Fabricação de silicone Molde Mestre Litografia Materiais: <ul><li> 75 milímetros wafers de silício </li><li> SU-8 2 Photoresist Negative (Microchem, Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> Desidratar wafer Si a 120 ° C por 2 horas. </li><li> Superfície tratar UV do ozônio para a 7 minutos para remover compostos orgânicos. </li><li> N2 superfície golpe para remover partículas. </li><li> Aplicar SU-8 2 para cobrir 70% da superfície (~ 10 ml por 75 wafer mm). </li><li> Giram a 2000 rpm por 20 segundos com 300 rpm a aceleração / s. </li><li> Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Softbake o fotorresiste durante 15 minutos a 95 ° C. </li><li> Flood expor wafer de 20-25 mJ/cm2 dose em 365 nm (I-line) para formar a camada inferior. </li><li> Aplicar SU-8 2 para a camada de fotorresiste segundo. </li><li> Giram a 550 rpm por 20 segundos com 300 rpm a aceleração / s para um filme de espessura de aproximadamente 11 mM. </li><li> Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 65 ° C. </li><li> Softbake a hóstia a 65 ° C por 5 minutos. </li><li> Rampa a placa de aquecimento de 65 ° C a 95 ° C. </li><li> Softbake a bolacha durante 55 minutos a 95 ° C. </li><li> Wafer arrefecer à temperatura ambiente por 20 minutos. </li><li> Alinhe a máscara mPAD em wafer e expor para 95-100 mJ/cm2 dose em 365 nm (I-line). </li><li> Coloque o wafer numa placa de aquecimento e rampa de temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Pós-exposição assar o fotorresiste durante 25 minutos a 95 ° C. </li></ol> Desenvolver Materiais: <ul><li> 100 milímetros pratos de vidro (5) </li><li> Propilenoglicol acetato de éter metílico (PGMEA) </li><li> Isopropanol (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> Em um capuz químico, preencher cinco pratos com PGMEA (2), IPA, e hexano (2). </li><li> Segure wafer em 1 PGMEA por 10 segundos </li><li> Agitar wafer por 50 segundos </li><li> Transferência de wafer para PGMEA 2 com menisco de PGMEA. </li><li> Agitar durante 5 segundos. </li><li> Transferência de wafer de IPA com menisco de PGMEA. </li><li> Agitar por 20 segundos. </li><li> Transferência de wafer de 1 IPA. </li><li> Agitar durante 5 segundos. </li><li> Transferência de wafer para IPA 2. </li><li> Agitar durante 5 segundos. </li><li> Remover rapidamente wafer de IPA segundo com menisco do IPA e seque com N2 </li><li> Inspecionar padrão. </li><li> Wafer Hardbake a 120 ° C por 14-20 horas para cross-link SU-8. </li><li> Dados da bolacha com um cortador de diamante </li><li> Monte o wafer sobre uma lâmina de vidro com epóxi </li><li> Fluorosilanize do wafer (ver instruções na moldagem de replicação) </li></ol> Moldagem de replicação de mPADS Molde negativo Materiais: <ul><li> Descartáveis ​​de alumínio pesando barco </li><li> Polidimetilsiloxano base (PDMS) e agente de cura (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano </li><li> Lâmina de vidro </li><li> Pasteur Pipeta de vidro </li></ul> Método: <ol><li> Mix PDMS 10:01 em peso e em degas sob vácuo por 1 hora para remover as bolhas. </li><li> Coloque o molde mestre de silício em barco de alumínio. </li><li> Despeje 50-60 g de PDMS mais de mestre molde em barco de alumínio. </li><li> Degas, sob vácuo, durante 30 minutos para remover as bolhas. </li><li> Sopre bolhas de ar presas na superfície do PDMS com explosão rápida de N2. </li><li> Barco lugar em forno de convecção a 110 ° C por 15 minutos até PDMS é firme. </li><li> Cortar barco de alumínio. </li><li> Com lâmina de barbear, aparar silicone PDMS debaixo mestre. </li><li> Peel PDMS longe do mestre de silício lentamente e com movimento constante em uma direção para evitar a destruição do mestre. </li><li> Inspecionar mestre de silício para danos. </li><li> Cortar o molde negativo em 4 pedaços. </li><li> Repita os passos 1-10 para um lote grande de moldes negativos. </li><li> Plasma de oxigênio tratar molde negativo para 