Agradecemos ao Instituto Wistar Biotério, Facilidade Microscopia Facility Histotechnology e centro de abastecimento Research. Este estudo foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health CA 076674, CA 098101, 025874 e CA CA 10815.

1. A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: <ol><li> Preparação da camada acelular: Misturar os reagentes a seguir em um tubo de 50 mL no gelo: 0,59 mL EMEM 10X, 50 ul 200mM L-glutamina, 0,6 mL FBS, 120 mL de bicarbonato de sódio 7,5% e 4,6 mL de colágeno bovino I. Adicione 1 mL de a mistura em cada inserção de bandejas de cultura de tecidos. Incubar por 30 min à temperatura ambiente e permitir que o gel solidificar. Cor da mistura deve ser de amarelo-palha para rosa. </li><li> Trypsinize fibroblastos humanos a partir de frascos de cultura com 0,25% de tripsina / EDTA, adicione DMEM contendo 10% FBS para neutralizar. Coletar células por centrifugação e 0,45 ressuspender x 10 6 células em 1,5 mL DMEM com 10% de FBS. De células-tronco por via cutânea, recolher 6.600 esferas dérmica (quando as células-tronco dérmica crescer em meio de células-tronco, eles formam esferas de forma semelhante ao neurospheres) tocando frasco para separar as esferas, a centrifugação. </li><li> Preparação da camada celular: Misture o seguinte em um tubo de 50 mL no gelo: 1,65 mL EMEM 10X, 150 mL 200 mM L-glutamina, 1,85 mL FBS, 350 mL de bicarbonato de sódio 7,5%, 14 mL de colágeno I bovino e 1,5 mL de suspensão fibroblastos a partir do passo 2 (em alternativa, usar combinação de 0,45 x 10 6 fibroblastos dérmicos e 6600 esferas em 1,5 mL de pele médio I para reconstruir células-tronco dérmica reconstrói), misture bem. Adicionar 3 mL da mistura a cada inserção camada revestido acelular. Incubar por 45 min a 37 ° C em um 5% CO 2 de cultura de tecidos incubadora. Cor da mistura deve ser de palha amarelo para rosa. Depois que o gel solidifica, adicione DMEM contendo 10% FBS (2 dentro mL e 10 mL fora de inserir em cada poço da pele reconstruir bandejas). Incubar durante 4 dias e certifique-se que os contratos de gel. </li><li> Aspirar médio de ambos dentro e fora de cada inserção. Adicionar lavar médio (HBSS com 1% dialisadas FBS) 2 mL para o interior e 10 mL para o exterior de inserção, a fim de lavar soro regular. Incubar por 1 hora a 37 ° C. </li><li> Preparação da pele reconstruir médio: <ol><li> Para células-tronco dos melanócitos normais e dérmica reconstrói: Para fazer meio básico (500 mL), misturar os reagentes a seguir: 490 mL meio isento de soro de queratinócitos, 1,8 mL extrato de hipófise de bovinos, 10 mL de soro fetal bovino dialisado, 500 mL de 10 mg / mL SCF, 562,5 mL de 4 mcg / mL bFGF e 500 mL de 264 mcg / mL ET-3. Médio I: Adicione 10 mL EGF de 100 mcg / ml a 100 ml de meio básico. Médio II: Adicione 2 mL EGF para 100 ml de meio básico. Médio III: Adicionar 720 mL CaCl 2 de 1 M a 300 mL de médio básica. </li><li> Para a pele melanoma reconstruir: Para fazer Médio I (100ml), misture os seguintes reagentes: 72,5 mL de DMEM, 24 mL de F12 (HAM); 2 mL L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 200 ITES mL de 500X, 200 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 mL de adenina de 90 mM, 200 mL de progesterona de 2 nM, 240 mL CaCl 2 de 1 M, 200 Triiodotironina mL de 10 nM e 100 ul de soro bovino chelexed recém-nascido (dissolver 3 g de Chelex 100 em 100 mL de soro, mexa 1,5 horas a 4 ° C, filtro de esterilizar). Para fazer Médio II (100ml), misture os seguintes reagentes: 72,5 mL de DMEM, 24 mL de F12 (HAM); 2 mL L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 200 ITES mL de 500X, 200 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 mL de adenina de 90 mM, 200 mL de progesterona de 2 nM, 240 mL de CaCl2 1 M, 200 Triiodotironina mL de 10 nM e 100 mL de soro bezerro recém-nascido. Para fazer Médio III (300ml), misture os seguintes reagentes: 142,5 mL de DMEM, 142,5 mL de F12 (HAM é), 6 mL de L-glutamina de 200 mm, 600 hidrocortisona mL