diferentes pH e continuar collecting os espectros de emissão. </li><li> Calcula-se a relação entre o máximo de emissão produzido em cada valor de pH para produzir uma curva de calibração. </li></ol> 1.3 SEM de Nanosensors <ol><li> Coloque uma amostra dos nano-sensores em um revestimento de carbono microscópio eletrônico de stub e arranhar o revestimento com ouro por 5 min em atmosfera de árgon. </li><li> Observar por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Durante o exame ajustar a distância de trabalho, tensão e ampliação para minimizar o carregamento de elétrons (Figura 1). </li></ol> 2. Elaboração e Análise de PLGA Andaimes 2.1 Electrospinning PLGA Andaimes <ol><li> Numa hotte dissolver o poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), em diclorometano (DCM) (20% (w / w)) com formato de piridínio (PF) (1% (w / w)). Coloque a solução numa seringa de 10 ml com uma agulha 18 G romba de enchimento e de forma segura para o ajuste de uma bomba de seringa. </li><li> Distância da ponta da agulha 20 centímetros de distância de uma 20cm x 15 cm de alumínio placa de coleta. </li><li> Conecte o eletrodo de uma fonte de alimentação de alta tensão para a ponta da seringa e da terra para a placa de coleta de alumínio. CUIDADO: Cuidados devem ser tomados como de alta tensão é usado ou seja sempre recorrer a alimentação elétrica antes de manusear qualquer equipamento electrospinning. </li><li> Entregar a solução com um caudal constante de 3,5 m / h a 12 kV durante 2 horas. Electrospinning usando estas condições darão uma profundidade de andaime de cerca de 60 um. </li><li> Deixar o andaime numa hote durante 24 horas para permitir resíduo solvente a evaporar. </li></ol> 2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Andaimes <ol><li> Prepare andaimes incorporando pH nanosensors sensíveis como descrito na seção 2.1, mas com a modificação de adicionar nanosensors para a solução de polímero (5 mg / ml). Suspender as nanosensors na solução de PLGA com o auxílio de ultra-sons (cerca de 5 min) antes<html> para colocação numa seringa de 10 mL. </li></ol> 2.3 SEM de PLGA Andaime e pH Scaffold Responsive <ol><li> Coloque uma amostra do andaime PLGA ou pH andaime responsivo em um elétron revestido microscópio esboço de carbono e proceder conforme descrito para MEV de nano-sensores (Figura 1). </li></ol> 2.4 Calibração de pH Scaffold Responsive <ol><li> Coloque uma amostra de pH andaime sensível em uma placa de cultura de 35 mm, e mergulhar em soluções tampão adequadas. </li><li> Em um microscópio confocal de utilizar um laser de árgon de 488 nm para excitar o FAM e um laser de crípton 568 nm para excitar o TAMRA dentro dos nano-sensores. Observe a emissão de fluorescência para pH andaimes responsivos a 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA. (Figura 2). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação. </li></ol> 3. Cultura celular em cima de PLGA Andaimes e pH Responsive PLGA Andaimes ntent &quot;&gt; Nota: O seguinte deve ser realizada em um gabinete de cultura de células. 3.1 Preparação de PLGA Andaimes para Cultura de Células <ol><li> Corte as PLGA ou pH sensíveis andaimes PLGA em dois centímetros 2 peças. </li><li> Esterilizar andaimes por irradiação com luz ultravioleta (UV), a uma distância de 8 cm durante 15 minutos de cada lado. </li><li> Transferir os andaimes para uma placa de cultura de 12 poços e colocar um anel de aço na parte superior. Adicionar uma solução de penicilina / estreptomicina (5% v / v) em tampão fosfato salino (PBS) para o interior e exterior do anel de aço, incubar durante a noite (37 ° C, 5% CO 2). Observe o anel de aço foi fabricado na Universidade de Nottingham e tem as seguintes dimensões: diâmetro externo 2 cm, diâmetro interno 1 centímetro, 1 cm de profundidade. </li><li> Remover a solução de esterilização e lavou-se com PBS. </li><li> Adicionar meio de cultura de células para o interior (500 ul) e exterior (500 ul) do anel de aço, em lugar de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt;), enquanto que a preparação de uma suspensão de células. