This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. As células de cultura em micropost matrizes Nota: Todas as etapas devem ser executadas em um gabinete de biossegurança para garantir a esterilidade. Os volumes dadas aqui são para T25 frascos de cultura celular. A cultura de células meio de receita e semeadura de células densidade são otimizados para linhas celulares de cancro do osso HuO9 e M132. <ol><li> Preparar uma cultura de células para a semeadura em uma matriz micropost. <ol><li> Inspeccionar a qualidade de cultura de células, colocando o frasco de cultura sobre um microscópio de luz padrão. Certifique-se de que as células mostram um crescimento e morfologia típicas por estimar quanto do fundo garrafa de cultura é coberto. Uma cobertura de 70% -80% reflecte uma taxa de crescimento saudável. Preste atenção à quantidade de células flutuante uma vez que representam as células mortas e / ou uma cultura mato. </li><li> Tripsinizar as células e por remover o meio de lavagem com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x tampão (PBS). Adicionar 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar a temperatura ambiente até que a células desalojar, que leva cerca de 2-4 min. Verificar o processo com o microscópio e ocasionalmente bater suavemente o frasco para suportar o desalojamento. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para parar a reacção e para lavar as células residuais que ainda se sente na parte inferior do frasco. Em seguida, pipetar esta suspensão cima e para baixo várias vezes, para obter uma mistura homogénea. Certifique-se de pipeta todas as soluções em toda a área de crescimento original do frasco para ganhar uma desalojar eficaz. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar-lo usando uma centrífuga de bancada a 0,5 xg durante 3 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes. Certifique-se evitar a criação de bolhas ao fazê-lo. </li><li> Determinar a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de células e um microsco luzpe. Verifique a suspensão de células na câmara de contagem celular para agregados de células e assegurar a ter apenas as células individuais para a experiência subsequente. Pipeta novamente para cima e para baixo várias vezes se as células tendem a formar agregados para separá-los. </li><li> Dilui-se a suspensão de células com meio suficiente para obter uma solução de células de 25.000 células / ml. Misture bem invertendo o tubo fechado várias vezes. </li></ol></li><li> Prepare uma matriz micropost para semeadura de células. Nota Crítica: Não pipete para a matriz micropost diretamente, pois isso poderia prejudicar os microposts, especialmente quando as bolhas indesejados são introduzidos. Além disso, certifique-se que a matriz micropost não resseca como ocorrendo forças capilares levar a colapso dos microposts. <ol><li> Colocar o substrato de vidro com a matriz micropost viradas para cima em um poço de uma placa de 12 poços, utilizando um par de pinças e molhá-lo por adição de 1 ml de etanol (99%). Incubar à temperatura ambiente durante 20-30 seg. </li><li> Dilui-se o etanolpasso a passo através da adição de cerca de 1 ml estéril água desionizada (água Dl) do lado da aspiração e bem cerca de 1 ml, utilizando uma pipeta de transferência ou o dispositivo de aspiração. Repetir esta etapa, pelo menos, 3 vezes. </li><li> Substituir o-água Dl com tampão PBS, do mesmo modo por adição de aspiração e aproximadamente 1 ml. Repita este passo 3 vezes. </li><li> Substituir o-tampão de PBS com meio por aspiração e a adição de aproximadamente 1 ml de meio. Repita este passo 3 vezes. </li></ol></li><li> Pipete 1 mL de solução de células (25.000 células) na parte superior de cada matriz micropost preparado. Fechar placa multi-poços e transferi-lo para uma incubadora (CO2 5%, 37 ° C). Deixe as células aderir e crescer em cima de microposts para 6 -7 