Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento do Conselho Escocês (Grant Número HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medical Research Scotland ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), o câncer Cancer Research UK Experimental Medicine Centre ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), e Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Preparação dos tecidos <ol class="lalpha"><li> Microtomia <ol class="lroman"><li> Parafina seção formol fixo embutido blocos de tumor de 4 mM espessura usando um micrótomo rotativo. </li><li> Coloque as secções em lâminas com carga positiva. </li><li> Incubar as lâminas em um forno de 37 ° C durante a noite. </li></ol></li><li> Armazenamento <ol><li> Seções em uma loja de -18 ° C a -25 ° C freezer, a fim de evitar a perda de antigenicidade. </li></ol></li></ol> 2. Imunofluorescência de secções de tecido <ol class="lalpha"><li> Desparafinação e Reidratação <ol class="lroman"><li> Dewax slides em xileno duas vezes por 5 min. </li><li> Reidratar slides em 99%, 99%, 80%, 50% de etanol e água corrente por 2 min de cada um em ordem. </li></ol></li><li> Recuperação antigênica <ol class="lroman"><li> Realizar a recuperação antigênica induzida por calor, usando citrato de sódio 0,15 mM, pH 6,0 em uma panela de pressão por 5 minutos na mide microondas. </li><li> Arrefecer slides por 20 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBST 0,05% por 5 min do roqueiro. </li></ol></li><li> Bloqueio de procedimento <ol class="lroman"><li> Tratar seções em peróxido de hidrogênio 3% por 10 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBST 0,05% por 5 min do roqueiro. </li><li> Adicionar as seções a Sequenza rack de imunocoloração. </li><li> Tratar seções no bloco de proteína de soro livre por 10 min. </li></ol></li><li> De incubação do anticorpo primário <ol class="lroman"><li> Incubar anticorpo primário diluído para diluição óptima em diluente de anticorpo Dako por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe em 0,05% PBST três vezes por 5 min cada. </li></ol></li><li> Epiteliais máscara de incubação (citoqueratina) <ol class="lroman"><li> Incubar mouse anti-pan citoqueratina, diluído 1:50 em diluente de anticorpo Dako overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Visualização máscara epiteliais <ol class="lroman"><li> Prepare uma diluição de 1:25 da cabra anti-rato Alexa555 santicorpo econdary no pré-diluído Envision bode coelho solução de anticorpo HRP. Incubar as lâminas no escuro por 1,5 horas em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe em 0,05% PBST três vezes para cada 5min. </li></ol></li><li> Visualização alvo <ol class="lroman"><li> Transferir os slides da Sequenza para a câmara de umidade. </li><li> Combine-alvo diluente amplificação de sinal (HistoRx tub E) e os tiramida Cy5 (HistoRx F tubo) em 1:50 concentração. Vortex para misturar bem. Incubar as lâminas no escuro por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe em 0,05% PBST três vezes por 5 min cada. </li><li> Desidratar as lâminas em etanol 80% por 1 min. </li><li> Slides ar seco no escuro. </li></ol></li><li> Contracoloração e lamínulas <ol class="lroman"><li> Aplicar DAPI meio de montagem na lamínulas e coloque as lamelas sobre a seções do tecido. </li><li> Slides secar durante a noite no escuro. </li><li> Após os slides tenham secado, segura com unhas polonês para enpreservação a longo prazo e se manter na geladeira a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Captura de imagem de varredura seção inteira <ol class="lalpha"><li> Carregar até cinco slides no cassete deslize do scanner de slides Aperio ScanScope FL. </li><li> Para cada slide, selecione a região em geral para a imagem usando a interface no console ScanScope. Selecione a região para abranger todo o tecido no slide, independentemente da coloração padrão ou de outros aspectos observáveis ​​da amostra. </li><li> Usando o Console ScanScope, para cada canal (DAPI, Cy3 e Cy5) determinar uma melhor exposição da seguinte forma: <ol class="lroman"><li> Selecione uma região de tecido para interrogar - esta área deve, idealmente, estar na região do tumor de tecido para fornecer a melhor