Este trabalho foi financiado através de um R15 NIH ÁREA conceder a John Horne (NIMH; R15MH083221).

1. Embriões transgênicos <ol><li> Aqui estamos usando uma linha de zebrafish transgênicos criados através de um método de armadilha transposon mediada potenciador 8. A inserção de transgênicos inclui duas seqüências de codificação: KalTA4, uma versão otimizada zebrafish do ativador transcricional Gal4, ea proteína fluorescente vermelha, mCherry. O enhancer trap método produz linhas de zebrafish transgênicos que expressam esta cassete transgênicos sob controle de uma seqüência enhancer endógena. Assim, dependendo da identidade da seqüência enhancer específicos, expressão de ambos KalTA4 mCherry e está localizada em regiões específicas do cérebro em desenvolvimento. Para o Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 linha que estamos usando aqui, a expressão foi traduzida para vários sites na rombencéfalo, prosencéfalo, e, de particular importância aqui, o bulbo olfativo 8 (ver também Fig. 1). . Dado este padrão de expressão, ea localização da cassete dentro do genoma, os transgenes estão previstos para estar sob controle do promotor zic4 8 (ver também <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimagem / lines_distel / main</a> .). </li><li> Adulto Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 peixes heterozigotos para a inserção transgênicos são tipicamente acasalado com WT peixe (AB), levando a cerca de 50% de descendentes transgênicos. (Para uma maior porcentagem de transgênicos filhotes, dois heterozigotos pode ser acoplado.) </li><li> A fim de bloquear a formação de pigmento e facilitar imagem fluorescente, tratar os embriões transgênicos com 100 início mM N-phenylthiourea (PTU) em 08/06 hpf. </li></ol> 2. Embriões de montagem <ol><li> No hpf 24-28, transferência de embriões para a água ovo sem PTU. Identificar embriões transgênicos pela expressão de mCherry usando um microscópio de fluorescência. Remover a membrana coriônica de embriões transgênicos usando uma pinça fina. Transferência de embriões livres de suas córion a uma placa de Petri contendo tampão de eletroporação mais 0,02% tricaina [Buffer de Eletroporação: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7.2] 4. 2 minutos para permitir que o anestésico para entrar em vigor antes de prosseguir para a etapa de montagem. </li><li> Preparar uma solução 0,5% de baixo ponto de fusão ponto de agarose em tampão de eletroporação mais tricaina por microondas a solução, e depois colocar a solução em um 34-37 ° C incubadora. Quando a temperatura da solução de agarose foi equilibrada, coloque uma grande queda (~ 500 mL) da solução de agarose para o centro de uma placa de Petri 60 mm. Adicionar 6-8 embriões anestesiados para esta gota de agarose. </li><li> Utilizando uma pinça fina (ou as pontas finas das pontas de pipeta corte microloader) posição, os embriões de tal forma que todos eles estão enfrentando na mesma direção e alinhados em uma fileira vertical. Para solidificar a agarose, e prender os embriões em posição, coloque o prato sobre uma placa de Petri grande com 2-3 mm de gelo. </li><li> Uma vez que a agarose solidificou, inundar o prato com eletroporação tampão mais tricaina, garantindo que a solução cobre completamente a gota solidificada agarose. </li></ol> 3. Micro-injecção de DNA plasmídeo de expressão <ol><li> Prepare a expressão GFP plasmídeo usando um kit de isolamento midi ou maxi-prep plasmídeo (por exemplo, Qiagen). Suspender o plasmídeo para uma concentração final de 0,5 mg / mL em água estéril, mais 0,03% de vermelho de fenol. Para o experimento bulbo olfatório segmentação descrita aqui, estamos usando uma expressão plasmídeo com a seqüência de codificação de EGFP sob o controle de múltiplos sítios de ligação Gal4 (14 seqüências em tandem UAS eo promotor de peixe basal, E1b). Usando este plasmídeo, apenas as células transgenicamente expressando o fator de transcrição KalTA4 será capaz de expressar a GFP, assim, alvo de mediação expressão GFP. Nota: aqui nós estamos usando vermelho de fenol para a visualização de injeções de DNA, que deve ser aplicado para o direcionamento de outras regiões do cérebro em desenvolvimento, desde que a região pode ser acessado a partir dos ventrículos. Para o direcionamento de outros tipos celulares que requerem visualização fluorescentes, Bodipy ou corantes Quantam Dot poderia ser usado para visualizar injeções sob iluminação fluorescente. </li><li> Pipetas de microinjeção pode ser fabricado usando um extrator pipeta horizontal ou vertical. Definições de calor e puxe-força irá variar dependendo do tipo de extrator, o tipo de elemento de aquecimento, e do tipo de tubos capilares de vidro. Usando um P-30 Sutter puxador vertical, use uma configuração de calor de 980 e um pull-força de 960 para produzir longas, afiladas, pipetas