de 269 g / mL, 600 ITES mL de 500X , 600 mL O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 mL de adenina de 90 mM, 600 mL de progesterona de 2 nM, 720 mL CaCl 2 de 1 M, 600 Triiodotironina mL de 10 nM e 6 mL de soro bezerro recém-nascido. </li></ol></li><li> Trypsinize queratinócitos humanos a partir de frascos de cultura com 0,05% de tripsina / EDTA, neutralize com tripsina de soja inibidor de tripsina (250 mg / L em 1x tampão fosfato salina), spin down, ressuspender um pellet de células de 4,17 x10 6 células / mL na pele reconstruir médio I. </li><li> Trypsinize melanócitos humanos ou células de melanoma a partir de frascos de cultura com 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar tripsina de soja com inibidor de tripsina de feijão, spin down, ressuspender um pellet de células de 0,83 x10 6 células / mL na pele reconstruir I. médio </li><li> Retirar a roupa meio de ambos dentro e fora de cada inserção. </li><li> Adicionar pele reconstruir médio I (1,5 mL para o interior e 10 mL para o exterior de cada inserção). </li><li> Tomar 600 mL suspensão celular de queratinócitos e 600 mL suspensão celular dos melanócitos ou células de melanoma, misture bem. Dispense 200 mL queda suspensão mista de células por cair para o interior de cada inserção. Para reconstruir células-tronco por via cutânea, use 100 ml de suspensão de queratinócitos só. Incubar por 2 dias a 37 ° C. </li><li> Pele Aspirar reconstruir médio Ide ambos o interior ea parte externa de cada inserção. Adicionar pele reconstruir médio II (2 mL para o interior e 10 mL para o exterior). Incubar por mais 2 dias a 37 ° C. </li><li> Pele Aspirar reconstruir II médio do interior eo exterior de cada inserção, adicionar 7,5 mL de pele reconstruir III médio e apenas a parte externa. A partir deste ponto, a superfície do reconstrói começa a ser exposta ao ar. III mudança médio em dias alternados até o dia 18. </li><li> Pele colheita reconstruir no dia 18: <ol><li> Aspirar a mídia do interior eo exterior de inserções. </li><li> Remover inserções a partir da bandeja com uma pinça. </li><li> Cortar a reconstruir (incluindo o filtro de policarbonato), traçando um círculo perto da borda com uma lâmina de bisturi. </li><li> Corte a reconstruir e o filtro ao meio sobre uma superfície dura. </li></ol></li><li> Para seções de parafina: coloque metade da reconstrução de uma cassete histologia entre 2 preto papéis TBS biópsia e mergulhe a fita toda em formalina 10% por mais de 4 horas. Em seguida, coloque a fita em etanol 70% e armazená-lo a 4 ° C até que esteja pronto para processar a reconstruir para inclusão em parafina. </li><li> Para seções congeladas: <ol><li> Coloque a outra metade de reconstruir em sacarose 50% a 4 ° C por 1-2 horas, em seguida, altere a sacarose para 2M e armazená-lo a 4 ° C por mais de 1-2 horas. </li><li> Dispense ótima media temperatura de corte de congelamento (OCT) em um molde de base descartáveis ​​para que ele preenche cerca de 50% do barco. Evitar bolhas no outubro </li><li> Agarre a borda da reconstrução com uma pinça e retire a reconstruir a partir da sacarose. Coloque-o em Kimwipes até o Kimwipes absorver a sacarose. </li><li> Transferir a reconstruir no molde de base em cima do OCT, usando uma pinça e uma espátula. Cubra o topo da reconstruir com outubro mais até que o molde base é completamente cheio. Certifique-se de que você não tem as bolhas do PTU que fará corte difícil. </li><li> Coloque o molde base de maneira uniforme em gelo seco esmagado, e permitir que o OCT para congelar completamente. </li><li> Enrole o molde base em folha de estanho e armazená-lo a -70 ° C até que esteja pronto para cortá-la com um criostato. </li></ol></li><li> Um enxerto de pele reconstruir em um mouse: <ol><li> Preparar um tubo falcon de 50 mL com 5 mL de DMEM (para congelamento e descongelamento da pele do rato). </li><li> Use uma fêmea de rato sem pêlo SCID outbred cerca de 6 semanas. </li><li> O mouse é anestesiado com (sistema de anestesia EZ) isoflurano: anestesia inicial é realizada na câmara de indução à anestesia isoflurano 4% (antes do mouse é movido para o leito cirúrgico) e manter, através de um respiradouro nosecone durante o procedimento (isoflurano: 1,5-2% ). Apoio de calor por uma almofada aquecida para evitar hipotermia e lubrificante oftálmica estéril aplicada para evitar lesões oculares durante a anestesia. </li><li> Coloque 600 mL de água num copo e deixe em cima de uma chapa quente para manter a temperatura da água entre 40-60 ° C. </li><li> Limpe a pele do rato com tintura composta benjoim e compressas de preparação de álcool. </li><li> Marcar uma linha na parte superior das costas do mouse para manter a mesma posição para suturar depois. </li><li> Corte um leito da ferida redonda de cerca de 1,2 cm de diâmetro na parte de trás do rato superior usando tesouras e pinças Iris. Cobrir o leito da ferida com esponjas gaze estéril. Coloque a pele do rato rodada em 5 mL de DMEM, em seguida, deixar em recipiente de nitrogênio líquido, até que totalmente congelado. Descongele o tubo em água quente em cima de uma chapa quente até que totalmente descongelado. Repita 3 vezes. </li><li> Retire a pele reconstruir a partir do transwell utilizando lâmina cirúrgica e remover a membrana com muito cuidado, a transferência da pele reconstruir (lado epiderme para cima) em cima do leito da ferida. </li><li> Coloque a pele do rato (lado epiderme para cima) em cima da pele reconstruir. </li><li> Fazer a primeira sutura no marcador previamente identificados, a segunda no fundo, então mais duas suturas em lados para corrigir a pele do rato. </li><li> Pele do rato limpa após a enxertia. Remover nosecone e manter mouse sobre a almofada aquecida até acordado e ambulatorial. </li><li> Coloque o mouse em uma nova gaiola. </li><li> Analgesia pós-operatória: Meloxicam (1 mg / kg) por injeção subcutânea imediatamente após a cirurgia, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. </li></ol></li></ol> 2. Resultados representativos: Reconstrói a pele com melanócitos normais e células-tronco por via cutânea Reconstrói a pele são cultivadas em uma bandeja de 6 bem especial com inserções. O compartimento dérmico é cultivada em DMEM com SFB 10% para os primeiros quatro dias (Fig. 1A). A pele reconstruir médio I é usado quando os queratinócitos são semeados com melanócitos ou células de melanoma (Figura 1B). A epiderme é exposta ao ar no dia 9, o que permite diferenciar os queratinócitos (Fig. 1C). No dia 18, a epiderme da pele reconstrói é composto de camadas estratificadas dos queratinócitos. A camada basal indiferenciado e camadas seqüencialmente diferenciados são orientados verticalmente (Figura 1D). Manchaing a seção de reconstrói com o marcador melanocítico S100 mostra que os melanócitos estão alinhados na camada basal da epiderme e se comunicar com os queratinócitos através de extensões múltiplas dendrite (Fig. 1E). O compartimento dérmico contém fibroblastos incorporado em uma matriz de colágeno tipo I. Depositado colágeno IV indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme (Fig. 1F). Quando as células-tronco por via cutânea (marcada com GFP lentiviral vetor) são encaixados com fibroblastos em uma matriz de colágeno I, eles migram para a epiderme e diferenciam-se em melanócitos (1), (Fig. 2). Várias camadas de queratinócitos na epiderme são desenvolvidas. Reconstrói a pele de tumores de melanoma Estudos clinicopatológicos indicam que melanomas progresso de uma forma faseada: nevos comuns adquiridos, nevos displásicos, RGP (fase de crescimento radial) melanomas, VGP (fase de crescimento vertical) melanomas metastático e melanomas (7). Diferentes estágios de linhas de células de melanoma são morfologicamente semelhantes entre si em 2 D-cultura (Fig. 3A-D), mas quando eles são incorporados na pele reconstrói, o comportamento das células reflete suas características em vivo. A localização ea taxa de crescimento dos melanócitos