representação. </li><li> Usando o recurso de auto-exposição ScanScope Console, avaliar o tempo de exposição sugerido para cada canal, juntamente com o foco da imagem. </li><li> Repita mais até 05/03 regiões de cada amostra para confirm estabilidade do valor. </li></ol></li><li> Selecione uma região adicional (como mostrado por um diamante azul na imagem consola ScanScope) de distância a partir do tecido, mas ainda dentro da região lamínulas da lâmina, para definir uma área de fundo onde as imagens correcção forfetária de campo serão adquiridos para cada filtro. </li><li> Rever essas imagens antes da aquisição da imagem. Se as imagens parecem ter elevado ruído de fundo ou artefatos outra imagem, a região da imagem deve ser movido e novas imagens adquiridas. </li><li> Adquirido imagens de slides digitais são carregados automaticamente no banco de dados Spectrum Aperio. </li></ol> 4. AQUA automatizado de análise de imagem <ol class="lalpha"><li> Ver o imagens digitais slide inteiro no banco de dados Spectrum e anotar tumor áreas de interesse no contexto de todo o tecido e padrão de coloração (s). </li><li> Selecione o slide ao analisar usando AQUAnalysis da lista de slides digitais no banco de dados Spectrum clicando duas vezes o polegarprego de imagem (em alternativa, marque a caixa de seleção ao lado da imagem e selecione &quot;Ver imagens&quot; no menu no topo da lista). Este abre automaticamente o software ImageScope ea imagem de cores mescladas da amostra de tecido. </li><li> Use este software para navegar na imagem usando as ferramentas fornecidas. </li><li> Usando a H &amp; E acompanha (ou deslize o físico ou uma imagem anotada), anotar a região de interesse na imagem fluorescente. Diversas regiões de interesse, individual circulou áreas, podem ser selecionados em uma única amostra. Há também uma ferramenta de &quot;negativo&quot; que é usada para excluir as áreas dentro de uma região selecionada (ou seja, o tecido danificado, áreas de histologia pobres, áreas não-tumorais, detritos, etc.) </li><li> Salvar a camada de anotação (s) na imagem. </li><li> Voltar ao menu principal Spectrum e marque a caixa de seleção ao lado a imagem que acabou de ser anotado. Selecione &quot;Analisar&quot; da faixa de menu na parte superior da lista. </li><li> Na janela de Análise, que vai aparecer, select &quot;HistoRx Análise AQUA&quot; no menu suspenso. </li><li> Se existem várias camadas de anotações, use as caixas de seleção para selecionar a camada adequada (s) para análise. </li><li> Pressione o &quot;Analisar&quot; botão quando estiver pronto para começar. </li><li> Neste ponto, uma janela de console irá aparecer minimizado na barra de tarefas do Windows. Isto irá exibir o andamento da transferência de imagens do banco de dados de espectro para o PC local (a &quot;puxar&quot; a operação). </li><li> Uma vez que os dados são transferidos, AQUAnalysis vai lançar. O usuário pode então usar todas as funções internas do software para visualizar, navegar e analisar imagens. </li><li> A região anotada da imagem do banco de dados de espectro é dividido em telhas de imagem 512x512 pixel - cada um dos quais vai ser marcado individualmente. </li><li> Para este estudo, um algoritmo de pontuação unsupervised AQUA, baseado na agregação de dados, foi utilizado 8. Neste algoritmo, as pontuações AQUA são gerados da seguinte forma: <ol class="lroman"><li> A imagem pan-citoqueratina signal é thresholded acima fundo e os pixels são usados ​​para definir um tumor &#39;máscara&#39; que é então utilizado para cálculos posteriores. A expressão de alta pan-citoqueratina pixels também definem as regiões citoplasmáticas / não-nuclear das células tumorais. </li><li> Pixels com sinal de alta no canal DAPI que estão dentro da máscara de tumor são identificadas como nuclear na natureza. </li><li> O algoritmo de agrupamento também examina pixels que têm baixa intensidade para qualquer coloração DAPI ou expressão citoqueratina e tenta parcialmente atribuí-las a qualquer dos compartimentos nuclear ou citoplasmática, ou de fundo. </li><li> Uma vez que todos os pixels são atribuídos a um dos compartimentos do tumor ou de fundo, a intensidade do sinal da proteína-alvo (ER ou HER2) é então calculada em cada