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células e efectuar uma contagem de células utilizando um ensaio de exclusão com Trypan Blue. </li><li> Criar uma suspensão de células para obter um número de células de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Remova a mídia de dentro e de fora do anel de aço. </li><li> Substituir com meio de cultura de células pré-aquecido na parte externa do anel de aço (1 m). </li><li> Adicionar 300 ul da suspensão de células para o interior do anel de aço - placa de rocha para trás e para a frente suavemente para distribuir células. </li><li> Coloque a placa de cultura de células em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) - a fixação das células deveria ter ocorrido no prazo de 24 horas, no entanto continuar a cultura durante o tempo que o experimento exige - refrescante a mídia a cada 2-3 dias. </li></ol> 3.2 nanosensor entrega para as células cultivadas sobre PLGA Scaffold <ol><li> Células semente em PLGA andaime, conforme descrito na seção 3.1. Para este estudo um PLGA andaime em branco (não containanosensors ning) foi usado devido à sobreposição de emissão de fluorescência quando Imaging. </li><li> Colocar o andaime semeado célula em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 72 horas para permitir que as células crescem e migram ao longo do andaime antes nanosensor entrega. </li><li> Antes nanosensor entrega (37 ° C, 5% CO 2) lavar as células com PBS e alterar o suporte a partir de meios de cultura padrão para meios livres de soro e antibióticos, incubar durante 1 hora. Nota: os meios de cultura padrão para células 3T3 compreende de meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal de vitelo, a solução de ((v / v) a 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1% (v / v)) . </li><li> Durante o período de incubação de preparar o complexo de lipossoma-nanosensor por sonicação breve nanosensors (5 mg) com Optimem (50 uL) para criar a solução A. </li><li> Criar solução B por adição de Lipofectamine 2000 (5 ul) para Optimem (45 ul), incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar soluçãoA à solução B, incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para formar a solução C, que é o complexo nanosensor-lipossoma. </li><li> Adicionar a solução C (100 ul) a células e incuba-se (37 ° C, 5% CO 2) durante 3 horas. </li><li> Remover os andaimes semeados células da incubadora, os meios aspirados e lavar duas vezes com PBS antes da adição de PBS (1 ml) para permitir a visualização de células vivas por microscopia confocal. Nota: O PBS foi utilizado neste protocolo de modo a que o indicador de vermelho de fenol presente em meios de cultura de células não causar autofluorescência e também porque a calibração em diferentes pH estava a ser executada. No entanto meio isento de vermelho de fenol pode ser utilizado para a análise de mais longo prazo de culturas de células. </li><li> Mergulha-se o andaime semeado célula em tampões de pH diferente e monitorizar a resposta das nanosensors associados com as células. </li><li> Monitorizar o pHi por determinação da relação entre as intensidades de fluorescência de FAM e TAMRA pela observação de fluorescência usando microscopia confocal (Figure 3). </li></ol> 3.3 nanosensor Localização dentro de células de mamíferos <ol><li> Incubar as células com nanosensors contendo apenas o corante FAM como descrito na secção 3.2 (isto é, porque a emissão de fluorescência de TAMRA é na mesma região espectral como a Lyso Tracker vermelho). Preparar estas nanosensors como descrito na seção 1.1, mas com a omissão de preparar e adicionando TAMRA. </li><li> Após o período de entrega nanosensor diluir solução estoque Lyso Tracker Vermelho para 50 nm. </li><li> Adicionar uma parte alíquota da solução diluída (2 mL) para células cultivadas sobre suportes de PLGA. </li><li> Incubar as células com Lyso Tracker vermelha durante 1 hora (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Após o período de incubação de remoção dos suportes e lavar as células duas vezes com PBS (pH 7,4) antes de mudar os meios de PBS (pH 7,4) (2 ml), em preparação para a visualização por microscopia confocal. Nota: Fenol meio isento de vermelho pode ser usado em vez de PBS. </li><li> Adicione o corante nuclear DraQ5 para o PBS até a concentração final ser 5 mM e incuba-se com as células durante 3 minutos (37 ° C, 5% CO 2). Não é necessário mudar os meios de comunicação a seguir ao período de incubação com DRAQ5. </li><li> Use um laser de 488 nm argônio para excitar o FAM só nanosensors, um laser de criptônio 568 nm para excitar o Lyso Tracker Red e 633 nm do laser de hélio / néon para excitar o cromóforo DRAQ5 e observar fluorescência em 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivamente (Figura 3). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação. </li></ol>