normais são rigidamente controlada na pele reconstrói (Fig. 3E). RGP melanomas primários WM35 proliferam predominantemente na epiderme (Fig. 3F), enquanto VGP melanomas WM793 crescer invasiva na derme (Fig. 3G). Metastático melanomas 1205Lu agressivamente invadir profundamente na derme (Fig. 3H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Figura 1. Reconstrói a pele com melanócitos normal. O aspecto macroscópico da pele reconstrói é mostrado na AC. Os fibroblastos A. misturado com colágeno são cultivadas em DMEM contendo 10% FBS e forma compartimento dérmico. Os queratinócitos e melanócitos B. são semeados em cima da derme e crescer na pele reconstruir médio. C. A epiderme é exposta ao ar no dia 9. D. H &amp; E-manchada pele reconstruir apresenta a epiderme composta verticalmente, camada basal orientado, e sequencialmente diferenciada camadas de células estratificadas. A derme contém fibroblastos incorporado em uma matriz de colágeno tipo I. E. S100-positivos melanócitos (setas pretas) são alinhados à membrana basal e se comunicar com os queratinócitos múltiplas. F. Colágeno IV coloração indica a membrana basal, que separa a epiderme da derme. Todas as colorações no DF foram realizados em formalina-fixo, parafina seções. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Figura 2. Células-tronco dérmica na pele reconstrói migram para a epiderme e diferenciam-se em melanócitos. No dia 5 após a semeadura queratinócitos, células GFP positivas única (verde) iniciar a migração para fora das esferas. A epiderme é ainda composto por uma única camada. No dia 8, algumas células chegar a interface epiderme derme. De dia 10, GFP células positivas estão fortemente alinhados na posição de membrana basal. A GFP positivas migraram células da epiderme marcador melanocítico expressar HMB45 (vermelho, como indicado por setas brancas). Núcleos são corados com DAPI (azul). A epiderme é desenvolvido como múltiplas camadas. A membrana basal é indicado com linhas brancas pontilhadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Figura 3. Reconstrói a pele de diferentes estágios de melanomas: AD. Melanócitos normais e células de melanoma cultivadas em culturas 2D. Os melanócitos A. de prepúcio. B. RGP WM35 células. C. VGP WM793 células. D. 1205Lu metastático de células de melanoma. E. melanócitos normais são localizados na membrana basal. F. melanoma RGP WM35 células crescem como aglomerados de células da epiderme. G. melanoma VGP WM793 invadir células na derme através da membrana basal. H. Melanoma metastático 1205Lu células invadem agressivamente em profundidade da derme. Solução de problemas <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Solução de problemas </td></tr><tr><td> Mistura de colágeno não solidificar </td><td> Cor mistura de colágeno deve ser amarelo-palha a rosa, caso contrário, o pH é errado e pode não colágeno gel. Se a cor é amarela, bicarbonato de sódio mais deve ser adicionado gota a gota. </td></tr><tr><td> Colágeno prematuramente precipita na mixuture </td><td> Manter todos os componentes no gelo até que a mistura de colágeno é colocada sobre a inserção </td></tr><tr><td> Colágeno contratada não é mesmo (um lado é mais grosso que o outro lado) </td><td> Calibrar a prateleira de incubadora </td></tr><tr><td> A epiderme é formado com menos de três camadas de queratinócitos. </td><td> Use queratinócitos indiferenciado em passagens inferiores </td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos gerando pele 3D reconstrói com melanócitos humanos normais, as células-tronco e células dérmicas melanoma. Quando cultivadas em cultura em monocamada, as células melanocíticas apresentam uma morfologia similar (achatada do eixo, ou mais dendríticas-shaped), independentemente da sua origem de estágio clínico. Em contraste, a pele 3D reconstrói recapitular estágio propriedades específicas de células de melanoma. Melanócitos humanos normais residem na membrana basal da epiderme e entre as