um dos compartimentos e normalizadas para o tamanho dos compartimentos, produzindo pontuações AQUA. </li><li> Imagens que não têm representação tumor suficientes não foram marcados (como definido por aqueles com less de 5% dos pixels representando tumor). Estas regiões também produzem um valor &#39;Resultado Final&#39; chamada &#39;Fail&#39; e podem ser retirados nas subseqüentes análises estatísticas. </li><li> Além disso, se após a revisão, um operador identificados campos que não eram apropriados para marcar devido à amostra ou artefatos de imagem (por exemplo, o tecido dobrado detritos), os campos foram redigidas a partir de pontuação e produziu um &#39;Final Resultado&#39; chamada &#39;Fail&#39;. </li></ol></li><li> Os resultados da pontuação AQUA são tabelas de pontuações associadas a cada telha 512x512 pixels na região de interesse dentro de uma amostra de tecido toda seção. Esses arquivos, em formato. CSV, pode então ser usado para posterior análise estatística. </li></ol> 5. Análise estatística: Todas as análises estatísticas são realizadas no SPSS (IBM) <ol><li> Sempre que possível, para operações de grande porte, gerar arquivos de sintaxe SPSS código (. Sps) para realizar manipulações de dados e as etapas de análise. Sintaxe de código exemplo é fornecido como arquivos suplementares. </li><li&gt; Leia os arquivos de dados em SPSS. Remove variáveis ​​não utilizadas nos dados brutos (por exemplo, parâmetros de instrumento específico, a pontuação AQUA de não-utilizados compartimentos). </li><li> Quando as regiões têm um &#39;Resultado Final&#39; de &#39;Fail&#39; (veja acima), marca estes valores como SYSMIS, que remove-los a partir das análises numéricas. </li><li> Agregar todos os dados para todos os slides para cada marcador (ER ou HER2) em um único conjunto de dados mestre em formato SPSS. Utilize este arquivo mestre para todos os cálculos subseqüentes. </li><li> Usando um arquivo de sintaxe SPSS (uma para cada marcador: ER ou HER2 (ver arquivos de sintaxe adicionais) de dados foi ainda mais validado e índices de diversidade de Simpson calculado da seguinte forma: <ol class="lroman"><li> Gerar um arquivo mestre analítico, a fim de impedir a modificação dos dados mestre set gerado anteriormente. </li><li> Validar os dados mestre set contra os dados brutos e imagens geradas. </li><li> Produzir estatísticas de resumo para pontuação AQUA para cada amostra (contagem de campos, a média de pontuação pontuação, mediana, minimum pontuação, a pontuação máxima, e desvio padrão dos escores da amostra). </li><li> Confira uma amostra aleatória de resultados com o original primas arquivos de dados de saída e contra os dados de imagem raw marcou. </li></ol></li><li> Para gerar as imagens mapa de calor (mostrado nas Figuras 2 e 3): <ol class="lroman"><li> &quot;Bin&quot; do Aqua Data pontuação (utilizando a função &#39;Binning Visual&#39; no SPSS) em oito níveis individual. Para ER, partituras nuclear foram utilizados, para HER2, partituras citoplasmática foram usados. </li><li> Derive caixas de forma que cada bin representa uma percentagem igual de casos disponíveis a partir do conjunto de dados inteiro. </li><li> Use &#39;File Split&#39; a função SPSS para que todos os de saída subseqüente seria em nível de uma &quot;amostra slide / per &#39;. </li><li> Plot cada região (que corresponde a uma telha 512x512) pelo seu coordenadas x, y e cor com um valor correspondente ao bin em que foi alocado (ver figuras 2 e 3). </li></ol></li><li> Para gerar escores heterogeneidade, o código foi escrito para gerar um de Simpsoníndice de diversidade através de escores AQUA. <ol class="lroman"><li> O índice de Simpson da diversidade, como usado aqui, é definida como: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Onde N é o número total de contagens / campos utilizados para uma dada amostra e n é o número de resultados / campos em um determinado grupo de escores padronizados (produzidos conforme descrito abaixo). </li></ol></li><li> Use o arquivo mestre analítico descrito acima para fonte de dados. Nos exemplos apresentados, todos os cálculos ER utilizado o escore AQUA nuclear e HER2 cálculos utilizados a pontuação AQUA citoplasmática. Executar os cálculos abaixo para