1,5 minutos para ativar superfície, ou </li><li> Ozônio tratar molde negativo por 10 minutos para ativar a superfície. </li><li> Lugar moldes negativos em exsicador com características mPAD expostos. </li><li> Spread 250-500 mL de silano sobre lâmina de vidro no centro da exsicador </li><li> Lugar pipeta de vidro com pastagens 150-200 mL de silano na ponta dentro exsicador. </li><li> Câmara de vácuo para evaporar silano e casaco moldes negativo para&gt; 14 horas. </li></ol> mPADS Materiais: <ul><li> Polidimetilsiloxano base (PDMS) e agente de cura (Dow, Midland, MI) </li><li> Boca larga descartáveis ​​pipetas de transferência </li><li> 2 &quot;x 3&quot; slides de vidro </li><li> Scribe vidro </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> Mix PDMS 10:01 em peso e em degas sob vácuo por 1 hora para remover as bolhas. </li><li> rendas silanizadas moldes negativos em &#39;cruz&#39; </li><li> Pipeta PDMS em moldes negativos de modo que as características são totalmente cobertos com uma espessura de 1 mm. </li><li> Aguarde 30 minutos para as bolhas de ar no PDMS para subir à superfície. &lt;/ Li&gt; <li> Em 30 &#39;tempo de inatividade, poeira 22x22mm (No. 2) lamínulas de vidro com uma corrente de N2. </li><li> Oxigênio plasma lâminas de vidro tratar metades de 1,5 minutos para limpar e ativar vidro </li><li> Sopre bolhas de ar presas na superfície do PDMS com explosão rápida de N2. </li><li> Cuidadosamente, coloque borda de vidro lamela em PDMS com plasma lado limpo de frente para o PDMS. Lentamente abaixe a lâmina de vidro para que o PDMS contatos totalmente a superfície do vidro inteiro e evitar bolhas de ar ficar preso debaixo da lâmina de vidro. </li><li> Lugar montados moldes em forno de convecção a 110 ° C por 20 horas para curar completamente. </li><li> Remover moldes do forno e deixe esfriar para RT. </li><li> Segure lâmina de vidro com uma mão em cima e lentamente casca negativos longe o molde negativo da parte inferior para liberar o mPAD. </li><li> Inspecionar o mPAD sob um microscópio para posts em colapso. </li><li> Re-silanizadas molde através de plasma e de silano a cada quatro peças fundidas. A vida útil do molde negativo para replicação boa é de aproximadamente 60-20 casts. </li></ol> Células semeadura em mPADS Estampagem Materiais: <ul><li> PDMS selos para UCP (ver Tien, J &amp; Chen, CS, em Métodos de Engenharia de Tecidos, 2001, pp 113-120). </li><li> Etanol (100% e 70%) </li><li> Água deionizada esterilizada </li><li> 50 ug / ml fibronectina Humanos em água deionizada estéril (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml Solução DII filtrada com membrana de 0,2 mM (D-3886, Molecular Probes, OR) </li><li> 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, NJ) </li><li> 1X solução tampão fosfato. </li><li> 100 mm x 25 milímetros placa de Petri (4) </li><li> 150 milímetros x 25 mm placa de Petri (2) </li><li> Folha de alumínio </li><li> N2 </li><li> Pinça </li><li> Capa estéril </li></ul> Método: <ol><li> Apare o excesso de PDMS mPADs </li><li> Se o carimbo de PDMS tem sido utilizado anteriormente, sonicate selos em etanol 100% por 5 minutos para esfregar proteínas contaminantes. </li><li> Na capa estéril, segure selos em seus lados, com uma pinça e seco com N2 após imersão selos em etanol 100% frescos e água estéril </li><li> Lugar em 150 mm com placa de Petri trabalhando lado para cima. </li><li> Alíquota gotas de solução de fibronectina em cada selo. Comece com os cantos em cada um dos selos, em seguida, as bordas e, finalmente, as regiões do interior. Inicialmente a superfície do PDMS do selo é hidrofóbico, mas torna-se hidrofílico como a proteína é adsorvida. De trabalho &quot;fora para dentro&quot; muda o ângulo de contato do PDMS para que um menor volume de solução de fibronectina é necessário para cobrir a marca totalmente. </li><li> Deixe descansar por 1 hora na capa para adsorção de