Agradecemos a Martine Emond e Isabel Brachmann por sua ajuda no estabelecimento do sistema de cultura organotípicas fatia e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Frank Costantini para o R26 ratos repórter e Cliff Tabin para os ratos creer Shh. Este estudo foi financiado por um Prêmio de Pesquisa do Ministério da Ciência e Investigação de North-Rhine Westphalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Partes do presente protocolo são modificados a partir de Daza et al., 2007 7. 1. Preparativos <ol><li> Pode ser preparado um dia de antecedência <ol><li> Prepare 1X tampão Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO 3; ajustar o pH para 7,4. Filtro de esterilizar (0,22 tamanho dos poros mm) e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar o meio de cultura (20 mL): 5 mL HBSS, 9 mL de glicose DMEM alta, 850 mL de glicose 30%, 5 mL soro de cavalo (25%). Adicionar 200 mL Penicllin 100X / estreptomicina. Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare antes de iniciar a dissecção <ol><li> Prepare 100 mL de 4% agarose baixa temperatura de fusão (LMP agarose) em 1X tampão Krebs: solução de microondas a até a agarose é completamente dissolvido e, em seguida, coloque a agarose em um banho de água 45 ° C. </li><li> Preencha o vibratome com gelo na bandeja de tampão frio 1X tampão Krebs e iniciar o elemento de refrigeração (mantenha a 4 ° C). Fix uma lâmina de barbear no suporte da lâmina e set-up a área vibratome com um bisturi, pincel uma multa e uma colher perfurada mini-para pegar as fatias. Prepare pratos Petri estéreis (35 x 10 mm) com 1x tampão Krebs para a coleta das fatias. Manter no gelo. </li><li> Set-up a área de dissecção com pratos de Petri estéreis (100 x 15 mm) para dissecção e menor pratos Petri estéreis (35 x 10 mm) para a incorporação, tesoura pequena, duas pinças de multa (Dumont 5), uma colher de mini-perfurado, um vidro Pasteur fogo pipeta polido com uma rodada fechada ponta e 1 L de 1X tampão Krebs no gelo. Limpe todas as ferramentas de dissecção com etanol 70%. </li><li> Adicionar meio de cultura para os poços de uma placa de seis poços (1,5 mL / poço) e coloque-o a 37 ° C incubadora. </li><li> Prepare um prato de seis bem com 1,5 mL / poço estéril 1X tampão Krebs e 15 mL penicilina / estreptomicina (100X) / poço. Em condições estéreis, coloque MilCelular licell Cultura insere nos poços. Coloque a placa de seis bem ao lado do vibratome de modo que as fatias de cérebro podem ser transferidos para as membranas de filtro imediatamente após o corte. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção e incorporação de cérebros embrionários <ol><li> Anestesiar um rato fêmea grávida usando isoflurano e sacrifício o mouse por deslocamento cervical (embriões devem estar no estágio E12.5). Dissecar o útero do rato, puxando-se o útero com uma pinça. Use uma pinça para separar as outras mesométrio longe do útero. Coloque o útero gelada tampão Krebs 1X. Use uma pinça fina para separar a parede muscular do útero, membrana Reichert e do saco vitelino visceral do embrião. Remoção dos embriões do útero. Coloque os embriões dissecado em uma placa de Petri estéril separado com 1X Krebs buffer. </li><li> Dissecar o cérebro sob microscópio estereoscópico. Para dissecar o cérebro, primeiro cortaram a cabeça do embrião. Fixar a cabeçapor piercing forceps fina através da cabeça (do nível dos olhos). Use um outro par de pinças para remover cuidadosamente a pele e crânio. Use uma pinça para levante cuidadosamente o cérebro para fora e transferi-lo para uma placa de Petri estéreis com 1X Krebs buffer. É muito importante que a integridade de todo o cérebro é mantida durante a dissecção, uma vez que os danos ao tecido do cérebro criará problemas (como a trituração do tecido) durante o corte na vibratome. </li><li> Lavar o cérebro de vez em 4% com baixo ponto de fusão (LMP) agarose. Incorporar 03/02 cérebros em um momento em fresco 4% LMP agarose. Coloque os pratos incorporação no gelo o mais uniforme possível. Use uma pipeta Pasteur com a ponta-fogo polido rodada para levantar o cérebro até a parte inferior da agarose é solidificado. O cérebro deve se contentar em uma posição plana e horizontal na parte inferior do bloco de agarose. </li><li> Após a agarose foi totalmente solidificado (após cerca de 3 min), a guarnição da agarose ao redor do cérebro e cola o bloco de agarose para o palco espécimedo vibratome. Ao colar os blocos, certifique-se que o lado ventral do cérebro é paralela à plataforma, uma vez que o cérebro deve ser cortada em um plano de corte horizontal. </li></ol> 3. Seccionamento Vibratome <ol><li> Use uma lâmina de barbear para cortar. Para obter fatias intactas é muito importante para manter a temperatura a 4 ° C durante o corte. </li><li> Seção 300 mm, espessura horizontal em uma freqüência de 50 Hz, amplitude de lâmina de 1,1 mm e uma velocidade de 25 mm / sec. </li><li> Use o pincel fino para empurrar a fatia em uma colher de mini perfurada para coletar as fatias de cérebro e transferi-los em um prato com estéril gelada tampão Krebs 1X. Escolha a fatia que contém tecido mesencéfalo ventral (ver figura 1). Em um cérebro de camundongo E12.5 existe apenas uma fatia 300 mM horizontal que contém tecido mesencéfalo ventral incluindo neurônios dopaminérgicos. </li></ol> 4. Cultura fatia 4,2-4,5 passos devem ser realizados em condições estéreis. <ol><li> Transferir as fatias de cérebro em um insert membrana Millicell de cultura de células em um prato de seis bem com 1x tampão Krebs (ver ponto 1.2.5). Para transferir a fatia de usar a colher de mini-perfurada (Ferramentas Ciência Fine) e um pincel fino. Até 3 fatias podem ser colocados em uma membrana. </li><li> Transferência da membrana com a fatia para a placa de seis poços com meio de cultura (ver ponto 1.2.5). A parte superior da membrana não deverão ser abrangidos pelo meio. O cérebro recebe fatia média de baixo e ar de cima. </li><li> Coloque a placa de seis poços em uma incubadora com 5% de CO 2 a 37 ° C. É muito importante que as fatias são colocadas na incubadora dentro de 2 horas após a etapa inicial da dissecção. Um tempo de preparação mais prolongada pode resultar em sobrevida das fatias. </li><li> Fatias podem ser mantidos in vitro até 3 dias. Mudança de 50% do meio de cultura sobre o 2 º dia. </li></ol><ol><li> Deixe as fatias de recuperar na incubadora por 4-5 horas antes de iniciar lapso de tempo de imagem. </li><li> Por lapso de tempo de imagem, mantenha as fatias sobre a inserção da membrana e transferir a inserir em um milímetro Ibidi 35 μ-prato (fundo do prato é composto de material com alta qualidade ótica). </li><li> Adicionar 1 mL de meio de cultura mais 1,5 mL de ácido ascórbico (200 mM) ao prato. O ácido ascórbico protege as fatias contra fototoxicidade. </li><li> Incubar fatias em uma câmara a 37 ° C com 5% de CO2 durante o lapso de tempo de imagem. </li></ol> 6. Resultados representante A figura 1 ilustra a preparação de culturas fatia de organotípicas E12.5 cérebro do rato. A Figura 2 mostra horizontal fatias organotípicas (aguda e após vários dias em cultura) obtidos formulário cérebro de camundongo E12.5. Para efeito de comparação, as seções do cérebro congelado nas fases de desenvolvimento equivalentesão mostrados. Neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo são visualizados com imunoistoquímica para tirosina hidroxilase (TH). Mesencéfalo projeto neurônios dopaminérgicos para alvos na parte frontal do cérebro. Essas projeções começam a formar a E12.5 e estender para o cérebro anterior durante os dias subseqüentes. Nós consideramos o desenvolvimento de projeções prosencéfalo como uma boa indicação para o desenvolvimento normal de neurônios dopaminérgicos em cultura. No mesencéfalo fatias horizontais neurônios dopaminérgicos estendem projeções para a sua área apropriada do prosencéfalo alvo. Após 3 DIV (dias in vitro), ou quando as áreas-alvo do prosencéfalo estão danificados, as projeções aberrante estendem para o mesencéfalo dorsal. Exemplos de cortes coronais de E12.5 mesencéfalo são mostrados na Figura 3. Neurônios dopaminérgicos visualizado com imunomarcação para TH estendem projeções aberrante para o mesencéfalo dorsal. A Figura 4 mostra uma análise de proliferação, as células necróticas e apoptóticas nas culturas fatia organotípicas. BrdU immunostaining para visualizar células em proliferação demonstra que as células proliferam em condições de cultura após uma DIV. Proliferação é reduzida após 4 DIV. Após 3 DIV, muitas células no mesencéfalo ventral sofrer necrose (propidium coloração iodeto) e apotosis (imunomarcação para caspase-3 clivada). Figura 5 mostra os caminhos migratórios de YFP marcado neurônios monitorados em um experimento de imagens de lapso de tempo em uma fatia aguda . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemático ilustrando a preparação de culturas fatia organotípicas. 300 mm, fatias de cérebro horizontal são preparados por seccionamento um cérebro E12.5 usando um vibratome. (A) corte sagital esquemática de um cérebro de camundongo E12.5. Níveis de seções são indicadas. A área que contém neurônios dopaminérgicos é representado na cor rosa, as projeções são indicados em azul. (B) Esquema dos três fatias que podem ser obtidos a partir de dorsal para ventral e that contêm tanto prosencéfalo (Fb) e mesencéfalo (Mb). Note-se que apenas uma fatia contém neurônios dopaminérgicos (b fatia). A fatia apropriada podem ser identificados com base na posição dos ventrículos ea continuidade do mesencéfalo e prosencéfalo tecido (setas, compare b seção com uma seção e c). A área que contém neurônios dopaminérgicos é indicado em rosa, a área contendo precursores dopaminérgicos é representado em verde, azul setas indicam projeções em desenvolvimento. (C) A fatia que contém