Agradecemos ao Dr. Canção Yijun, e membros da Kuruvilla Hattar Zhao tri-laboratório do Departamento de Biologia, da Universidade Johns Hopkins para aconselhamento e ajuda. Suportado pelo NIH concede DC007395 e DC009946.

Parte 1. A configuração de gravação EOG O aparelho de gravação consiste de um eletrodo de registro, eletrodo de referência, tubo de ar, estágio da amostra, e microscópio de dissecação, tudo ancorado em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday. Micromanipuladores são usadas para a colocação dos eletrodos e do tubo de entrada de ar. A corrente de ar contínua é borbulhar na água destilada para adicionar umidade antes de passar através do tubo de vazão de ar e sobre a amostra. A placa de cultura 60 milímetros cheio de Sylgard a uma profundidade de 6-8 mm é usada como uma superfície de montagem para a amostra. Um bem e um canal são esvaziadas do Sylgard no prato de montagem para fornecer um meio para conectar eletricamente o eletrodo de referência com o modelo modificado através de solução de Ringer. O eletrodo de registro eo eletrodo de referência são conectados a um amplificador. Sinais do amplificador são enviados para um digitalizador e, em seguida, a um computador. Software, tais como Axograph ou pClamp pode ser usado para controlar o protocolo de estimulação, para gravar o sinal, e para posterior análise das respostas. Um osciloscópio conectado após o amplificador pode ser conveniente para monitoramento em tempo real do potencial elétrico ao colocar o eletrodo de gravação e durante as gravações EOG. Entrega de estímulos olfativos é controlado por um Picospritzer, que é conectado ao mesmo computador usado para a aquisição de sinal. A pressão do ar no Picospritzer está definido para 10 psi. Um único tanque de ar e regulador pode ser usado para suprimento de ar para o ar tanto tabela eo Picospritzer. Um segundo tanque de ar e regulador é usado para fornecer ar para a corrente de ar umidificado, pois isso requer uma pressão mais baixa e uma grande quantidade de fluxo de ar. Pouco antes de entregar um estímulo odorante, a saída Picospritzer está conectado a uma garrafa de odores. A garrafa odorant é então ligado ao tubo de ar. Parte 2: Preparando-se eletrodos O eletrodo de gravação é um fio de prata chlorided em um copo puxado capilar preenchido com solução de Ringer modificado (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizado por filtração). O eletrodo de referência é um fio de prata chlorided. <ol><li> Instale fio de prata no porta-eletrodo. Para o eletrodo de registro, de um a dois centímetros de fio devem se projetar a partir do fim do suporte do eletrodo. Mais fio pode ser deixado para o eletrodo de referência. </li><li> Para adicionar o casaco AgCl para o fio de prata, a posição do fio em 0,1 M NaCl e ligue o suporte do eletrodo para o terminal positivo de uma fonte de energia 1,5-9 V DC. O terminal negativo da fonte de alimentação deve ser eletricamente conectados à solução de NaCl 0,1 M. Permitir que a reação chloriding para continuar por 10 minutos. Para equalizar a carga estática entre a gravação eo eletrodo de referência, brevemente os eletrodos juntos antes de instalá-los no aparelho de gravação. </li><li> Puxar um capilar de vidro usando um extrator micropipeta. A abertura na ponta do capilar deve ser em torno de 10/05 microns de diâmetro. </li><li> Use um lápis de diamante para marcar e quebrar o fim brusco do capilar por isso é ~ 2 cm maior do que o fio de prata. -Fogo polonês a extremidade cortada com a tocha butano. </li><li> Melt agarose 0,5% em solução de Ringer modificado. Puxe uma pequena quantidade de solução de agarose derretida na ponta do eletrodo usando uma pipeta. </li><li> Preencher o capilar puxado aproximadamente 1 / 2 do caminho com solução de Ringer modificado (uma seringa que foi aquecido e puxado para ter um final longo e fino é útil para esta finalidade). Agite suavemente o capilar para desalojar as bolhas de ar. Armazenar o eletrodo cheia no frasco de armazenamento com uma pequena quantidade de solução de Ringer modificado no fundo até que estejam prontos para serem usados. Uma vez que uma amostra de tecido é preparado e pronto para a gravação, instale um capilar preenchido ao longo do fio eletrodo de registro. </li></ol> Parte 3: Preparar soluções odorant O acetato de amila odores e heptaldehyde evocam respostas grandes e, assim, são escolhas boas como estimulantes EOG. <ol><li> Em tubos de microcentrífuga, preparar uma série de diluições de odores em dimetil sulfóxido (DMSO). Como ponto de partida para uma curva dose-resposta, prepare-10 diluições de 5 M para 5 x 10 -6 M. Fazer diluições fresco todos os dias. </li><li> Diluir ainda mais o odorants 50 vezes na água misturando 100 mL de ações diluídas em DMSO com 4,9 ml de água em duas garrafas com rolhas de silicone onça. Deixe as soluções equilibrar nas garrafas por pelo menos 30 minutos. Note que a concentração de vapor de odorante em cada garrafa é desconhecida, mas pode variar em função da concentração de odorante na fase líquida. </li><li> Coloque duas agulhas calibre 18, através da rolha de silicone para provide portas de entrada e de saída. As portas devem ser ligados quando a garrafa não estiver em uso. </li></ol> Parte 4: Gravação dos dados e análise de EOG <ol><li> Sacrificar um rato por CO 2 ou a eutanásia overdose anestésico seguido de decapitação. Retire a pele que cobre o crânio e sagital bisect a cabeça ao longo da linha média. </li><li> Monte uma metade da cabeça, lado medial para cima, sobre o prato de montagem. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos. </li><li> Coloque o prato com tecido montada no palco de gravação. Alinhar o palco para que o local de gravação na cornetos está centrada sob o microscópio. </li><li> Ligue o tanque de ar para fornecer ar umidificado à superfície da concha. Posicione o tubo de ar de modo que é de aproximadamente 10 mm de distância do local de gravação. A vazão é de aproximadamente 600 mL / min. </li><li> Definir o amplificador para o modo DC (amplificação AC irá induzir artefatos no sinal de EOG) com filtro passa-baixa a 1 kHz, e ganho em 100X. </li><li> Montagem de gravação e eletrodos de referência na micromanipuladores. </li><li> Inferior o eletrodo de referência dentro do poço sobre o prato de montagem e cobrir com solução de tal forma que é eletricamente conectada ao tecido modificado Ringer. </li><li> Cuidadosamente abaixe o eletrodo de registro na superfície do corneto IIb ou III. O eletrodo mal deve tocar a superfície do epitélio olfativo! Quando o eletrodo entra em contato com o epitélio (isto é, completa um circuito elétrico) uma linha de base reta aparecerá no osciloscópio. </li><li> Anexar uma garrafa odorant à porta lateral do tubo de ar. </li><li> No computador, iniciar um protocolo de estimulação. A taxa de amostragem para aquisição de dados deve ser de 2 kHz ou superior. O software irá desencadear um impulso de odor e começar a gravar. </li><li> Um protocolo de estimulação típico pode ser de 100 ms duração do pulso único, emparelhado 100-msec pulsos separados por um intervalo de 1 seg, ou a 10 seg de pulso sustentado. </li><li> Dar algum tempo entre os protocolos de modo que o tecido é minimamente adaptadas. Um minuto é suficiente para as concentrações de líquido de acetato de amilo e heptaldehyde até 10 M -3; em concentrações mais elevadas permitem que 5 minutos. Depois de entregar as concentrações de odor alta (como no final de uma curva dose-resposta) odor residual pode permanecer no tubo. Lave o tubo de ar com 95% de etanol e seco antes de continuar com amostras de tecido adicional. </li><li> Axograph software oferece ferramentas para medir os parâmetros-chave do sinal de EOG. Tais parâmetros incluem a amplitude de resposta, latência, tempo de pico, e constantes de tempo da rescisão. Pode ser desejável para digitalmente filtro de traços a 25 Hz antes de uma análise mais aprofundada. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Parâmetros para EOG análise. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para a comparação de respostas entre os ratos, incluindo a amplitude da resposta, a latência (o tempo entre quando o estímulo é administrado ea resposta começa), aumento do tempo (o tempo entre o início da resposta eo pico), tempo de pico (o tempo desde o início do estímulo até o pico da resposta), e constante de tempo de terminação (τ, determinado pelo ajuste a fase de decadência da resposta a uma única equação exponencial ). Para a comparação dos parâmetros cinéticos, tais como latência, tempo de subida, e constante de tempo de terminação, é aconselhável para normalizar a amplitude do pico das respostas antes da análise. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Representante EOG sinais em diferentes protocolos de estimulação. (A) Exemplos de EOGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila. A linha preta na parte superior do painel indica o momento ea duração do estímulo odorante. As concentrações na legenda são as concentrações da solução líquida. (B) A relação dose-resposta em média de cinco camundongos. Barras de erro são os intervalos de confiança de 95%. Um declínio na amplitude de pico é freqüentemente observado em concentrações odor muito alto. (C) Um exemplo de um EOG em resposta a um estímulo emparelhado pulso. Um único pulso curto de odorant provoca adaptação com duração de vários segundos. (D) Um exemplo de um EOG em resposta a uma de 10 seg sustentada estímulo odorante. O EOG dessensibilização mostra durante a apresentação odorant contínua.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1.">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li><li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2+/CaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation.">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li><li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Camundongos foram tratados e sacrificados com os métodos aprovados pelo Animal Care e Comitês Uso do The Johns Hopkins University.