proteínas. </li><li> Lavar com água DI selos derramando no prato e deixar o nível da água aumentar ao longo dos selos. </li><li> Lavar selos em 100 milímetros placa de Petri com água DI. </li><li> Retire e seque com N2. </li><li> MPADS tratar de ozônio por 7 minutos para ativar a superfície de estampagem. </li><li> Sob o capô, carimbo mPADS colocando borda selo sobre mPAD e delicadamente abaixar para fazer contato. Toque levemente a parte superior do selo, com uma pinça para garantir todas as áreas têm um bom contato, mas tenha cuidado para não recolher a mensagens. </li><li> Remova cuidadosamente os selos com uma pinça. </li><li> MPADS submergir em 100 mm com placa de Petri de etanol 100% para ~ 15 segundos. Mantenha microagulhas de retração durante a transferência, transferindo rapidamente entre pratos. </li><li> MPADS submergir em 100 milímetros prato de Petri com álcool 70% para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir na segunda placa de Petri com 100 milímetros de água DI para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com água DI. </li><li> MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com 100 mL de solução de DII. </li><li> Cubra com papel alumínio e deixe de molho por uma hora. </li><li> MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir em 150 milímetros placa de Petri com 10 mL de Pluronics 2% e 90 mL de PBS para a concentração total de Pluronics 0,2%. </li><li> Cubra e deixe de molho por uma hora. </li><li> MPADS submergir em 100 milímetros petri prato com água DI para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir na segunda placa de Petri com 100 milímetros de água DI para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS submergir na terceira placa de petri 100 mm com PBS para ~ 15 segundos. </li></ol> Semeadura Materiais: <ul><li> Linha celular escolhido </li><li> Tripsina-EDTA (0,25% de tripsina com EDTA • 4NA, Cat Gibco. No. 25200-056) </li><li> Meio de Crescimento </li><li> 1X solução tampão fosfato. </li></ul> Método: <ol><li> Na capa estéril, mPADS lugar em 100 milímetros petri prato e preencha com 17 ml de meio. </li><li> Prato de Petri lugar na incubadora para aquecer a 37 ° C </li><li> Suspender as células através de tripsina </li><li> Aspirar várias vezes para quebrar agregados de células. </li><li> Pipeta suspensão celular para a placa de Petri com o mPADS. Adicionar tais células eles permanecerão células isoladas (sem contatos célula-célula) no momento da análise. A quantidade exata de células para adicionar é tipo celular específico edepende da área de células se espalhar e taxa de crescimento. </li><li> Suavemente dispersar células em placa de petri com pippetting lento. </li><li> Lugar na incubadora por 2 horas para permitir que as células se estabelecer e aderir em microagulhas. </li><li> Inspecionar mPADS para ver se as células se espalharam. As células vão olhar achatada e extensão de seis ou mais mensagens. </li><li> Se as células se espalham, a transferência para novas mPADS 100 milímetros placa de Petri com 21 mL de meio fresco. </li><li> O mPADS estão prontos para a experiência. </li></ol> Coloração e montagem mPADS Fixação Materiais: <ul><li> Água deionizada </li><li> Paraformeldahyde frasco (16%) </li><li> Solução Tampão Fosfato 10X. </li><li> 1X solução tampão fosfato. </li></ul> Método: <ol><li> Em um tubo de centrífuga 50 mL, adicionar 30 mL de DI, 10 mL de paraformeldahyde (frasco inteiro), e 4,5 mL de PBS 10X para a solução de fixação. </li><li> Adicionar ~ 25 mL de solução fixadora para um prato de 100 milímetros de petri. </li><li> Delicadamente mergulhe mPAD com células para fixação prato e deixe incubar por 20 minutos. </li><li> MPADS submergir em 100 mm com prato 1X PBS três vezes. </li><li> Pronto para imunocoloração e montagem. </li></ol> Analisando Forças Celular em mPADS Imagem confocal Materiais: <ul><li> Microscópio confocal </li><li> Objetivo 63X </li><li> Cubos de filtros de anticorpos secundários </li><li> Filtro verde cubo (rodamina) para DII imagem de microagulhas. </li></ul> Método: <ol><li> MPADs lugar no palco e encontrar uma única célula com 300 ms de exposição, não binning. </li><li> Tops imagem de microagulhas para IMAGEM TOP. </li><li> Usando z-controle de leitura, captura de imagem de microagulhas para a imagem de fundo. </li><li> Qualquer imagem de outros canais que você tem manchas na (Hoechst, phalloidin etc) </li></ol> Análise de Imagem Materiais: <ul><li> MATLAB com Image Processing Toolbox </li></ul> Método: <ol><li> Girar e registrar imagens superiores e inferiores </li><li> Centróides medida de fundo (undeflected) e superior (desviado) posições </li><li> Calcular o deslocamento </li><li> Usando a constante da mola para os cargos (conhecido, depende da geometria post), calcular vetor de força em cada posto </li><li> Análise de erros é baseada na capacidade de resolver as forças, e depende da resolução de imagem e resolução de detecção de centróide </li><li> Organizar os dados de acordo com suas necessidades personalizadas - por exemplo, magnitudes, força e / ou direção, como um curso de tempo, muitas medidas em condições diferentes, etc </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

Neste vídeo, vamos apresentar nossa abordagem para medir forças de tração celular usando uma matriz microfabricated de posts. Forças de tração são geradas através de miosina-actina interações e desempenhar um papel importante em nossa fisiologia. Durante o desenvolvimento, elas permitem que as células a se deslocar de um local para outro a fim de formar as estruturas iniciais do tecido. Forças de tração ajudam nos processos de cura. Elas são necessárias para o fechamento adequado das feridas ou a migração de leucócitos e rastejando através do nosso corpo. Essas mesmas forças podem ser prejudiciais à nossa saúde no caso de metástase de câncer ou o crescimento vascular para um tumor. O método mais comum pelo qual o estudo de células in vitro tem sido a de usar um prato de vidro ou poliestireno. No entanto, a rigidez dos substratos torna impossível fisicamente medir forças de tração de células, e há relativamente poucos métodos para estudar as forças de tração. Nosso laboratório desenvolveu uma técnica para superar essas limitações. O método é baseado em um conjunto vertical de cantilevers flexível, a rigidez ea escala de tamanho das quais são tais que células individuais, distribuídos por cantilevers muitos e desviá-los no processo. Os pilares que usamos são 3 mm de diâmetro, 10 mM de altura, e são configurados em uma matriz regular com 9 mM espaçamento de centro a centro. Mas essas dimensões físicas podem ser facilmente variados para acomodar uma variedade de estudos. Começamos com um mestre de silício, mas as mensagens finais são feitas de borracha de silicone chamado poli (dimetil siloxano), ou PDMS. Podemos medir as deflexões sob um microscópio e calcular a magnitude ea direção das forças de tração necessária para produzir as deflexões observadas. Chamamos esses substratos microfabricated pós-array-detectores, ou mPADs. Aqui, vamos mostrar como podemos fabricar e usar o mPADs para avaliar modulações da contratilidade celular.

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Neste vídeo, demonstramos como fabricar e utilizar detectores microfabricated array post (mPADs) para avaliar as modulações da contratilidade celular.

Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Universidad San Sebastian

Research

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Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K visualizações.  University of Pennsylvania. Neste vídeo, demonstramos como fabricar e utilizar detectores microfabricated array post (mPADs) para avaliar as modulações da contratilidade celular.

Vídeo: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...