horas. </li><li> Inspecione o processo de adesão, ocasionalmente usando uma luz de um microscópio. Verifique se a maioria das células estão distribuídas em vários microposts. </li></ol> 2. Fixação e coloração de células Nota: Todos os passos evolumes dadas aqui são para um único poço de uma placa de 12 poços. Recomenda-se a processar não mais do que quatro dos doze poços de cada vez para evitar a secagem dos poços após a aspiração de qualquer líquido, o que resultará num colapso das microposts. <ol><li> Aspirar o meio do poço e lavar as células 2x com 1 ml de tampão PBS. Certifique-se a aplicar uma força suave durante a lavagem com PBS para remover os restos celulares que se acumulou na matriz micropost durante a incubação e de separar as células mortas. </li><li> Fixar as células com uma solução de formaldeído tamponada a 0,5 ml de 3,7% durante 5 min. </li><li> Substitua a solução de formaldeído por lavagem das 2x matriz micropost com 1 ml de água DI estéril. </li><li> Corar as células com corante (de 0,05% Azul Brilhante de Coomassie em 50% de água, etanol a 40% e ácido acético a 10%) durante cerca de 90 seg. Lavar o excesso de solução de coloração off 2x com 1 ml de água DI estéril. Adicionar 1 ml de água DI para micropost matriz. </li><li> Verifique resultado coloração utilizando um microscópio de luz. Repita tele coloração passo, se o corpo da célula for muito fraca para ser visualizado. </li><li> Matrizes micropost loja com as células marcadas na parte superior em uma geladeira a 4 ° C. Certifique-se de mantê-los sob a água em todos os momentos. </li></ol> Imagem 3. celular Nota: Passo 4 só se aplica aos microscópios sem infinidade corrigido óptica. <ol><li> Adicionar 2 ml DI-água para uma placa de Petri com um fundo de vidro fino em alta resolução de imagem. </li><li> Transferir matriz micropost usando um par de pinças para o prato de imagens com as microposts voltado para cima. </li><li> Coloque a imagiologia de Petri sobre uma fase móvel de um microscópio de luz. </li><li> Rodar o anel de compensação da lente utilizada para geração de imagens até que o número na escala representa a espessura total de todos os materiais ao longo do percurso óptico para compensar o desfasamento em índices de refracção do substrato de vidro, o elastómero de silicone e o líquido em cima. Isso deve levar a uma aparência brilhante dos micropostsnúcleos. </li><li> Fechar o diafragma do lado da iluminação até 50% e remover quaisquer anéis de contraste de fase a partir do caminho óptico de comutação para um modo de campo brilhante comum. </li><li> Alinhe a matriz micropost que os microposts formar uma linha horizontal através do campo de observação. Definir um ponto de partida (por exemplo, superior esquerdo) e mova a placa de Petri gradual em toda a fase de varredura da matriz micropost enquanto tomar várias imagens. </li><li> Tire todas as imagens com a configuração de resolução mais alta para a câmera usando uma objetiva de 20X ou 40X. Destinam-se a ter uma única célula no centro da imagem. </li><li> Varrer ao longo do eixo Z através do substrato até que as pontas micropost estão no foco. Use a roda de foco fino ajuste do microscópio e transformá-lo no sentido de centrando-se na parte inferior micropost para cerca de 2-3 mm. </li><li> Estabelecer um procedimento de imagem padrão, tomando série de imagens de teste de uma seção matriz varrendo os parâmetros de imagem uma de cada vez (por exemplo, tempo de exposição,configuração de íris, as configurações de lâmpadas etc.). Analisar imagens com MechProfiler e determinar um conjunto de parâmetros adequados para uma análise rápida e confiável. </li></ol> 4. Análise de Imagem com Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Nota: Todas as funções do software pode ser ativado com um dispositivo apontador com o botão esquerdo do mouse. No entanto, um operador treinado irá utilizar as teclas de