camadas dérmicas como células isoladas. Células de melanoma primário RGP crescer em pequenos grupos ao longo da membrana basal enquanto que as células de melanoma mais agressivo VGP crescer como grandes aglomerados romper a membrana basal até a derme. Células de melanoma metastático crescer em todas as direções e invadir profundamente na derme como uma célula ou clusters. Análises quantitativas podem ser realizadas sobre este modelo de medição da profundidade da invasão e da extensão da proliferação. Além de caracterização de células normais e malignas melanocíticos, utilizando o modelo nós podemos diretamente induzir a diferenciação de células-tronco se transformam em melanócitos dérmicos amadureceu, que lar da camada basal da epiderme e estabelecer uma comunicação de boa-fé com os queratinócitos através upregulation da caderina-E ( 6). Através de vetores virais, somos capazes de ativar ou desativar a função do gene para uma melhor compreensão da dinâmica e da importância funcional de genes expressos por cada tipo de célula da pele reconstrói, que promete ser um modelo eficiente para estudar mecanismos não apenas a transformação dos melanócitos , mas também a progressão de melanoma (8). Longo prazo de observação de fenótipos celulares tornou-se possível através de enxerto de pele reconstrói a animais imunodeficientes. Como um ser humano da pele do rato-quimera é uma excelente ferramenta de pesquisa para estudar melanomagenesis e metástase de melanoma. Reconstrói a pele também pode ser uma plataforma útil para avaliação de drogas. Muitas drogas que erradicar as células cancerosas em condições de cultura 2D muitas vezes têm pouco efeito em aplicações experimentais e clínicas. Como visto no no tumor in vivo, células de melanoma em culturas 3D são muitas vezes resistentes às drogas que as células em culturas 2D responder, sugerindo que o microambiente modula vias de sinalização em melanoma. Para a descoberta de drogas bem sucedida, a pele 3D reconstruir modelo é uma ferramenta ideal pré-clínicos para prever os efeitos de compostos in vivo (9,10). Em resumo, a pele reconstruir modelos a ponte entre in vitro e in vivo. Eles vão levar a uma melhor compreensão de quais genes estão envolvidos na transformação e como as células-tronco contribuem para essa transformação.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EMEM 10x </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.071,02 </td></tr><tr><td> Tendão bovino extraídas com ácido e Colágeno </td><td> Organogênese </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Cultura de Tecidos de 6 bandejas bem com Anéis </td><td> Organogênese </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Médio Serum queratinócitos grátis </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Calf dialisadas </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.079,03 </td></tr><tr><td> recombinante Fator de células-tronco </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> FGF básico </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> Endotelina-3, humana </td><td> Americana Peptide Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH biociências </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM é) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> Insulina, transferrina, etanolamina, selênio (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiodotironina </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Soro bezerro recém-nascido </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> Tampão formalina a 10% </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Ótima de corte de temperatura media de congelamento (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Cassetes de vários </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS biópsia papéis </td><td> Triângulo Ciências Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biópsia papéis </td><td> Triângulo Ciências Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Moldes