cada amostra / slide. </li><li> Como os dados de fluorescência está sujeito à instabilidade da variância, tal magnitude que o erro se propaga com intensidade, aplicar normalização (base 2) logarítmica para todos os escores AQUA. </li><li> Ainda transformar o normalizado (log transformado) de dados em z-(standard) pontuações. <ol class="lroman"><li> A transformação Z-score é calculado ums seguinte forma: Z = (pontuação AQUA - média de todas as pontuações para uma amostra) / desvio padrão das notas para a amostra. Isto traduz a distribuição dos escores em uma distribuição dos desvios em torno do valor central de desvio zero. </li></ol></li><li> Bin estes valores Z-score em seis grupos (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0-1, 1-2,&gt; 2). </li><li> Calcular o número de valores alocados em cada bin e soma para cada bin. Utilize este valor, juntamente com o número total de campos, para calcular um valor para cada um dos seis caixas usadas para o índice. </li><li> Soma esses valores e subtrair de uma para produzir o índice de diversidade. </li><li> O índice de diversidade fornece um indicador da dispersão dos escores em torno da média para uma amostra particular. Assim, os índices mais altos indicam uma maior propagação da pontuação, ou crescente heterogeneidade de expressão. Por outro lado, os índices mais baixos, indicam menor variação na medição de expressão e de expressão homogênea na amostra. Isso é ilustrado na Figures 2 e 3. </li></ol> 6. Resultados representativos: Terapia-alvo com os agentes de toxicidade relativamente baixos, como o tamoxifeno e trastuzumab, não são padrão de atendimento para pacientes com câncer de ovário. Há boas evidências de que a platina-taxano quimioterapia de primeira linha é superior a outros regimes de quimioterapia para o câncer de ovário 9-13, e enquanto 70-80% dos pacientes respondem inicialmente, a maioria vai recaída e morrer de sua doença. Medição de biomarcadores que possam prever a resposta a terapias alternativas seria útil na seleção de terapia individualizada para cada paciente, e uma vez que a quimioterapia pressão de seleção exerce sobre um tumor, sobrevivendo as células tumorais podem possuir características diferentes e representam uma subpopulação do tumor antes da terapia; quantificar este mudança pode ser útil. Nós aplicamos nossa abordagem de mapeamento heterogeneidade de expressão ER e HER2 em amostras de câncer de ovário, antes e após a quimioterapia, em order para medir mudanças quantitativas na expressão, e avaliar a relação entre a expressão de biomarcadores antes e após a terapia. Ambos ER e HER2 demonstram grande heterogeneidade nos tumores individuais, e em alguns tumores, alterações do índice de Simpson após a terapia da heterogeneidade relativamente alta para baixa heterogeneidade, representada pela diminuição do índice de Simpson pontuações (ver Figuras 2 e 3). Isso apóia a idéia de que a seleção clonal ocorre em resposta à quimioterapia citotóxica, mais importante, isso pode ser explorada usando terapia direcionada contra a população residual, a fim de personalizar melhor terapia para pacientes com câncer. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Fotomicrografias figura 1. Hematoxilina e eosina de diferentes áreas do cancro do ovário mesmo mostrando a morfologia variável. (A) x40 fotomicrografia mostra duas áreas adjacentes de tumor com morfologia variada. Alta vê o poder (x200) revelam células com clareamento citoplasmático e um padrão de crescimento sólido na parte superior do tumor (B), enquanto a parte inferior do tecido (C) tem mais homogênea citoplasma eosinofílico e um padrão de crescimento papilar. Este tumor, no entanto, ser classificadas como subtipo papilar serosa histológicas para efeitos de gestão mais. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figura 2. Heatmaps Heterogeneidade de ER expressão da proteína em citoqueratina positivas tecido de câncer de ovário, antes (painel superior) e após (painel inferior) terapia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figura 3. Heatmaps Heterogeneidade da expressão da proteína HER2-positivo em citoqueratina tecido de câncer de ovário, antes (painel superior) e terapia (painel inferior) após.