atalho documentados projetado para ser na metade esquerda do teclado para permitir um processamento de imagem de duas mãos eficiente. <ol><li> Comece análise de imagem software MechProfiler e abrir uma série de imagens que precisam ser analisados, clicando em &quot;Abrir&quot;. </li><li> Introduza todos os parâmetros para a seção &quot;Configurações&quot; dada pelo desenvolvedor de software. Determinar os parâmetros que devem ser personalizada configurada (isto é, limite de contorno e à distância mínima) de acordo com os procedimentos descritos em detalhe no manual de software. </li><li> Analisar imagems um-por-um, cortando-os para a área de interesse, usando &quot;Cortar&quot; (clique e arraste com o botão do mouse pressionado). Clique duas vezes dentro do retângulo desenhado para concluir esta ação. </li><li> Marcação cada contorno celular visível um por um, clicando em &quot;desenhar os contornos de células&quot; e use o cursor de cruz para o desenho, incluindo todos os microposts a célula está ligado a. </li><li> Descarte qualquer microposts indesejados, clicando em &quot;desfazer Mensagens&quot; e usar o cursor de cruz para desenhar. Coloque todos os microposts que pertencem a uma célula do lado de fora da secção de imagem ou que são desviados por qualquer outro motivo, mas não pela célula de interesse. </li><li> Comece a sub-rotina software &quot;Encontre Centróides&quot; pelo clique do mouse. Ajuste a definição direita ao lado do botão &quot;Find Centróides&quot; até que todos os microposts são registradas, o que é visível por uma cruz vermelha em seu centro de filtro. Se a definição de filtro é muito baixa microposts irá ser ignorado, se ele for muito elevado de muposições ltiple será marcada para uma única micropost. Mantenha o filtro definição constante durante uma sessão de análise. </li><li> Use a função de edição manual &quot;Editar Manual&quot; para centroids com múltiplas posições perdidas ou micropost. Use o cabelo do mouse cruz para seleccionar a micropost em questão clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo e coloque o marcador vermelho ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente. Descarte um tal micropost se ele está fora do contorno celular desenhado (ver passo 4.5) antes de prosseguir. </li><li> Encontre a grade micropost ideal ativando a função &quot;Gerar Grid&quot; com um clique do mouse. Garantir a posição corresponde com a cabeça micropost verdade, mostrado por um anel azul, dentro do contorno celular desenhado. </li><li> Corrija qualquer fabricante grade deslocada dentro da área da célula onde for necessário utilizar a função &quot;Manuel Editar&quot; correspondente com um clique do mouse. Use a mira para selecionar o micropost em question clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo que aparece e coloque o marcador azul ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente. </li><li> Use o botão &quot;Calcular&quot; deflexões pelo clique do mouse para obter um histograma dos valores de deflexão calculados com base na diferença entre a posição de um micropost dentro da seção de imagem e da grelha ideal gerado. </li><li> Salve a análise completa, incluindo as tabelas de valores por um clique do mouse em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Continuar a análise de imagem clicando em &quot;Reset View&quot; e analisar outra seção imagem ou clique do mouse em &quot;Next Imagem&quot;, que convenientemente pode ser feito usando a tecla cursor do teclado direito. </li></ol> 5. Análise de Dados - Mechanoprofiling <ol><li> Abra o arquivo &quot;Results.xls&quot; com um programa de escritório planilha da pasta com as imagens analisadas. Ele contém os dados com all valores calculados, incluindo todos os desvios micropost e medidas de derivados convencionais, tais como o trabalho (isto é, a energia de deformação do substrato) pela célula analisado. </li></ol>

