Este estudo é suportado pelo NIH e DC052256 DC006015 e NSF 0324769 para QG e T32-DC008072 a BS.

1. Preparação Este procedimento é de biossegurança nível 2, portanto, todas as seguintes preparações são feitas em uma cobertura de risco biológico, onde o procedimento de microinjeção é realizada. <ol><li> Preparar e pré-aquecimento a 37 ° C waterbed: Encha um saco de armazenamento de plástico com água - selo e fixado em um bloco de aquecimento esvaziado incubadora. Isso permitirá que os ratos se recuperar após a injecção. </li><li> Encher um recipiente de resíduos de risco biológico com lixívia a 10% para um volume adequado para imersão de todos os resíduos desse procedimento. </li><li> Prepare um pequeno prato aberto de etanol 70% e um segundo prato com ddH2O esterilizado e coloque no gabinete de segurança biológica. </li><li> Esterilizar uma seringa Hamilton 5μL capacidade com uma agulha de 33 gauge por pulverização para baixo do corpo e da agulha com álcool 70% com o êmbolo puxado para fora todo o caminho. Repetidamente aspirado de etanol a partir do prato e ejetá-lo todo o caminho, pelo menos, 5 vezes. </li><li> Lave o cartucho seringa, aspirando e expulsando água estéril, pelo menos, 5 vezes. Lugar seringa com segurança de lado na capa cultura e deixe-a secar. </li><li> Remover ações virais de -80 ° C de armazenamento freezer e colocar no gelo para permitir o descongelamento. Microinjeção requer 2μL de estoque de vírus por mouse em um título de 10 9 unidades infecciosas / mL. Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com o protocolo estabelecido (Lois et al., 2002). </li><li> Prepare uma etapa de injeção que fornece uma área elevada acima da superfície do capô - pode usar uma placa de cultura 10 centímetros coberto com uma folha de Kimwipe. </li><li> Organizar toalhetes com álcool, perto da estação de injeção. </li></ol> 2. Microinjeção de partículas lentiviral no epitélio olfativo Todos os procedimentos com animais realizados neste método são feitas de acordo com IACUC diretrizes aprovadas. O Mus musculus cepa C57BL/6J é o modelo animal usado em todos os experimentos demonstraram aqui. <ol><li> Anestesiar os filhotes de rato por hipotermia, tendo um rato filhote de cachorro (P0-P3) fora da gaiola e colocar o filhote em uma luva de cut-aberto no gelo por 5 minutos. </li><li> Enquanto espera para o filhote de cachorro para ser totalmente anestesiado, 2μL aspirado de estoque viral dentro da seringa Hamilton esterilizados. </li><li> Posicione o mouse em cima do filhote o estágio de injeção. Puxe a pele longe do topo da cabeça ao ouvido, em direção ao topo do pescoço. Este deve fornecer uma superfície da pele ensinou sobre a cavidade nasal e vai facilitar a injeção. </li><li> Inserir a agulha através da parte superior da cavidade nasal cerca de 3 mm abaixo da superfície da pele para atingir o epitélio olfativo. Microinject 0.5μL de solução de vírus por um tiro, a escolha de dois locais de cada lado, esquerdo e direito (quatro injeções total por mouse = 2μL de vírus necessário). Os locais de injecção devem ser escalonados para além um do outro. Para a segmentação de locais de injecção adequada, pesquisa a superfície dorsal do crânio para o contorno do bulbo olfatório. Essa linha é pouco visível ao nascimento através da pele semi-translúcidas e crânio. Para fazer com que duas injeções por lado, um objetivo a injeção apenas um esboço rostral do bulbo em um eixo medial. Faça a inserção segunda lateral para o contorno do bulbo, mas certifique-se o ângulo de injeção medialmente de modo que você pode atingir o epitélio olfativo que reside ventralmente debaixo da lâmpada. Evitar penetrar no bulbo olfatório! </li><li> Secar qualquer solução de vírus residual ou de sangue que pode escapar do local da injeção ou aberturas narina usar uma Kimwipe. Imediatamente dispor de Kimwipes no recipiente de líquido diluído bleach biohazard. </li><li> Posicione o mouse injetado para a incubadora waterbed. </li><li> Repita os passos 1-4 para todos os ratos para ser injetado, lembrando que você vai precisar de cerca 2μL de estoque de vírus por mouse. </li><li> Vamos recuperar os ratos na incubadora waterbed por 30 minutos antes de devolvê-los nas suas gaiolas originais de nidificação. </li><li> Dispor de estágio microinjeção, wipes saneantes e quaisquer produtos de papel extra de limpeza na alienação alvejante biohazard. </li><li> Limpe a seringa Hamilton por aspiração repetida e ejeção de etanol e água, em seguida, como foi feito nas etapas de preparação. Retirar a seringa para secar. </li><li> Para a eficiência máxima de transdução de repetir esse procedimento novamente em 4 horas. ORS infectados pode ser visualizado em todo o comprimento da célula em apenas três dias. </li></ol> 3. Imuno-histoquímica de flutuar seções bulbo olfatório <ol><li> Sacrificar o rato injetado no ponto de tempo desejado e fixar o tecido de perfusão com paraformaldeído a 4%. Dissecar o OB. Incubar em paraformaldeído durante a noite e, em seguida, sacarose 30% em PBS durante a noite. Incorporar em outubro meio de incorporação em gelo seco. </li><li> Cortes coronais OB são obtidos em 60μm de espessura usando um criostato. Varrer seções lâmpada em uma placa de cultura com 10 centímetros de 5ml 1x PBS (pH 7,4). Seções devem ser mantidos flutuando em PBS para permitir a outubro dissolve. Transferência de seções flutuantes e PBS em um frasco de 50 ml cônico. </li><li> Permitir seções para se depositar no fundo do frasco. Vácuo off PBS sem sugando todas as seções. Enxágüe secções de tecido com PBS 20mL. Repita os passos resolver e aspiração. Ressuspender tecido com 10 ml de PBS e seções de transferência flutuante para um frasco de 15mL cônico para imunocoloração. Uma vez que as secções de tecido se instalaram, vácuo off PBS sobrenadante sem perturbar o tecido. Ressuspender seções com 0,3% Triton X-100 em 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) permitindo que o detergente para perfurar as membranas celulares. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Vácuo fora o sobrenadante e repetir a incubação com PBS-Tx duas vezes. </li><li> Incubar cortes de tecido, em 10ml de solução de bloqueio (soro de cavalo de 5% em PBS-Tx) por duas horas à temperatura ambiente. </li><li> Solução de lavagem de bloqueio, pelo menos, duas vezes com PBS-Tx de 15 minutos cada em temperatura ambiente. </li><li> Prepare 2 mL de uma solução de anticorpo primário em PBS-Tx. Ver Reagentes e Equipamentos para a seção de anticorpos utilizados neste experimento. </li><li> Substituir lavagem PBS-Tx segundo bloqueio com solução de anticorpo primário. Incubar em uma plataforma de balanço devagar (~ 30rpm) a 4 ° C por 24-48 horas para assegurar uma penetração completa nas seções 60μm flutuante. </li><li> Após a incubação, a solução anticorpo primário pode ser recuperada com cuidado, utilizando uma pipeta e armazenados a 4 ° C para a reutilização de até duas vezes mais dentro de duas semanas sem qualquer perda significativa de intensidade da coloração. </li><li> Lavar seções três vezes em PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente com rotação suave (~ 30rpm). </li><li> Prepare 2 ml de diluição do anticorpo secundário em PBS-Tx. Vácuo fora da última lavagem, e adicione a solução de anticorpo secundário para as seções do tecido. Envolva a parte externa do frasco de coloração em papel alumínio para bloquear a luz, o que pode causar fotobranqueamento fluoróforo. Lugar envolto frasco em uma plataforma de balanço devagar e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Eliminar a solução anticorpo secundário por aspiração de distância. Lavar seções uma vez com PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente. Enxágüe duas vezes adicionais com PBS (pH 7,4) por 20 minutos cada em temperatura ambiente. Monte as secções de tecido manchado em lâminas de vidro usando Fluoromount G. </li><li> Tela através de cortes corados por axônios OSN positivamente infectados e termini axônio com um microscópio de fluorescência. </li><li> Para construir uma visão tridimensional de um rotulados OSN axônio e arbor terminal, fazer uma série de secções ópticas através da profundidade 60μm da fatia de tecido-alvo OB (ao longo do eixo z), utilizando microscopia confocal. </li><li> Esta pilha de Z-seção de imagens podem posteriormente ser projetada em conjunto para reconstruir uma perspectiva de 360 ​​° de rotação de um único axônio rotulados OSN, incluindo terminal detalhes arbor na sua totalidade. Qualquer um único ângulo de rotação podem ser capturados e exportados como um arquivo de imagem (ou seja, JPG, TIFF) para a apresentação formato 2D. </li></ol> 4. Resultados representante Com os métodos descritos aqui, pode converter neurônios sensoriais olfativos por lentivírus in vivo. Temos até o momento visualizado ORS infectados com GFP e repórteres mCherry fluorescentes, bem com uma tag-myc proteína de fusão através de imunocitoquímica. Esta técnica oferece uma abundância de ORS infectados. Ainda assim, transdução ocorre esporadicamente o suficiente para fornecer ORS etiquetadas individualmente, permitindo assim a análise da morfologia única célula. Axônios e os terminais do axônio são gravadas dentro de seções de tecido OB no meio seu ambiente nativo através de microscopia confocal (Figura 1). Toda a OSN axônio terminal arbor geralmente pode ser cativado dentro de uma seção de 40 50 ìm óptica. Alta ampliação dos terminais do axônio infectados OSN permite a análise detalhada da morfologia arbor axonal na camada glomerular. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Trajetória de um único neurônio sensorial olfativa axônio e seu terminal arbor. A) A seção coronal do bulbo olfativo de um rato P7 mostrando a camada de nervos olfativos (ONL) histoquímica para OMP (vermelho) e da camada glomerular (GL) imunocoradas com ambas as OMP e Vglut2 (cinza). Um axônio único neurônio sensorial olfativa expressando GFP (verde) viaja dentro do ONL e penetra na estrutura glomerular. B) O axônio terminal morfologia arbor dentro do glomérulo claramente evidenciado pela expressão GFP. Vglut2 co coloração cinza-in ilumina a área total glomular dentro do qual a GFP positivas axônio elabora um aborto terminal. C) Lentivirus ORS infectados expressando GFP (verde) no OE. O cytostructure do epitélio olfativo é mostrado com coloração DAPI (azul). Expressão GFP permite a visualização de corpos celulares OSN e seus processos celulares no OE. D) Um axônio OSN e sua morfologia terminal com Rap1GAP2 expressão knock-down por shRNA. Lentivírus carregando um cassete de expressão dupla com Rap1GAP2 shRNA sob o promotor U6 mouse e GFP sob umPromotor CMV foram aplicados ao OE. Infectados terminais do axônio olfativa exibiu uma mais simplificada terminal arbor quando comparada com a do controle apenas GFP. Bar = 20Hm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