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	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. 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JC, MG, CJ, e CS são funcionários da HistoRx, Inc.

O método descrito aqui permite a quantificação da heterogeneidade molecular na norma fixadas em formalina, incluído em parafina cortes histológicos de material de tumor. O método permite um valor a ser atribuído o grau de heterogeneidade em uma seção de tecido, de modo que este pode então ser considerados como uma variável no desenvolvimento de biomarcadores e análise. Embora, em geral, é preferível que os biomarcadores de tecido são homogêneas no que diz respeito à liberdade de expressão, de modo que o ensaio é menos suscetível a erros de amostragem ou de viés, pode em algumas circunstâncias ser útil para quantificar a heterogeneidade como um parâmetro. Por exemplo, como mostrado no exemplo ilustrativo para ER e HER2, biomarcadores comuns mostram uma considerável heterogeneidade de expressão e é atualmente desconhecido se isto representa um fator prognóstico independente ou preditiva em relação à evolução clínica ou resposta à terapia, respectivamente. Da mesma forma, como ilustrado, a terapia em si pode alterar dinamicamente apopulações constituintes das células e, portanto, medição de enriquecimento de alvo pode ser útil para orientar as decisões de tratamento. No entanto, a técnica é limitada pelos mesmos fatores que limitam tradicionais análises histopatológicas ou biomarcadores (tais como imuno-histoquímica). O resultado é dependente do tipo, tamanho e qualidade do tecido a ser analisado, e, portanto, uma secção de tecido única pode não ser representativa de todo o tumor. De fato, o índice de Simpson pode ser indevidamente influenciada por tamanho do tecido (número de quadros capturados e dezenas AQUA medido). A imunogenicidade da epítopos que está sendo medido pode estar sujeito a incontrolável fatores pré-analíticos que artificialmente alterar sua expressão através da secção de tecido (como o tempo de isquemia fria, ou o comprimento de fixação, e artefatos de borda). Isto é particularmente um problema para fosfo-epítopos, que são notoriamente instáveis ​​14, 15. Portanto, a técnica poderia ser mais adequadaaos espécimes de ressecção, em vez de pequenas biópsias, e realizado em várias seções, em vez de apenas um. Em última análise, técnicas de imagem 3D pode oferecer uma oportunidade para melhor quantificar este parâmetro. A técnica, tal como apresentado também pode ser limitada por fatores biológicos, tais como variabilidade na expressão do epítopo mascaramento citoqueratina. Isso pode ser motivo de preocupação particular nos cânceres, incluindo câncer de mama e de ovário, que se submetem epitelial-mesenquimal to-transição (EMT) ou são enriquecidas para não-epiteliais componentes ou células-tronco 16, como foi recentemente demonstrado que ocorrem em quimioterapia tratados de câncer de ovário in vitro 17, e em pacientes com câncer de mama em resposta à terapêutica 18. Esta limitação pode ser superada através de anticorpos mascaramento alternativa (ou cocktails de anticorpos), tais como citoqueratina mais vimentina, que é regulada em EMT 16. Além disso, uma vez que outros componentes do tecido (o microenvironment), como fibroblastos ou células endoteliais vasculares são também cada vez mais sendo alvo de terapias biológicas, a técnica também pode ser expandida para marcar esses componentes, usando máscaras específicas para compartimentos de interesse, tais como PECAM / CD31 a mancha de células endoteliais vasculares . Embora a adaptação do índice de Simpson foi usado como uma medida de heterogeneidade no protocolo atual, devido à sua simplicidade, outras medidas de heterogeneidade poderia ser usado, como medidas simples de tendência central (média, mediana variância, etc). Além disso, os cálculos do índice de Simpson poderia ser modificado para melhor atender uma população de teste particular. O uso de Z-score transformações permite o placar ser mais aplicável para múltiplos marcadores desde a heterogeneidade é baseado em desvio em torno da média para um conjunto de dados. No entanto, a gama global de pontuação pode ser limitado a este tipo de transformação. Alguns projetos podem ser mais adequadossimplesmente bin as pontuações AQUA real para todas as amostras de um conjunto marcador particular. A seleção do número de caixas e cortes também é uma limitação no intervalo de valores que pode resultar e pode ser otimizado para designs alternativos experimental. Temos usado ER e HER2 no estudo atual como candidatos a biomarcadores, uma vez que já são utilizados na clínica, ajudar a responder questões clínicas relevantes com relação à eficácia de terapias específicas, e são conhecidos por apresentar uma considerável heterogeneidade e mudança no ensino primário e distante doença 19. No entanto, o marcador ideal de heterogeneidade permanece a ser determinado. Outras possibilidades podem incluir marcadores citogenéticos de clonalidade, como os anteriormente utilizados em estudos FISH interfásico 20. A abordagem requer uma validação adicional em grande, bem anotado coortes clínicos ou clínicos, a fim de apurar a relevância deste parâmetro na biologia do câncer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Usado como equipada de fornecedor </td></tr><tr><td> Espectro </td><td> Aperio </td><td> Espectro </td><td> Números de configuração e catálogo irá variar de como as instituições locais criarem a sua base de dados e estrutura de TI. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, em conjunto com AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> O pacote permite AQUAjustment AQUAnalysis usar imagens armazenadas no Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 em 400 de diluição </td></tr><tr><td> mouse anti-pan citoqueratina </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 em 50 de diluição </td></tr><tr><td> Diluente de anticorpo </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision bode coelho-HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Bloco de proteína </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Goat anti-mouse Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI meio de montagem </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 tiramida </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza Centro imunocoloração </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Usada aqui para bancada imunofluorescência </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Heterogeneidade morfológica dentro de um tumor individual é bem reconhecido por histopathologists na prática cirúrgica. Enquanto isso muitas vezes assume a forma de áreas de diferenciação distintas em reconhecida subtipos histológicos, ou grau patológico diferentes, muitas vezes há diferenças mais sutis no fenótipo que desafiam classificação precisa (Figura 1). Em última análise, uma vez que a morfologia é ditada pelo fenótipo molecular subjacente, áreas com diferenças visíveis são susceptíveis de ser acompanhadas por diferenças na expressão de proteínas que orquestram a função celular e comportamento, e, portanto, a aparência. O significado do visível e invisível heterogeneidade (molecular) para o prognóstico é desconhecida, mas evidências recentes sugerem que, pelo menos no nível genético, a heterogeneidade existente no 1,2 tumor primário, e alguns desses clones sub-dar origem a metástases ( e, portanto, letal) da doença. Além disso, algumas proteínas sãomedida como biomarcadores porque eles são os alvos da terapia (por exemplo, ER e HER2 para o tamoxifeno e trastuzumab (Herceptin), respectivamente). Se estas proteínas mostram expressão variável dentro de um tumor, em seguida, respostas terapêuticas também podem ser variáveis. O amplamente utilizados sistemas de pontuação histopatológico em imuno-histoquímica ou ignoram, ou numericamente homogeneizar a quantificação da expressão da proteína. Da mesma forma, em técnicas destrutivas, onde as amostras são homogeneizadas tumor (tais como perfil de expressão gênica), informação quantitativa pode ser elucidado, mas a informação espacial é perdido. Abordagens de mapeamento heterogeneidade genética no câncer pancreático confiaram tanto na geração de uma suspensão única célula 3, ou em 4 macrodissection. Um estudo recente tem utilizado os pontos quânticos, a fim de mapear a heterogeneidade morfológica e molecular em tecido de câncer de próstata 5, fornecendo prova de princípio que o mapeamento morfologia e molecular é viável, mas caindo short de quantificar a heterogeneidade. Desde imuno-histoquímica é, na melhor das hipóteses, apenas semi-quantitativa e sujeito a viés intra-e inter-observador, mais sensível e metodologias quantitativas são necessárias, a fim de mapear com precisão e quantificar a heterogeneidade do tecido in situ. Temos desenvolvido e aplicado uma metodologia experimental e estatística, a fim de quantificar sistematicamente a heterogeneidade da expressão da proteína em seções do tecido inteiro de tumores, com base na análise automatizada quantitativos (AQUA) sistema 6. Secções de tecido são rotulados com anticorpos específicos dirigidos contra citoqueratinas e alvos de interesse, acoplado a fluoróforo marcado com anticorpos secundários. Slides são gravadas usando um scanner de fluorescência de todo o slide. As imagens são subdivididos em centenas de milhares de telhas, e cada azulejo é então atribuído uma pontuação AQUA que é uma medida de concentração de proteínas dentro do componente (tumor) do tecido epitelial. Heatmaps são gerados para representar expressão tecidual de proteínas e uma pontuação atribuída a heterogeneidade, usando uma medida estatística de heterogeneidade originalmente usado em ecologia, com base no índice de Simpson biodiversidade 7. Até à data não houve tentativas de mapear sistematicamente e quantificar essa variabilidade em conjunto com a expressão da proteína, em preparações histológicas. Aqui, ilustramos o primeiro uso do método aplicado para ER e HER2 expressão de biomarcadores em câncer de ovário. Usando este método abre caminho para analisar a heterogeneidade como uma variável independente em estudos de expressão de biomarcadores em estudos de translação, a fim de estabelecer o significado da heterogeneidade no prognóstico e previsão de respostas à terapia.