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</ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Este trabalho visa avançar no campo da microscopia de força de tração, diminuindo substancialmente os obstáculos técnicos e práticos à entrada. Estas barreiras vêm de dois lados. Primeiro e mais importante são os inúmeros desafios técnicos não triviais que devem ser superados para a fabricação reprodutível e comissionar uma matriz micropost experimentalmente. Em segundo lugar, é a necessidade de forma semelhante não trivial para uma análise semi-automatizado de confiança de forças de células única...

Ensaios baseados em células sensíveis de Mecano-permitir que células aderentes para investigar, com uma ampla gama de aplicações, que reflectem o papel central que a mecânica pode desempenhar na biologia celular. Estas aplicações costumam se concentrar sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam processos subcelulares ou comportamento de células inteiras. Por um lado, os factores ambientais externos tais como a composição da matriz extracelular ou a rigidez da matriz pode afectar dramaticamente a resposta mecânica e biológica de uma célula. 1 O mesmo pode ser observada após a utilização de diversas classes de compostos farmaceuticamente activos, os efeitos dos quais são muitas vezes caracterizados utilizando modelos de cultura de células. 2 sobre as outras propriedades genotípicas de mão, tais como aquelas causadas por mutações genéticas espontâneas ou induzidas experimentalmente, pode induzir alterações acentuadas no fenótipo da célula que estão associadas a alterações na estrutura e na função do citoesqueleto. 3 Estes exemplos têm apenas algumas das muitas possíveistópicos para os quais fenotipagem mecânica de células é relevante, e todos eles foram útil investigado com matrizes micropost. No momento da redação deste artigo, aproximadamente 200 artigos foram publicados descrevendo a interação célula-micropost. Estas obras discutir aspectos teóricos da micropost princípios de deflexão bem como instruções práticas sobre o seu fabrico. O primeiro artigo descrevendo a interação das células e matrizes micropost flexíveis foi publicada por Tan e seus colegas em 2003. 4 Em contraste com a microscopia de força de tração clássica (TFM), onde os substratos macios contínuas são usadas para estimar a contratilidade de células nanonewton escala, Tan et al. descrito um método utilizando múltiplos feixes verticais espaçados feitas de elastómero de silicone. As principais vantagens desta técnica emergem duas características principais. Em primeiro lugar, a fim de alterar a rigidez célula-substrato resulta uma só precisa de mudar as dimensões, mantendo micropostcaso contrário, a composição do substrato constante e evitando-se assim diferenças de topologia de superfície e química. Segundo microposts atuar como molas individuais que podem ser analisados ​​de forma discreta com força e resolução espacial da ordem de adesões focais individuais e pode reduzir os desafios analíticos que são inerentes à análise análoga por padrão TFM. Hoje, a gama de aplicações para matrizes micropost excede em muito apenas o mapeamento de forças por algumas células individuais. Por exemplo, Akiyama relata o uso de um tecido isolado a partir de um vaso dorsal lagarta da traça como um actuador para uma matriz micropost, a fim de desenvolver uma potência muscular autónoma micro-robô inseto. 5 No entanto, a maioria das aplicações publicadas de microposts concentraram-se em estudos de condições médicas, como infecção ou câncer. Por exemplo, matrizes micropost têm sido utilizados para estudar a geração de forças de empacotado pili de tipo IV de Neisseria gonorrhcolónias OEA que está associado com cascatas de sinalização reforço infecção. 6 Outros usaram microposts para estudar as células de câncer de mama tratados com compostos farmacêuticos visando o citoesqueleto. 7 Deflexão de um micropost é muitas vezes descrita usando a teoria clássica do feixe para um cantilever com uma carga final assumindo que a célula atribui apenas à ponta da micropost. Aqui, a força F aplicada que provoca uma deflexão δ depende do micropost &quot;rigidez de flexão&quot; e K é calculado por: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) com E, I, e L sendo o módulo de Young, a área de momento de inércia e do feixe de comprimento, respectivamente. No entanto, os resultados de esta equação só dar uma aproximação geral das forças no trabalho desde feixe de corte e dobra, bem como a deformação de substrato não são levados em accontagem. Considerando que microposts são normalmente feitos de material macio, como polidimetilsiloxano (PDMS) à base de borracha de silicone esses fatores precisam ser incluídos. . Schoen et ai demonstraram a existência de um tal factor de correcção com base na relação do micropost (L / D) e do polímero correspondente coeficiente de Poisson v aspecto 8 É dada a.: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Com o t inclinação (v) ser um coeficiente de inclinação que inclui um parâmetro de ajuste = 1,3 como pode ser encontrado no mesmo artigo: <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Isso significa que a rigidez corrigido de um micropost corr k é o produto da rigidez à flexão pura = k k curvatura e o factor de correcção corrdado por: <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Portanto, os cálculos de força da célula deve ser realizada utilizando a variação mais refinada da equação (1) lendo agora: <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) O impacto da correcção torna-se mais evidente, logo que os valores típicos para dimensões micropost são utilizados. Por exemplo, a 15 mícron de comprimento micropost com uma secção transversal circular e um diâmetro de 5 mm feito de borracha de silicone à base de PDMS leva a um factor de correcção de 0,77 e, por conseguinte, um cálculo não corrigido superestimariam as forças exercidas pelas células 