acentuada a partir de paredes finas de vidro de borosilicato capilar com filamentos [Instrumento Sutter # BF100-78-10]. Pipetas Microinjetion puxado com essas configurações são selados e deve ser quebrado de volta antes da injeção. </li><li> Use uma ponteira microloader para adicionar 1-2 mL de solução de DNA plasmidial para a pipeta de injeção. </li><li> Montar esegura a pipeta carregado na pressão titular pipeta de injeção do sistema. </li><li> Ruptura de volta a pipeta carregado com uma pinça bem até produzir pulsos de pressão liberação inchado da solução de DNA vermelho. Em alternativa, dicas podem ser quebrados por volta rapidamente a penetração de uma submersa, dobrado Kimwipe laboratório. Nota: porque as pipetas de injeção são inicialmente fechado e deve ser manualmente quebrado de volta, o tamanho da ponta e do volume de injeção são variáveis. Pipetas de injeção ideal deve exigir 3-5 pulsos de injeção para encher completamente o ventrículo prosencéfalo desenvolvimento de 24 embriões hpf (100 pulsos de injeção ms a 40 psi). </li><li> Injetar a solução de DNA plasmidial para os ventrículos do cérebro em desenvolvimento como DNA que é forçado ao lado, e intercaladas em, a região do cérebro destinada a formar o bulbo olfativo. O bulbo olfativo é derivado de células da parede mais anterior do ventrículo do cérebro anterior. Assim, ao inserir a pipeta de injeção nos ventrículos de tal forma que a pipeta está apontando em direção à extremidade anterior do cérebro em desenvolvimento, a injeção de pressão força o DNA em e adjacente ao bulbo olfativo prospectivos. Injetar DNA até que a tintura vermelha é claramente visível na extremidade anterior do ventrículo do cérebro anterior. Porque o DNA começa a se difundir imediatamente, diluir o DNA, é importante avançar para a etapa eletroporação o mais rapidamente possível após a injeção (por exemplo, dentro de 10 seg). </li></ol> 4. Eletroporação <ol><li> Eletroporação é realizada utilizando eletrodos de auto-construção feita com eletrodos de platina Grama subdérmico (Tecnologia Grama # E2). Os eletrodos são conectados a um sonda de mão, ea distância final entre os eletrodos de platina deve ser de 1 mm (para mais detalhes sobre a construção ver 9). Pulsos de onda quadrada eletroporação são produzidos, ligando os eletrodos para um SD-9 Grama Stimulator (Grass Technology, modelo SD-9). </li><li> Definir o estimulador SD-9 para produzir único, 5 pulsos eletroporação ms a 70 volts. Posição dos eletrodos de tal forma que o eletrodo positivo é posicionado adjacente à extremidade anterior do embrião, enquanto o eletrodo negativo é posterior à cabeça do embrião. Iniciar manualmente ~ 7-8 pulsos eletroporação usando o interruptor de modo único do SD-9 estimulador, separando cada pulso por ~ 1 seg. Tensões apropriado irá variar dependendo da idade dos embriões ea fonte de tensão utilizada. Embriões mais jovens requerem tensões mais baixas para evitar danos embrião, que os embriões mais velhos necessitam de altas tensões para iniciar eletroporação 7. </li><li> Permitir que os embriões para recuperar pelo menos 10 minutos após a eletroporação antes de libertá-los da agarose. </li><li> Utilizando uma pinça fina, livre de embriões a partir do rastreamento agarose suavemente o contorno dos embriões, evitando contato real com os próprios embriões. </li><li> Uma vez libertado, o retorno dos embriões à água de ovo (com PTU se necessário). Mantê-los a 28 ° C até que estejam a ser trabalhada para a expressão GFP. </li></ol> 5. Embriões de montagem para imagens <ol><li> Transferência de embriões a partir de água do ovo mais PTU à água do ovo mais 0,02% tricaina. Permitir que alguns minutos para o anestésico para entrar em vigor antes de prosseguir para a etapa de montagem. </li><li> Preparar uma solução 0,5% de baixo ponto de fusão agarose no ovo água mais tricaina por microondas a solução, e depois colocar a solução em um 34-37 ° C incubadora. Quando a temperatura da solução de agarose foi equilibrada, coloque uma grande queda (~ 300 mL) da solução de agarose para o centro de uma placa de Petri 35 mm. Adicionar um embrião anestesiados para esta gota de agarose. </li><li> Utilizando uma pinça fina (ou as pontas finas das pontas de pipeta corte microloader) posição, a tais embriões que estão na posição vertical, tornando possível a visualização de uma vista dorsal do cérebro em desenvolvimento com um microscópio vertical (escopos invertida exigirá uma geometria embrião diferente, e um prato diferente permitindo a visualização a partir de baixo, ver 12). Solidificar a agarose, colocando o prato sobre uma placa de Petri grande com 2-3 mm de gelo. Re-orientação com uma pinça fina provavelmente será necessária durante a solidificação para garantir que o embrião não cair para o lado. </li><li> Uma vez que a agarose solidificou, inundar o prato com ovos água mais tricaina garantindo que a solução cobre completamente a gota solidificada agarose. </li></ol> 6. Resultados representativos: Embora a expressão GFP pode ser observado tão cedo quanto seis horas após a eletroporação, aqui estamos mostrando imagens de um embrião 4 dias após o eletroporação de tal forma que a estrutura de neurite das células-alvo está suficientemente desenvolvido. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgênicos linha de armadilha enhancer exibe expressão constitutiva de mCherry (e KalTA4) na parte posterior do cérebro, cerebelo, cérebro anterior, e bulbo olfatório em embriões de cinco dias pós-fertilização (Fig. 1A e 1C). Embriões que têm tido uma expressão UAS-GFP plasmídeo incorporados por eletroporação alvo (como descrito acima), mostram expressão GFP, que é restrita a células do bulbo olfativo de desenvolvimento (Fig. 1B, 1D e 1E). Apenas as células que expressam transgenicamente o fator de transcrição KalTA4 são capazes de ativar a expressão deste plasmídeo UAS-GFP. Incorporação desse plasmídeo em embriões não-transgênicas não leva a qualquer expressão GFP detectável. Assim, é a ação combinada de eletroporação alvo de UAS-GFP e de expressão transgênica localizada do motorista KalTA4 que leva à expressão exclusiva de GFP em células do bulbo olfativo desenvolvimento. A GFP células que expressam show típico projeções axonal das células bulbo olfatório mitral (Figura 1B e 1D) 10. Para visualizar projeções axônio, imagens em figura 1B e 1D teve que ser exposto a altos níveis tais que a região de corpos celulares foram bem mais exposto. A menor nível de exposição (Fig. 1E) mostra que os corpos celulares expressando GFP são de fato localizada no bulbo olfatório (compare Fig. 1C e 1E;. Linha cinza marca a fronteira do bulbo olfatório). <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Targeted expressão GFP no bulbo olfativo de um embrião de peixe-zebra 5 dpf. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgênicos linha de armadilha enhancer, exibe expressão constitutiva de mCherry no rombencéfalo cerebelo, cérebro anterior, e bulbo olfatório (A e C, mCherry fluorescência mostrada em vermelho). Essa expressão de mCherry é mediada por transgênicos Gal4-expressão. Embriões que foram electroporated com um vetor de expressão UAS-GFP aos 28 hpf, display expressão GFP-alvo do bulbo olfatório até 5 dias pós-fertilização (B, D e E, de fluorescência da GFP mostrado em verde. Embrião mesmo que em A e C). Uma imagem de menor exposição, no fundo, (E) mostra que a expressão GFP é limitado a organismos de células do bulbo olfativo. A linha cinza indica a borda do bulbo olfatório. Campo claro (escala de cinza), fluorescência verde (verde), e fluorescência vermelha (red) todas as imagens foram ter com um microscópio Olympus BX60 fluorescência.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós descrevemos um método de eletroporação in vivo em zebrafish que utiliza um enhancer trap Gal4 linhagem transgênica para direcionar a expressão do transgene electroporated a uma população específica de células no bulbo olfativo desenvolvimento. Esta abordagem combina a excelente resolução temporal de eletroporação in vivo 7 com a expressão tipo específico de células mediado por linhas de enhancer trap transgênicos 8. Embora aqui temos descrito o direcionamento do bulbo olfatório, em eletroporação in vivo podem ser usados ​​para atingir outras regiões do sistema nervoso em desenvolvimento 2-7, e linhas de enhancer trap estão disponíveis com a expressão específica de Gal4 em muitos diferentes tipos de células ou tecidos específicos 8, 11. É claro, esta técnica de eletroporação também deve ser adequado para outros combinatioral abordagens genéticas, como a LexA ou sistemas de Tet 13, 14, 15. Uma grande vantagem da eletroporação é que não há necessidade de fazer mais linhagens transgênicas, uma vez que uma adequada Gal4-line está disponível. Isso economiza seis meses. Na eletroporação in vivo permite a incorporação de oligonucleotídeos em neurônios e seus precursores em qualquer estágio específico de desenvolvimento de sistemas nervoso é de interesse 7. Esta resolução temporal é particularmente vantajoso para a perda de função de análise, porque pode contornar problemas com genes alvo que têm funções essenciais em estágios precoces do desenvolvimento. O método descrito aqui também pode ser usado para incorporar a perda de função, incluindo reagentes oligonucleotides RNAi ou construções e anti-senso morfolino oligonucleotides 4, 7. Plasmídeo-driven reagentes, tais como dominante negativo plasmídeos proteína expressão ou plasmídeos hairpin curto-RNAi também pode ser colocado sob controle de um Gal4 UAS, permitindo que para o tipo específico de célula precisa a expressão que temos mostrado aqui para expressão da GFP.