<ol>
	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity,+enhanced+extracellular+matrix+protein+production,+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells.">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li><li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers:+Reinventing+the+wheel?.">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?.</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro+spinning:+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications:+A+review.">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li><li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system.">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li><li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow:+A+State-of-the-Art+Review.">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li><li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+tools+for+tissue+engineering.">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li><li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)/poly(L-lactic+acid)+fibres+and+porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)+fibres.">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li><li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA,+PLGA+and+P(LLA-CL)+nanofibers+cultured+with/without+cell+culture.">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li><li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor.">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li><li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors:+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering.">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li><li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors.">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li><li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering.">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li><li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li><li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly(D,L-lactic-co-glycolic+acid)+meshes.">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li><li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+structure:+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering.">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li><li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis.">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A engenharia de tecidos aspira para criar substitutos biológicos que podem ser utilizados tanto in vivo como in vitro como em modelos de tecido e em terapia de substituição de tecido para substituição, reparação, manter ou melhorar a função de um tecido ou órgão específico. Substitutos sintéticos têm sido usados ​​por muitos anos para substituir ou reparar ajuda de tecidos, mas estes muitas vezes não conseguem devido à falta de integração com o tecido e / ou infecção do...

Uma estratégia chave na engenharia de tecidos é o uso de materiais biocompatíveis para o fabrico de andaimes, cuja morfologia se assemelha ao tecido que vai substituir e também é capaz de suportar o crescimento e função das células de 1,2. O andaime proporciona suporte mecânico permitindo adesão e proliferação de células ainda permite a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D. O andaime também deve permitir o transporte de massa de nutrientes celulares e não inibir a remoção de resíduos metabólicos 3. Eletrofiação emergiu como um método promissor para a fabricação de suportes poliméricos capazes de suportar o crescimento celular 4-6. As fibras não tecidas electrospun produzidos são adequados para o crescimento celular, como eles são muitas vezes poroso e permitir a interacção célula-célula, assim como a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D 7. É importante monitorar a viabilidade celular durante tele período de cultura e para assegurar que a viabilidade celular é mantido ao longo de todo o construto 3D. Por exemplo, as condições de cultura, tais como o oxigénio e requerem um controlo cuidadoso do pH, como os gradientes de concentração do analito pode existir dentro da construção 3D. Ou sistemas de biorreactores de perfusão podem ser empregues para mimetizar as condições in vivo de fluxo intersticial e, como um resultado de transferência de aumento de nutrientes e remoção de resíduos metabólicos 8. A questão de saber se tais sistemas estão garantindo condições do microambiente constantes podem ser abordadas por meio da avaliação do microambiente celular em tempo real. Microambiente métricas-chave que poderiam ser monitorados em tempo real incluem: temperatura, composição química dos meios de comunicação de células, a concentração de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, pH e umidade. Dessas métricas, a temperatura pode ser mais facilmente controlada por meio de sondas in situ. Os métodos para monitorar os restantes métricas listadas comumente emvolve a remoção de uma aliquota para a amostragem e, por conseguinte, perturbar a cultura de células e aumentam o risco de contaminação. , Métodos contínua em tempo real estão sendo procurados. Métodos de monitoramento atuais geralmente dependem de instrumentos que verificam fisicamente a construção celular, como um monitor ou sonda pH oxigênio. No entanto, estes métodos invasivos podem danificar a construção celular e perturbar a experiência em curso. Monitoramento não invasivo de concentrações de analito dentro da construção 3D poderia permitir o monitoramento em tempo real de vários aspectos ambientais, tais como esgotamento de nutrientes 9. Isso permitiria que a avaliação de fornecimento de nutrientes para as regiões mais profundas na estrutura e determinar se os resíduos metabólicos estava sendo removido de forma eficaz 10,11. Os sistemas que tentam resolver o problema da capacidade de invasão envolvem geralmente a utilização de uma câmara de perfusão que passa através do meio de cultura, tanto o vaso de cultura e para sensores externos, para monitorar o pH, o oxigénio e glicose, 12. ORe é um interesse crescente no desenvolvimento de sensores que podem ser directamente integrados no vaso de cultura, que não exigem a remoção de uma aliquota para a amostragem e, como tal, poderia prever na monitorização in situ. Para lidar com essas