23%. Isso se torna ainda mais grave para microposts com proporções menores. Tradicionalmente, micropost análise de imagem também tem sido baseada na teoria de flexão feixe idealizada. Em 2005, o grupo que foi pioneira no uso de micrmatrizes OPOST publicou um software de análise de imagem adequada para a análise micropost 9 O software exige uma licença de software eo usuário deve tomar três imagens para cada posição.; cada um dos planos superiores e inferiores do micropost em modo de transmissão e outro em modo de fluorescência com a célula corada. Depois de comparar as posições superior e inferior para cada micropost o software determina um campo de força do vetor e calcula os parâmetros relacionados como força por post. Existem outros pacotes de software e os seus princípios de análise são brevemente mencionadas nos artigos correspondentes que os descrevem, mas estes pacotes de software de análise geralmente não estão disponíveis publicamente. 10,11 As matrizes micropost concebidos para forças de células de mapeamento pode ser classificada como sendo uma disposição em micropost ortogonal ou um sextavado, o último dos quais têm a vantagem de todas as aberturas equidistantes entre microposts vizinho. Microposts típicos have uma secção transversal circular e as suas dimensões variam de 1,0 um a 10 um de diâmetro e 2 a 50 um de comprimento. 4 Contudo, microposts com secção transversal elíptica ou quadrado também têm sido relatados. 12,13 O uso de misturas à base de silicone PDMS como material de micropost permite a adição de nanopartículas na mistura. Por exemplo a adição de cobalto nano-hastes permite uma ativação magnética do micropost e, assim, dá um outro grau de liberdade para potenciais projetos experimentais. 14 A maioria dos grupos produzir suas matrizes micropost em substratos rígidos planas como tampa de vidro ou dentro de uma placa de Petri. No entanto, Mann e colaboradores relataram recentemente uma matriz micropost formada sobre uma membrana elástica. 15 Esta permite a aplicação de células alongamento forças para células aderentes ao estudar ao vivo de células subcelular respostas dinâmicas em termos de contratilidade celular. O estab e mais amplamente empregadocido processo para fazer matrizes micropost é baseado em litografia macia, tal como descrito nos protocolos de perspicaz Sniadecki e colegas. 16-18 em processos de salas brancas curtas normalizados são utilizados para gerar as microstruturas no topo de uma pastilha de silício utilizando fotorresistente SU8. Isto é seguido por um processo de cópia, em que a borracha de silicone é lançada sobre as estruturas transferindo-se em moldes. Num segundo passo, estes moldes são utilizados para replicar a microestrutura inicial utilizando borracha de silicone sobre um substrato escolhido. No entanto, apesar da grande e crescente número de publicações relacionadas com a sua aplicação, estabelecendo um processo de fabricação para microposts leva tempo considerável, mesmo para especialistas micro-engenharia; há muitas etapas do processo que exigem otimização e adaptação ao ambiente de laboratório específico e layout micropost para se obter um nível de qualidade aceitável. Micropost matrizes comerciais estão agora disponíveis em um pronto-to-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) formato com uma qualidade consistentemente alta. Como tal, são uma alternativa ao processo de fabrico complexo e moroso necessário para a produção no local. Neste trabalho uma matriz micropost comercialmente disponível foi utilizado para o mapeamento forças celulares usando uma imagem de microscopia de campo brilhante único. Mais importante este artigo descreve e documenta um software open-source totalmente funcional chamado MechProfiler, que está disponível para download como material suplementar a este manuscrito. Uma versão mantida activamente do software podem também ser encontradas em http://www.orthobiomech.ethz.ch. A combinação de um ensaio de &quot;off-the-shelf&quot; e um software de análise de código aberto compatível reduz significativamente a barreira de entrada para alcançar experimentos precisos TFM. Os pesquisadores não têm acesso a qualquer instalações de sala limpa ou experiência em desenvolvimento de software pode analisar forças celulares com sucesso. Ele permite que um usuário para se concentrar nas mechanosensitivity saída ensaio ao invés de a tecnologia em si, e faz medições de força de tração disponíveis a uma comunidade mais ampla. Além disso, este é um passo importante para preparar o caminho para triagem automática de matrizes micropost. O software de análise de MechProfiler processa imagens no formato de arquivo TIFF, PNG, BMP e JPG. As imagens podem ser tomadas através de fluorescência, contraste de fase, luz ou microscopia de campo brilhante. O programa autônomo é executado em conjunto com o livre Matlab Compiler Runtime (disponível em: Figura 12) e algoritmos subjacentes permitir o processamento de imagem simplificada, que permite ao usuário processar imagens com células únicas ou múltiplas em cerca de 1 min. Além disso, estas células podem ou ser vivo ou &quot;Fixo&quot;. O software MechProfiler é capaz de aumentar significativamente a análise dos dados de transferência por depender de reprodutibilidade das matrizes qualidade micropost comercial, mais especificamente, o padrão &amp; #8220; não desvia &quot;posição de cada post na matriz pode ser presumido contra uma grade ideal (desvios de fabrico para a grade nas matrizes utilizadas para este estudo foram inferiores a 100 nm). Num curto abre uma selecção de ficheiros de imagem para análise, as culturas-los para a região de interesse, define as mensagens abrangidos pelas células ou que necessita de ser descartado, determina as posições de pós, calcula as deflexões / forças contra a grade ideal, e finalmente salva todos os dados específicos de celulares com a possibilidade de exportação, incluindo a uma planilha de escritório padrão.