Com a configuração descrita neste protocolo, os estímulos olfativos na superfície do epitélio olfativo será consistente entre preparações de tecido, permitindo a comparação entre o tipo selvagem e ratos mutantes, embora a concentração de odores e dinâmica exata é desconhecida. Vários fatores, especialmente a localização de gravação ea taxa de fluxo de ar umidificado, causam variações na EOG. Cuidados devem ser tomados para gravar a partir de posições semelhantes sobre o corneto mesmo para minimizar a variação. Isto pode ser facilmente alcançado de forma consistente a gravação do mesmo lado da cabeça e manter a pegada do microscópio, tubo de odor, e micromanipuladores sobre a mesa de ar inalterada entre amostras de tecido. Além disso, amostras de tecido deve ser colocado imediatamente no fluxo de ar umidificado após a dissecção para evitar a secagem excessiva do tecido. EOG gravações em ratos também podem ser realizadas com um aparelho de perfusão de líquido no mouse preparado cornetos 7, 14, 15, ou deixando a cabeça intacta e inserindo o eletrodo em um pequeno buraco perfurado acima dos cornetos 16, 17. Cada variação de gravação EOG tem suas próprias forças: ar-fase gravações em preparações de tecido, conforme descrito neste protocolo requer uma quantidade mínima de instalação e são mais fáceis de conduta; gravações usando um aparelho de perfusão de líquidos facilitar o uso de reagentes farmacológicas, embora o natureza hidrofóbica de odores muitas complica entrega odor, por último, as gravações em que o chefe é deixada intacta pode ser usado em &#39;artificial sniff&#39; experimentos, embora a colocação do eletrodo é mais difícil do que quando os cornetos estão totalmente expostos.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Animais dependem do olfato para muitos comportamentos críticos, tais como encontrar fontes de alimentos, evitar predadores, ea identificação de membros da mesma espécie para acasalamento e outras interações sociais. O electroolfactogram gravação (EOG) é um método informativo, fácil de conduzir, e de confiança para a função teste olfativo no nível do epitélio olfativo. Desde a descrição de 1956 do EOG por Ottoson em rãs 1, a gravação EOG tem sido aplicado em muitos vertebrados, incluindo salamandras, coelhos, ratos, camundongos e humanos (revisado por Scott e Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Os recentes avanços na modificação genética em camundongos reacenderam o interesse pela gravação do EOG para a caracterização fisiológica da função olfativa em knock-out e knock-em camundongos. EOG gravações têm sido aplicados com sucesso para demonstrar o papel central das componentes de sinal olfativo de transdução de 3-8, e mais recentemente para caracterizar a contribuição de certos mecanismos de regulação de respostas OSN 12/09. Detecção de odores ocorre na superfície do epitélio olfativo sobre os cílios de ORS, onde uma cascata de transdução de sinal leva à abertura de canais iônicos, gerando uma corrente que flui para os cílios e despolariza a membrana 13. O EOG é o potencial negativo registrado extracelularmente na superfície do epitélio olfativo com a estimulação odorant, resultante de um somatório das mudanças potenciais causados ​​pela individuais ORS resposta no campo de gravação 2. Comparação da amplitude e da cinética do EOG, assim, fornecer informações valiosas sobre como modificação genética e outras manipulações experimentais influenciam a sinalização molecular subjacente a resposta à OSN odor. Aqui nós descrevemos uma gravação EOG ar-fase em uma preparação de cornetos rato olfativo. Resumidamente, depois de sacrificar o rato, o cornetos olfativos são expostos por bisecting a cabeça ao longo da linha média e remoção do septo. A preparação concha é então colocada na configuração de gravação, e um eletrodo de gravação é colocado na superfície do epitélio olfativo em uma das conchas nasais medial. Um eletrodo de referência é eletricamente conectada ao tecido através de uma solução tampão. Um fluxo contínuo de ar umidificado é soprado sobre a superfície do epitélio para mantê-lo úmido. O vapor de soluções odorant é soprado para a corrente de ar umidificado para estimular o epitélio. Respostas são gravadas e digitalizadas para posterior análise.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K visualizações.  Johns Hopkins University. O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Vídeo: Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Neurociência

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...