descartáveis ​​Base de Dados </td><td> Pescador </td><td> 15-182-501C </td></tr><tr><td> Tintura benjoim composto </td><td> Descartáveis ​​profissional, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Álcool Prep Swabs </td><td> CVS farmácia </td><td></td></tr><tr><td> De seda preta trançada 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Esponjas de gaze (estéril) </td><td> CVS farmácia </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris tesoura </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Lâminas cirúrgicas </td><td> Pena </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> Anestesia EZ </td><td> Euthanex Corp </td><td></td></tr><tr><td> Camundongo hairless SCID outbred </td><td> Charles rio </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

A maioria dos estudos in vitro em biologia experimental da pele ter sido feito em monoculturas duas dimensões (2D), enquanto evidências acumuladas sugerem que as células se comportam de maneira diferente quando são cultivadas dentro de uma matriz extra-celular em 3D e também interagir com outras células (1-5) . Modelos de ratos têm sido amplamente utilizados para estudar a morfogênese do tecido in vivo. No entanto mouse e pele humana tem diferenças significativas na arquitetura celular e fisiologia, o que torna difícil extrapolar estudos com ratos para os seres humanos. Desde melanócitos na pele do rato são na sua maioria localizada nos folículos pilosos, que têm propriedades biológicas distintas das dos seres humanos, que localizam principalmente na camada basal da epiderme. O recente desenvolvimento da pele humana em 3D modelos permitiu reconstruir o campo para investigar célula-matriz e célula-célula interações entre diferentes tipos celulares. O reconstrói consistir de uma &quot;derme&quot; com fibroblastos incorporado em uma matriz de colágeno tipo I, uma &quot;epiderme&quot;, que é composta por estratificado, queratinócitos diferenciados e uma membrana basal funcional, que separa a epiderme da derme. Colágeno fornece andaimes, entrega de nutrientes e potencial de célula a célula-interação. Os modelos 3D pele incorporando células melanocíticas recapitular características naturais da homeostase melanócitos e progressão de melanoma na pele humana. Como in vivo, os melanócitos na pele reconstruídos estão localizadas na membrana basal intercalados com os queratinócitos da camada basal. Células de melanoma apresentam as mesmas características refletindo o estágio do tumor original (RGP, VGP e células de melanoma metastático) in vivo. Recentemente, as células-tronco por via cutânea foram identificadas na derme humana (6). Estas células multi-potentes-tronco podem migrar para a epiderme e se diferenciam para melanócitos.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Neste relatório, nós descrevemos a pele tridimensional reconstruir modelo que imita a pele humana em arquitetura e composição. Fisiologia dos melanócitos, a progressão de melanoma eo destino de células-tronco dérmica foram investigados usando a pele reconstruir modelo. O modelo também é útil como uma ferramenta de pré-clínicos para avaliação de drogas.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

the-three-dimensional-human-skin-reconstruct-model-tool-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K visualizações.  The Wistar Institute. Neste relatório, nós descrevemos a pele tridimensional reconstruir modelo que imita a pele humana em arquitetura e composição. Fisiologia dos melanócitos, a progressão de melanoma eo destino de células-tronco dérmica foram investigados usando a pele reconstruir modelo. O modelo também é útil como uma ferramenta de pré-clínicos para avaliação de drogas.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Bioengenharia

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigando a separação de fluxo tridimensional induzida por um polip de dobra vocal modelo

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...