Este trabalho foi financiado pela empresa de seguros de vida &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Ecole des Neurociências de Paris (PEV), a Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; no quadro de &quot;NEURON ERA-NET&quot; de FP7 programa pela Comissão Europeia, &quot;Foundation pour la Recherche Medicale&quot;, a Fundação Letten ea Fundação Pasteur.

1. Estereotáxica injeções <ol><li> O vírus usado nesses experimentos é um vetor de replicação-deficiente lentiviral com base no vírus HIV para expressar Channelrhodopsine2-YFP (proteína fluorescente amarela) fusão construção conduzido por um promotor sinapsina 6. O plasmídeo foi generosamente fornecidos pelo grupo de pesquisa K. Deisseroth &#39;s ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com protocolos estabelecidos 7. Vector títulos médios foram da ordem de 10 10 unidades de transdução / ml. Alíquotas virais são armazenadas a -80 ° C e devem ser descongeladas apenas antes de carregá-pipeta. Múltiplas congelamento / descongelamento deve ser evitado. Nunca exposição solução o vírus diretamente para gelo seco. </li><li> Prepare pipetas de vidro usando vidro borosilicato capilares no padrão pipeta extrator (Sutter P-97 Pipeta extrator). A configuração puxando deve ser devidamente calibrado para render uma pipeta longa e rígida. Em seguida, corte a ponta da pipeta usando uma tesoura para obter uma ponta de 30-40 mM de diâmetro. Loja puxado pipetas em uma caixa livre de poeira. </li><li> Configurar o Nanoject II microinjetor com as instruções do fabricante para entrega de 50 nL. Prepare a pipeta de injeção por volta de enchimento com óleo mineral e inseri-lo para o êmbolo microinjetor. Anexar o microinjetor em um quadro estereotáxico. Óleo parcialmente vazias da pipeta de vidro antes de encher com a solução de vírus </li><li> Com uma micropipeta, a transferência de 2 ml de solução de vírus em um pedaço estéril de Parafilm. Suavemente inferior a pipeta de vidro na gota de solução de vírus e encher a pipeta com 1-2 mL. Certifique-se que não há bolhas de ar na pipeta. </li><li> Anestesiar um mouse com 100 Ketamina mg / kg e 10 Xilazina mg / kg, diluída em solução salina estéril. Remover os pêlos do couro cabeludo doanimal usando cortadores de roedor, navalha, tesoura, ou agente depilitory química. Desinfectar o couro cabeludo com três aplicações de alternância de etanol 70% e betadine. Todos os instrumentos cirúrgicos também devem ser autoclavados e depois desinfetados com álcool 70%. Colocar o animal no quadro estereotáxico com barras de orelha e nariz bar, assegurando que a cabeça está seguro. Aplicar pomada para evitar a secagem das córneas. </li><li> Com um bisturi, cortou o couro cabeludo de entre os olhos para entre as orelhas. Puxe a pele de lado a expor o crânio e ancorar a pele com um par de pinças. Limpe a superfície do crânio. O aparelho estereotáxico é zerado com a ponta da pipeta de vidro na bregma. Então a dica é posicionado no local da injecção (ântero-posterior, 3,30; Medio-Lateral, ± 0,82, para ambos os hemisférios direito e esquerdo, respectivamente). A posição da barra de nariz tem que ser ajustada de acordo com o cálculo das coordenadas estereotáxica. Em nosso experimento, a barra de nariz é ajustado uté bregma e local da injeção são alinhados à mesma altura. </li><li> Identificar o local da injeção. Usando uma broca de alta rotação cirúrgica, com cuidado faça furos no crânio. Com uma agulha de seringa dobrados enganchado na ponta, retire os restos de ossos finos para expor a dura-máter. Verifique se o buraco é centralizado na posição correta. Tome cuidado para não vasos sanguíneos ruptura na superfície do cérebro durante a perfuração. Se os vasos sanguíneos são rompidos, pressione suavemente na superfície do cérebro com um pequeno chumaço de algodão ou tecido por vários segundos até que o fluxo de sangue pára. </li><li> Inferior a pipeta e zero a altura dorso-ventral, quando a ponta da pipeta toca a superfície do cérebro. Então, menor a profundidade correta Dorso-Ventral (Dorso-Ventral, 2,9 de superfície do cérebro) e aguarde 30 segundos para o equilíbrio de pressão. Injetar 4 vezes 50 nl de vírus para um total de 200 nl. Aguarde 30 segundos entre cada injeção. </li><li> Um minuto após a última injecção, lentamente retirar o tubotte. Repita 1,6-1,8 pontos para outro hemisfério. Remover o animal do aparelho estereotáxico, limpe a incisão e costure a pele cortada com fios cirúrgicos. Permitir que o animal se recuperar na almofada de aquecimento antes de retornar a gaiola. Além disso, os animais podem ser dado um analgésico não-esteróides anti-inflamatórias (por exemplo, carprofeno 4mg/kg) imediatamente após e 3 dias após a cirurgia. </li></ol> 2. Implantação LED crônica para estimulação in vivo optogenetic no bulbo olfativo <ol><li> Animais injetados com partículas lentiviral bilateralmente estão próximos cronicamente implantados com um azul miniatura LED (Osram, LED 4.6W CMS azul). Soldar os pinos LED a um conector fêmea miniatura elétrica para que o conector é posicionado no lado oposto do LED. Verifique se não há nenhum corte curto elétrica e identificar o pino positivo e negativo do conector. Teste o LED ligando-o a um controlador de corrente para LED apesar de um cabo apropriado. </li><li> Para medir e / ou define o poder absoluto da luz LED, montar o LED em um micromanipulador e posição do LED em contato direto com o fotodetector de um medidor de energia de um pico de intensidade da luz em 470 nm. Perfurar um furo de 3 mm de diâmetro em uma placa de PVC opaco. Apor pinhole isso para o medidor de energia e construir uma curva padrão de potência óptica contra entrada de corrente para calcular a potência por mm 2. </li><li> Para medir a propagação da luz através do cérebro, cortar blocos de tecido cerebral fresco de 300, 500, 1000, 1500 e 2500 mM espessura em 0-4 ° C ACSF usando um 14 vibratome. Coloque um pedaço de crânio com uma craniotomia idêntico ao realizado em camundongos vivem sob o LED. Em primeiro lugar, medir a potência de luz sem tecido centrada em LED. Em seguida, coloque cada bloco de tecido entre o LED eo fotodetector do medidor de potência, e medir o poder. Construir uma curva de espessura do tecido contra fração de transmissão relativo, calculado como a razãoentre a potência medida através do tecido e sem tecido. </li><li> Anestesiar um mouse com 100 Ketamina mg / kg e 10 Xilazina mg / kg, diluída em solução salina estéril. Limpar e desinfetar o LED com etanol 70%. Remover os pêlos do couro cabeludo do animal e desinfete o couro cabeludo com três aplicações de alternância de etanol 70% e betadine. Em seguida, colocar o animal no quadro estereotáxico. Aplicar pomada para evitar a secagem das córneas. Ligue o conector a um detentor estereotáxica. A posição da barra de nariz deve ser ajustado até que a superfície do crânio acima do bulbo olfativo é perfeitamente horizontal e paralela à superfície da miniatura LED. </li><li> Com um bisturi, cortou o couro cabeludo de 3 mm anterior aos olhos a 3 mm posterior para os ouvidos. Puxe a pele de lado e ancorá-la com um par de pinças. Raspe a membrana na superfície do crânio usando uma lâmina de barbear. Limpe e seque o crânio. Aplique uma capa fina de cola de cianoacrilato para permitir ad subseqüenteshesion de acrílico dental. </li><li> Usando uma broca de alta rotação cirúrgico, realizar uma craniotomia retangular (1 mm e 3 mm caudal lateral; centrada em 5,1 milímetros caudal, 0 mm lateral do bregma) ao longo dos bulbos olfatórios. Para fazer isso, com cuidado até o fina do crânio apenas uma fina camada de osso permanece. Remova cuidadosamente o osso remanescente com a ajuda de uma agulha de seringa dobrados. Cuidados especiais devem ser tomados para evitar a perfuração da matéria dura e ruptura dos vasos sanguíneos principais que se encontram entre os dois hemisférios e na borda caudal do bulbo olfatório. Acúmulo de sangue e coagulação na superfície do cérebro impede a penetração da luz ideal para o tecido. Lavar a craniotomia ea superfície do cérebro com solução salina