deficiências para in situ e monitoramento não invasivo das condições do microambiente que incorporaram analitos nanosensors responsivos em andaimes electrospun para produzir auto-relato andaimes 13. Os andaimes que actuam como dispositivos de detecção por monitorização da actividade de fluorescência foram preparados anteriormente, em que o dispositivo de detecção era ou o andaime polimérico real criado por electrospinning, ou através do uso de um corante sensível analito que é incorporada no polímero antes da formação do andaime 14,15 . No entanto, estes dispositivos sensores têm o potencial para se obter saídas ópticas erróneos causados ​​pela possível interferência de outros analitos. O uso de um dispositivo de detecção de medida proporcional such como os que são preparados no protocolo descrito tem o potencial de eliminar estes efeitos adversos possíveis e fornecer uma resposta específica para o analito em questão. Os andaimes electrospun aqui apresentados foram preparados a partir da poli-co-polímero sintético (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), escolhido devido a ter a Food and Drug Administration aprovação (FDA), devido às suas propriedades biodegradáveis ​​e biocompatíveis e uma faixa ficha de suporte do crescimento e função de vários tipos de células 16-18. Os analitos raciométrica nanosensors responsivos preparados são sensíveis ao pH. Os nanosensors incorporar dois corantes fluorescentes numa matriz de sol-gel biocompatível, onde um corante, FAM é sensível ao pH e o outro, TAMRA actua como um padrão interno, uma vez que não é sensível ao pH. Além disso, a fluorescência de ambos FAM e TAMRA podem ser analisados ​​separadamente uma vez que não se sobrepõem. A determinação da relação da emi fluorescênciassion de ambos os corantes em comprimentos de onda específicos dá uma resposta independente do pH de outras condições ambientais. Os andaimes de auto-relato pode permitir a avaliação da repetição do pH in situ e em tempo real, sem perturbar o modelo 3D desenvolvido. Demonstrou-se que estes suportes são capazes de suportar fixação e proliferação celular e permanecer sensível ao analito em questão. A cinética de ácido subprodutos em construções projetadas permanece pouco estudado e, como tal, utilizando o pH andaimes responsivos poderia facilitar muito os estudos 19. Além disso, o uso dos andaimes de auto-relato para aplicações em engenharia de tecidos apresenta a oportunidade de compreender, monitorar e otimizar o crescimento do modelo 3D construções de tecidos in vitro, de forma não invasiva e em tempo real. Os pH nanosensors responsivos também foram entregues para o meio intracelular de fibroblastos cultivados sobre electrospun scaffol PLGAds. A proporção da emissão de fluorescência a partir dos corantes foram utilizados para monitorizar o pHi e comparado com um auto-relato de andaime integrem nanosensors pH. A entrega de nanosensores para as células cultivadas em um ambiente 3D poderia permitir o monitoramento da concentração de analito de profundidade dentro da construção de uma forma não destrutiva. Portanto nanosensors pode ser uma ferramenta de imagem viável para avaliar o comportamento das células de modo não destrutivo ao longo 3D constrói permitindo a análise de longo prazo. Rastreio a concentração do analito de células individuais dentro de uma construção em 3D poderia garantir que eles estão recebendo as concentrações de nutrientes e oxigênio suficientes. Parâmetros do processo de acompanhamento pode ajudar no desenvolvimento de técnicas padronizadas para o transporte de massa eficiente de oxigênio e nutrientes. A entrega de nanosensores para o meio intracelular e incorporação de nano-sensores em scaffolds poliméricos podem ser combinadas para permitir a avaliação da viabilidade das células, bem como o desempenho de andaime dentro de const 3Dructs durante o processo de crescimento do tecido. Isso pode levar a um maior conhecimento dessas construções e progredir a fabricação de substitutos de tecido biologicamente relevantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Células de cultivo em 3D no andaimes apropriados é pensado para melhor imitar o vivo microambiente e aumentar as interações célula-célula. A construção celular 3D, resultando muitas vezes pode ser mais relevante para estudar os eventos moleculares e interações célula-célula que experimentos semelhantes estudados em 2D. Para criar culturas 3D eficazes com alta viabilidade celular ao longo do andaime as condições de cultura, tais como o oxigénio e necessidade de pH deve ser cuidadosamente controlada de gradientes de concentração do analito pode existir em todo o construto 3D. Descrevemos aqui os métodos de preparação de pH responsivos nanosensors sol-gel biocompatíveis e a sua incorporação em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun juntamente com a sua preparação posterior para a cultura de células de mamíferos. Os andaimes de pH reagir podem ser utilizados como ferramentas para determinar microambiental pH dentro de uma construção celular 3D. Além disso, detalhamos a entrega de pH nanose responsivonsors para o ambiente intracelular de células de mamíferos, cujo crescimento foi suportado por suportes de PLGA electrospun. A localização citoplasmática do pH nanosensors responsivo pode ser utilizado para monitorar o pH intracelular (pHi) durante a experimentação contínua.

A distribuição do tamanho das pH nanosensors responsivos preparadas foi caracterizado utilizando SEM, onde a população de nanosensors fotografados foram medidos e verificou-se ter dimensões nanométricas na gama de 240-470 nm (Figura 1A). A realização de um diâmetro estreito e razoavelmente pequeno é consistente com o uso do método de Stöber para preparar nanopartículas. Verificou-se que utilizando um ambiente de pH básico durante a síntese de nanopartículas ou seja nanopartícul...

Watch this Scientific Journal Video about Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture at JoVE.com

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K visualizações.  University of Nottingham.  Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento. 

Vídeo: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Bioengenharia

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...