<table><tbody><tr><td>T25 cell culture flasks</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge vials</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Micropost dimensions: &amp;Oslash;=6.4&amp;#160;&amp;micro;m, l=18.2 &amp;micro;m; grid=13 &amp;micro;m, k&lt;sub&gt;corr&lt;/sub&gt;=2.87&amp;#160;nN/&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Ethanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Coomassie blue</td></tr><tr><td>Methanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm diameter, aperture 22&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Inverted microscope</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Camera controler</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Camera</td></tr></tbody></table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

A principal vantagem da técnica descrita reside na sua simplicidade e potencial para integração rápida e eficaz para o trabalho de laboratório de rotina. A combinação de alta qualidade conjuntos de sensores comerciais combinados com software de código aberto fornece informações sobre mecano-sensibilidade que seria de outra forma exige o acesso a instalações de salas limpas e conhecimento em profundidade de análise de imagem e desenvolvimento de software. A figura 1 ilustra o fluxo de trabal...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K visualizações.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Biologia

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single nanometer-scale pore. The signal is characteristic of the molecule&#39;s physicochemical properties and its interactions with the pore. We demonstrate that the nanopore formed by the bacterial protein exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (&#945;HL) can detect polyoxometalates (POMs, anionic metal oxygen clusters), at the single molecule limit. Moreover, multiple degradation products of 12-phosphotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in solution are simultaneously measured. The single molecule sensitivity of the nanopore method allows for POMs to be characterized at significantly lower concentrations than required for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This technique could serve as a new tool for chemists to study the molecular properties of polyoxometalates or other metallic clusters, to better understand POM synthetic processes, and possibly improve their yield. Hypothetically, the location of a given atom, or the rotation of a fragment in the molecule, and the metal oxidation state could be investigated with this method. In addition, this new technique has the advantage of allowing the real-time monitoring of molecules in solution.&#160;

Here, we present a protocol to detect discrete metal oxygen clusters, polyoxometalates (POMs), at the single molecule limit using a biological nanopore-based electronic platform. The method provides a complementary approach to traditional analytical chemistry tools used in the study of these molecules.

Caracterização física de alta resolução de nanopartículas metálicas únicas

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Química

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Um grânulo emparelhado e matriz de ímã para moldagem micropoços com geometrias côncavas variáveis

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Matrizes cantilever ativas paralelas no AFMS para permitir inspeções de alto rendimento

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autor em destaque: Introdução à microscopia de força atômica de sonda ativa com matrizes de cantilever quattro-paralelos

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Microscopia de Força Atômica de Sonda Ativa com Matrizes Cantilever Paralelas Quattro para Inspeção de Amostras em Grande Escala de Alto Rendimento

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Resumo

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Microscopia de Força Atômica de Sonda Ativa com Matrizes Cantilever Paralelas Quattro para Inspeção de Amostras em Grande Escala de Alto Rendimento

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