estéril e, em seguida, secar o crânio. </li><li> Anexar a miniatura de LED para o conector. Inferior a miniatura LED na parte superior do bulbo olfatório. O eixo principal do LED miniatura deve ser paralela ao eixo rostral-caudal do rato, limpa com solução salina estéril e dry o crânio. Então segura o LED para o crânio com uma primeira camada de acrílico (de cimento, ou seja, policarboxilato), seguido por uma segunda camada de acrílico dental. A adição de dois parafusos pequenos pode ser obrigado a corrigir o LED. Os parafusos devem ser inseridas no crânio (posterior à posição LED) e coberto com ambos os acrílicos. Enquanto o acrílico é ainda líquido, puxar para trás e cola as bordas livres do couro cabeludo na superfície do acrílico dental. Tome cuidado para não aplicar qualquer acrílico sobre o conector. Depois que o acrílico tem endurecido, retire o animal do aparelho estereotáxico e deixá-lo recuperar em uma almofada de aquecimento antes de retornar a gaiola. Animais fiquem isolados em sua gaiola para se recuperar da cirurgia para pelo menos sete dias. Além disso, os animais podem ser dado um analgésico não-esteróides anti-inflamatórias (por exemplo, carprofeno 4mg/kg) imediatamente após e 3 dias após a cirurgia. LEDs devem ser testados antes da implantação e após o término dos experimentos. </li><li> A luz electrical cabo é utilizado para amarrar o animal a um controlador de corrente para LED acoplado a um gerador de pulsos (Master-8) para controlar o tempo e intensidade do LED. O cabo fino permite a completa liberdade de movimento. Tome o cuidado de respeitar a polaridade do conector. Invertendo a polaridade pode quebrar o LED. </li></ol> 3. Resultados representativos: ChR2-YFP é expressa em neurônios transduzidas aproximadamente 48 horas após a injeção, e permanece estável por vários meses 7. A Figura 1 é uma imagem representativa de um corte sagital de um animal de paraformaldeído fixa 15 dias após a injecção. Observe a rotulagem denso eo tamanho do local de injecção na RMS. Um grande número de células recém-nascidas têm migrado ao longo da RMS para colonizar as diferentes camadas do bulbo olfatório (Fig. 1). A proteína de fusão é expressa em todos os compartimentos neurônio, incluindo a soma, os dendritos, e espinhas. Miniature LED impla<html> ntation permite em larga escala ea estimulação óptica barata de uma ampla região de interesse. O animal é amarrado ao controlador de LED com um cabo de luz elétrica que permite uma total liberdade de movimentos. Caracterizando a difusão da luz no tecido cerebral e no limiar de ativação ChR2, estima-se que a ativação óptica pode ser acionado a uma profundidade de 2 milímetros ~ abaixo da superfície do LED (Fig. 2A). Para monitorar a ativação funcional de ChR2-expressando neurônios in vivo, a expressão de c-fos, um marcador de atividade neuronal, podem ser analisados ​​após a estimulação repetitiva de luz (Fig. 2B). Como alternativa, em gravações vitro eletrofisiológicas de neurônios expressando-ChR2 acoplado ao estímulo de luz focal pode ser realizada 14. Finalmente, dois fótons alvo solta-patch gravações têm sido usados ​​para estudar a ativação funcional de ChR2-expressando neurônios corticais por LED miniatura similar in vivo 9. ntent &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Figura 1. ChR2-YFP expressão da injeção lentiviral na corrente migratória rostral. Representante imagens confocal de seções sagital do bulbo olfativo de um rato de 15 dias após as injeções de um lentivírus na RMS rostral. Observe a presença de neurônios espalhados YFP migrando do recém-nascido no final do RMS para as diferentes camadas da OB. A maioria das células recém-nascidos (95%) são células granulares, que soma mentira na camada de célula granular (GCL) e dendritos arborize na camada plexiforme externa (EPL). A pequena população de neurônios recém-nascidos migram para a camada mais superficial da OB, na camada glomerular (GL). Barra de escala, 100μm. Ampliação, Inset alto de uma célula granular recém-nascido, mostrando a expressão