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Aqui nós descrevemos um método para quantificar a heterogeneidade molecular em cortes histológicos de material do tumor através de imunofluorescência quantitativos, análise de imagem, e uma medida estatística de heterogeneidade. O método é destinado ao uso no desenvolvimento de biomarcadores e análises clínicas.

Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.5K visualizações.  University of Edinburgh. Aqui nós descrevemos um método para quantificar a heterogeneidade molecular em cortes histológicos de material do tumor através de imunofluorescência quantitativos, análise de imagem, e uma medida estatística de heterogeneidade. O método é destinado ao uso no desenvolvimento de biomarcadores e análises clínicas.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement whereas coordinate mapping of hyolaryngeal mechanics using Modified Barium Swallow (MBS) uses one set of coordinates to calculate multiple variables of interest. For demonstration purposes, ten kinematic measurements were generated from one set of coordinates to determine differences in swallowing two different bolus types. Calculations of hyoid excursion against the vertebrae and mandible are correlated to determine the importance of axes of reference.
To demonstrate coordinate mapping methodology, 40 MBS studies were randomly selected from a dataset of healthy normal subjects with no known swallowing impairment. A 5 ml thin-liquid bolus and a 5 ml pudding swallows were measured from each subject. Nine coordinates, mapping the cranial base, mandible, vertebrae and elements of the hyolaryngeal complex, were recorded at the frames of minimum and maximum hyolaryngeal excursion. Coordinates were mathematically converted into ten variables of hyolaryngeal mechanics.
Inter-rater reliability was evaluated by Intraclass correlation coefficients (ICC). Two-tailed t-tests were used to evaluate differences in kinematics by bolus viscosity. Hyoid excursion measurements against different axes of reference were correlated. Inter-rater reliability among six raters for the 18 coordinates ranged from ICC = 0.90 - 0.97. A slate of ten kinematic measurements was compared by subject between the six raters. One outlier was rejected, and the mean of the remaining reliability scores was ICC = 0.91, 0.84 - 0.96, 95% CI. Two-tailed t-tests with Bonferroni corrections comparing ten kinematic variables (5 ml thin-liquid vs. 5 ml pudding swallows) showed statistically significant differences in hyoid excursion, superior laryngeal movement, and pharyngeal shortening (p &#60; 0.005). Pearson correlations of hyoid excursion measurements from two different axes of reference were: r = 0.62, r2 = 0.38, (thin-liquid); r = 0.52, r2 = 0.27, (pudding).
Obtaining landmark coordinates is a reliable method to generate multiple kinematic variables from video fluoroscopic images useful in dysphagia research.

Coordinate mapping is a method of documenting salient features of hyolaryngeal biomechanics in the pharyngeal phase of swallowing. This methodology uses image analysis software to record coordinates of anatomical landmarks. These coordinates are imported into an excel macro and translated into kinematic variables of interest useful in dysphagia research.

Coordenar Mapeamento de hiolaríngeo Mecânica em engolir

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

Mapeamento quantitativo de ventilação específica no pulmão humano usando ressonância magnética de prótons e oxigênio como agente de contraste

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...