Este protocolo é bio-segurança compatível com o nível 2. Todas as medidas de contenção do espaço de trabalho adequadas, proteção pessoal, e viral resíduos foram estabelecidas em conformidade. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes IACUC.

Microinjeção de resultados lentivírus de transferência permanente de construções de gene em OSN DNA genômico. Essa abordagem nos permite realizar manipulações de curto prazo ou longo prazo de genes candidatos via superexpressão ou mediada shRNA knock-down. Além disso, podemos fluorescente ORS rótulo único em uma linha de rato transgênico existentes para observar co-localização das populações receptor de odorante. Microinjeção é necessário para a transdução lentiviral de ORS. Nós tentamos rubor s...

Microinjeção: ratos recém-nascidos receberam microinjeções usando uma seringa 5μL Hamilton (Hamilton # 7647-01), equipada com uma agulha de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Reagentes imunocitoquímica: anticorpos primários: coelho GFP anticorpo policlonal (Molecular Probes # A-6455), de anticorpos policlonais contra OMP de frango (sob encomenda) (Chen et al, 2005.), Guiné porco de anticorpos policlonais contra VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorpos secundários: Cy2 conjugada burro anti-coelho (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-burro conjugado anti-galinha (Jackson Immunolab # 703-165-155) e Cy5-cabra conjugado anti-cobaia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Os cortes foram montados em lâminas de vidro com Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) com solução de 50ng/mL cromatina DAPI mancha. Confocal Imaging: Z-stack imagens foram tiradas com uma Olympus Flouview FV1000 microscópio confocal e imagens coletadas e processadas em projeções 3D usando Olympus FV10-ASW aquisição 2,01 confocal e software de análise.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

Desenvolvimento de um circuito precisa olfativa depende de projeção precisa de olfactory neurônio sensorial (OSN) axônios a seus alvos synaptic no bulbo olfativo (OB). Os mecanismos moleculares da OSN crescimento do axônio e segmentação não são bem compreendidos. Expressão do gene manipulação e posterior visualização dos axônios OSN solteiras e seus terminais morfologia arbor até agora têm sido um desafio. Para estudar a função dos genes ao nível única célula dentro de um prazo especificado, que desenvolveu uma técnica baseada lentiviral para manipular a expressão do gene em ORS in vivo. Partículas Lentivirus são entregues ORS por microinjeção no epitélio olfativo (OE). Cassetes de expressão são, então, permanentemente integrado no genoma da ORS transduzidas. Expressão da proteína fluorescente verde identifica ORS infectadas e delineia sua morfologia inteiro, incluindo o terminal axonal arbor. Devido ao tempo de resposta curto entre microinjeção e detecção de repórter, estudos da função do gene pode ser focado dentro de um período muito estreito de desenvolvimento. Com este método, nós temos detectado expressão GFP dentro de apenas três dias e até três meses após a injeção. Temos conseguido tanto a expressão mais e shRNA mediada knock-down por microinjeção lentiviral. Este método fornece morfologias detalhada dos corpos celulares e axônios OSN no nível da célula única in vivo e, portanto, permite a caracterização da função de genes candidatos durante o desenvolvimento olfativo.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização terminal<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K visualizações.  University of California, Davis. Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização terminal In vivo.

Vídeo: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.