membrana de ChR2-YFP nos dendritos, assim como em lombadas. Barra de escala, 20Hm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Diagrama de implantado LED na parte superior do bulbo olfatório e luz evocadas expressão c-fos em ChR2-YFP expressando células granulares novas. Um desenho esquemático do LED implantados acima do bulbo olfatório. B, Representante imagens confocal mostrando duplo rotulados ChR2-YFP + c-fos células grânulo + uma hora após estimulação luminosa do bulbo olfatório. C-fos expressão é revelada através de um coelho de anticorpos anti-c-fos primária (Calbiochem, 1:5000) e A568-conjugados de anticorpos anti-coelho secundário (Invitrogen, 1:1000). Barra de escala, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. 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Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ferramentas Optogenetic aumentaram recentemente o nosso controle sobre as populações neuronal seletiva, incluindo os neurônios adultos nascidos no sistema olfativo. Aqui nós descrevemos como executar uma injeção estereotáxica de um vetor lentiviral expressar ChR2-YFP em uma população específica de adultos-nascido neurônios. Através da monitorização cuidadosa do período pós-injeção, somos capazes de analisar e manipular a atividade de uma coorte de adultos-nascido neurônios com uma idade relativa homog...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipeta Puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Capilares de vidro (3,5 &quot;) </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II microinjetor </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Broca cirúrgica de alta velocidade </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Broca Aço Micro Burrs diâmetro da ponta 0,7 milímetros </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED azul CMS 4,6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Conector elétrico do sexo feminino (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Controlador de corrente para LED (máx: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Gerador de pulso </td><td> Ampi </td><td> Mestre-8 </td></tr><tr><td> Medidor de potência óptica </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cianoacrilato </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Cimento policarboxilato (primeira camada de cimento) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Cimento de metacrilato (cimento segunda camada) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - Liquid (# 339292) Unifast Trad - Pó (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofeno </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Interneurônios locais são continuamente regeneradas no bulbo olfativo dos roedores adultos 1-3. Neste processo, chamado de neurogênese adulta, células-tronco neurais nas paredes do ventrículo lateral dão origem a neuroblastos que migram para vários milímetros ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para alcançar e incorporar no bulbo olfatório. Para estudar as diferentes etapas e do impacto da educação de adultos-nascido integração neurônio em circuitos pré-existentes olfativa, é necessário para, seletivamente, rotular e manipular a atividade dessa população específica de neurônios. O desenvolvimento recente de tecnologias optogenetic oferece a oportunidade de usar a luz para ativar precisamente esta coorte específicos de neurônios, sem afetar os neurônios em torno de 4,5. Aqui, apresentamos uma série de procedimentos para virally expressar Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP em uma coorte temporalmente restrito de neuroblastos na RMS antes de chegar ao bulbo olfativo e tornar-se adulto-nascido neurons. Além disso, mostramos como implantar e calibrar uma miniatura LED para doenças crônicas na estimulação in vivo de ChR2-expressando neurônios.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K visualizações.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Neurociência

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...