Reagentes: <ul><li> Agarose de baixo ponto de fusão (Sigma, A9414) </li><li> Kit midi ou maxi-prep plasmídeo (por exemplo, Qiagen, # 12643] </li><li> Vermelho de fenol (Sigma, P3532) </li></ul> Equipamento: <ul><li> Capilar de vidro com filamento; ID = 0,78 mm; OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Grama SD-9 Stimulator (Grass Technology, modelo SD-9) </li><li> Grama eletrodos de platina subdérmico, agulha (Tecnologia Grass, # E2) </li><li> Micro-carregador de ponteiras (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipeta extrator (por exemplo, Sutter, modelo P-30) </li><li> Pipeta extrator (por exemplo, Sutter, modelo P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

Na eletroporação in vivo é um método poderoso para a entrega de plasmídeos DNA expressão, RNAi reagentes e morfolino oligonucleotídeos anti-senso a regiões específicas de embriões em desenvolvimento, incluindo os de C. elegans, pinto, Xenopus, peixe-zebra, e mouse 1. Em peixes-zebra, no eletroporação in vivo tem sido demonstrado que têm resolução espacial e temporal excelente para a entrega destes reagentes 07/02. A resolução temporal deste método é importante porque permite a incorporação desses reagentes em estágios específicos do desenvolvimento. Além disso, como expressão de vetores electroporated ocorre dentro de 6 horas, 7, este método é mais oportuna do que as abordagens transgênicas. Embora a resolução espacial pode ser extremamente preciso ao alvejar uma única célula 2, 6, muitas vezes é preferível incorporar os reagentes em uma população de células específicas dentro de um tecido ou estrutura. Ao alvejar células múltiplas, em eletroporação in vivo é eficiente para a entrega a uma região específica do embrião, no entanto, particularmente no desenvolvimento do sistema nervoso, é difícil para alvejar tipos específicos de células unicamente através de eletroporação espacialmente discreta. Alternativamente, as linhas de enhancer trap transgênicos oferecem excelentes célula expressão tipo específico de transgenes 8. Aqui nós descrevemos uma abordagem que combina transgênicos Gal4 baseado linhas armadilha enhancer 8 com espacialmente discreta eletroporação in vivo 7, 9 e atingem especificamente a desenvolver neurônios do bulbo olfatório zebrafish. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (anteriormente GA80_9) enhancer trap line descrito anteriormente 8, exibe alvo expressão transgênica de mCherry mediada por um peixe-zebra otimizado Gal4 (KalTA4) ativador transcricional em várias regiões do cérebro em desenvolvimento, incluindo rombencéfalo, cerebelo, cérebro anterior, eo bulbo olfativo. Para direcionar a expressão GFP especificamente para o bulbo olfativo, um plasmídeo com a seqüência de codificação de GFP sob o controle de múltiplos sítios de ligação Gal4 (UAS) foi electroporated na extremidade anterior do prosencéfalo na hora 24-28 pós-fertilização (hpf). Embora este método incorpora DNA plasmídeo em várias regiões do cérebro anterior, a expressão GFP é apenas induzida em células transgenicamente expressando o fator de transcrição KalTA4. Assim, usando a linha de GA080_9 transgênicos, essa abordagem levou a expressão GFP exclusivamente no bulbo olfativo desenvolvimento. Células expressando GFP alvo através desta abordagem mostraram projeções típicas axonal, como descrito anteriormente para as células mitral do bulbo olfatório 10. Este método também poderia ser usado para entrega alvo de reagentes, incluindo-hairpin RNA curto plasmídeos expressão interferências, o que daria um método para espacialmente e temporalmente discreta análise de perda de função.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

A resolução temporal e espacial das manipulações genéticas determina o espectro de fenômenos biológicos que possam perturbar. Aqui usamos temporal e espacialmente discreta<em&gt; In vivo</em&gt; Eletroporação, combinado com linhagens transgênicas de peixe-zebra, para induzir a expressão de um transgene GFP especificamente nos neurônios do bulbo olfativo desenvolvimento.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K visualizações.  Pace University. A resolução temporal e espacial das manipulações genéticas determina o espectro de fenômenos biológicos que possam perturbar. Aqui usamos temporal e espacialmente discreta In vivo Eletroporação, combinado com linhagens transgênicas de peixe-zebra, para induzir a expressão de um transgene GFP especificamente nos neurônios do bulbo olfativo desenvolvimento.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...