A imunohistoquímica fluorescente multiplex identifica vários tipos de células e suas localizações em tecido integrado à parafina fixa de formalina intacta, permitindo não apenas a identificação celular, mas também a análise espacial celular para célula. A principal vantagem desta técnica manual é o uso de múltiplos anticorpos da mesma espécie sem reatividade cruzada. Esta técnica permite uma visão aprofundada das interações das células imunes e cancerígenas no microambiente tumoral.
Ao experimentar essa técnica pela primeira vez, deixe aproximadamente três a quatro dias de coloração e acompanhe completamente cada etapa durante o processo. Um método mais fraco do processo de coloração e do design multiplex é fundamental para diminuir as armadilhas comuns e esperadas. Comece desparafinando e reidratando os slides.
Coloque-os no forno de hibridização com o lado do tecido para cima e assá-los a 60 graus Celsius por uma hora. Retire os slides do forno e deixe esfriar por cinco a 10 minutos em um rack de slides vertical. Em seguida, use um conjunto de manchas de slides para tratar os slides três vezes com xileno e uma vez com 100% de etanol, 95% de etanol e 70% de etanol por 10 minutos cada.
Lave o rack de lâminas com água desionizada e, em seguida, fixe os slides submergindo-os em formalina tamponada neutra por 30 minutos. Lave os slides com água por dois minutos e proceda com a recuperação de antígenos. Coloque o rack de slides em uma caixa resistente ao calor cheia de pH 6.0 ou pH 9.0 tampão de recuperação de antígeno.
Cubra a caixa com plástico e fixe-a com um elástico. Coloque a caixa em um micro-ondas equipado com inversor na borda da placa giratória e aqueça os slides por 45 segundos a 100% de potência seguido de 15 minutos com 20% de potência. Deixe os slides esfriarem por 15 a 20 minutos após a microwaving.
Enquanto isso, prepare soluções de trabalho de anticorpos e fluoroforos. Prepare o diluente de anticorpos primário dissolvendo 0,5 gramas de grânulos de albumen de soro bovino em 50 mililitros de TBST ou 1X PBS. Diluir cada solução de trabalho de anticorpos primários para uma concentração otimizada previamente determinada.
Diluir cada fluorfora no fluorforeiro diluído em uma concentração de 1 a 100. No último dia de coloração, prepare a solução de trabalho da DAPI adicionando três gotas de DAPI a um mililitro de TBST. Uma vez que os slides sejam resfriados, remova-os do micro-ondas e retire o plástico.
Lave-os com água deionizada por dois minutos seguido de uma lavagem de dois minutos com TBST. Após a lavagem, seque a lâmina ao redor do tecido com uma tarefa delicada limpar e traçar ao redor do exterior do tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica, tomando o cuidado de não tocar no tecido ou deixá-lo secar. Coloque cada lâmina na câmara umidificador e adicione aproximadamente quatro gotas de solução de bloqueio ao tecido.
Em seguida, incubar os slides por 10 minutos em temperatura ambiente e proceder com a aplicação de anticorpos primários. Remova a solução de bloqueio de cada slide tocando na lateral do slide em uma pilha de toalhas de papel e use uma delicada limpeza de tarefas para remover a solução restante. Coloque o slide de volta na câmara umidificada, adicione aproximadamente 200 microliters do anticorpo primário funcionando e incubar por uma hora.
Após a incubação, lave os slides três vezes submergindo-os no TBST por dois minutos por lavagem. Dab fora do TBST restante de cada slide e aplique aproximadamente três a quatro gotas de anticorpo secundário. Incubar os slides na câmara umidificada por 10 minutos.
Lave os slides novamente com TBST e aplique aproximadamente 100 microliters da solução de trabalho fluoróforo. Devolva os slides para a câmara umidificada e incubar por 10 minutos. Repita a lavagem TBST e, em seguida, micro-ondas os slides de acordo com as instruções do manuscrito para remover os anticorpos.
Uma coisa importante a ser lembrada durante este processo de coloração de vários dias é parar após a etapa de micro-ondas e deixar os slides no tampão de recuperação de antígeno durante a noite, garantindo a integridade do tecido e da mancha. Remova a última aplicação de anticorpos com a solução de recuperação de antígeno e lave os slides com água desionizada seguida de TBST por dois minutos por lavagem. Repita as etapas de coloração para o resto dos pares de fluróforos de anticorpos e, em seguida, proceda com a aplicação DAPI.
Aplique aproximadamente 150 microliters da solução DAPI de trabalho a cada slide e incuba-os na câmara umidificada por 10 minutos. Após a incubação, lave os slides com TBST por aproximadamente 30 segundos e monte os deslizamentos de tampa. Uma vez que a mídia de montagem tenha secado, aplique esmalte claro nas quatro curvas da tampa para fixá-la.
Para analisar o monoplex, imagem os slides no microscópio com uma exposição de 250 milissegundos usando DAPI para se concentrar. Avalie cada slide monoplex olhando para a intensidade da fluorescência do marcador manchado e compare essa intensidade com o fundo. Use a posição de slides no multiplex final se a intensidade do marcador manchado for pelo menos cinco vezes maior do que o plano de fundo.
Ao colorar o multiplex, escolha a ordem apropriada para cada anticorpo e atribua cada fluoróforo a um anticorpo. Proceda com a coloração do multiplex como descrito anteriormente e prepare um slide em branco que receba diluente de anticorpos, diluente fluorofeiro e TBST em vez de anticorpo primário, fluoróforo ou DAPI. Quando estiver pronto para visualizar o multiplex no microscópio, defina a exposição a 250 milissegundos para todos os canais e capture cada imagem usando DAPI para se concentrar.
Em seguida, use o software de análise para avaliar cada multiplex por cor falsa fluorescente e pela visão patológica, que confirmará a especificidade de cada marcador. Para garantir o sucesso do ensaio multiplex, um ensaio monoplex deve ser realizado para determinar a ordem de cada anticorpo. Por exemplo, quando o Foxp3 está na terceira posição da matriz, é demonstrado o coloração e colocalização específicas e robustas com o CD3.
Em contraste, quando foxp3 está na primeira posição, a coloração inespecífica de Foxp3 ocorre. Áreas granulados e efusas de vermelho estão presentes na maior parte do escorregador, e a intensidade fluorescente dessas áreas é baixa. Outro passo importante neste ensaio é a contra-tainagem do DEPI, que é a base para identificação celular e análises mais aprofundadas.
Um contraste claro pode ser visto entre imagens com DAPI de trabalho e não-trabalho. Para o ensaio multiplex, belas imagens compostas nem sempre refletem uma mancha precisa. Enquanto o CD3 é visualizado e mostra coloração específica, a visão patológica do CD163 prova que o anticorpo não é específico.
Uma imagem multiplex ideal demonstra coloração específica em uma imagem composta, e a especificidade CD3 e CD163 é confirmada com a visão brightfield patológica. Após esse procedimento, os cálculos de auto-fenotipagem e análise espacial podem ser realizados para analisar melhor as interações celular-célula. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a padronização espacial das células e do tecido intacto, promovendo nossa compreensão do microambiente imunológico tumoral.