neurônios dopaminérgicos é cultivado em inserções de membrana. Abreviaturas: mesencéfalo, VMB ventral; DMB, mesencéfalo dorsal; Hyp, hipotálamo; Hb, rombencéfalo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> Figura 2. Projeções de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo em culturas fatia organotípicas dependem da integridade do cérebro anterior. Imunoistoquímica para tirosina hidroxilase (TH) para rotular neurônios dopaminérgicos. (A) fatia aguda (0 DIV)mostrando a localização normal de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo ventral. A seta branca indica a área que é mostrado na maior ampliação na inserção. Projeções para o prosencéfalo ainda não desenvolveram. Depois de uma DIV, as projeções para o prosencéfalo começam a se formar. Projeções se estendem até o prosencéfalo em 2-3 DIV. Setas brancas indicam a localização dos corpos celulares mostrado na maior ampliação no inserções (quadro branco). Setas amarelas destacam as projeções normal em fatias intactas mostrado na maior ampliação no inserções (quadro amarelo). Projeções aberrante desenvolver-se em fatias com prosencéfalo danificado. As setas vermelhas indicam as projeções aberrante para o mesencéfalo dorsal mostrado na maior ampliação no inserções (quadro vermelho). Dano é indicado com asteriscos vermelhos. Após 3 DIV, a maioria fatias (n = 07/05) apresentaram projeções aberrante para o mesencéfalo dorsal. (B) imunocoloração TH na horizontal seções cérebro congelado em diferentes estágios de desenvolvimento para mostrar o desenvolvimentodas projeções dopaminérgicas in vivo. Setas brancas indicam a localização dos corpos celulares mostrado na maior ampliação no inserções (quadro branco). Setas amarelas realçar a posição das projeções mostradas na maior ampliação no inserções (quadro amarelo). O nível de congelação foi escolhido para se aproximam do nível das culturas fatia organotípicas. Note que um único seções congeladas (12 mm) não representa a fatia inteira organotípicas (300 mm). Portanto, as projeções mostradas na E13.5 e E14.5 foram observados em seções 120 mM ventral mais do que a seção que contém os corpos celulares (asteriscos amarelo). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> Figura 3. Culturas Midbrain coronal fatia coradas para tirosina hidroxilase (TH) como marcador de neurônios dopaminérgicos. (AC) Fatias após DIV 1, 2 ou 3. Neurônios dopaminérgicos desenvolver projeções aberrante para o mesencéfalo dorsal (rsetas ed). Setas mostram a localização dos corpos celulares dopaminérgicos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> Figura 4. Proliferação celular e viabilidade celular em culturas de mesencéfalo organotípicas fatia. (A) células em proliferação foram marcadas pela adição de BrdU (50 ng / mL, Sigma) ao meio de cultura por 18 h. Fatias foram posteriormente histoquímica para BrdU. Depois de uma DIV, as células BrdU rotulados estão localizados nas zonas ventricular (setas vermelhas). Após 4 DIV, células em proliferação são mais dispersas e uma zona ventricular distintas não é mais mantido. (B) células necróticas foram marcados através da adição de iodeto de propídio (1μg/μL, Sigma) ao meio de cultura durante 2 horas e visualizados por microscopia de fluorescência. Depois de uma DIV, o mesencéfalo ventral (VMB) não é necrótica, mas as células propidium muitos rotulados de iodeto pode ser visto no mesencéfalo dorsal e cérebro anterior. Após 3 DIV a viabilidade celular diminui na midbra ventraldentro barra de escala: 500 mm (C) Immunostaing para caspase-3 clivada para visualizar células apoptóticas. Em 1 ou 2 DIV, poucos neurônios dopaminérgicos (TH) são apoptóticos. Após 3 DIV, neurônios dopaminérgicos começar a sofrer apoptose. Painéis no meio e à direita são ampliações de área de box nos painéis esquerdo. As imagens são projeções maiores ampliações intensidade máxima de z-stacks de 14-16 frames. Imagens foram realizadas a cada 0,5 m com uma ApoTome Zeiss set-up. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> Figura 5. Rota migratória de YFP marcado com os neurônios em uma fatia aguda. (A) Fatia horizontal usado para imagens de lapso de tempo de YFP marcado neurônios. A fatia foi incubada por 5 horas antes da imagem. Células foram rotulados com uma induzível Cre / loxP sistema 6. Shh ratos e camundongos creer 8 ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP repórter 9,re usado. Recombinação do alelo repórter ROSA (e expressão EYFP) é induzida em células que expressam creer (Shh células que expressam), mas apenas com a administração de tamoxifeno (Sigma). Neste exemplo, Tamoxifeno (3 mg/40 g peso corporal) foi administrada a ratas grávidas em E8.5. Este set-up experimental resultados principalmente na rotulagem de precursores de neurônios dopaminérgicos e seus descendentes no mesencéfalo ventral 10,11. Barra de escala: 500 mm. (B) Seguindo a rota migratória de YFP marcado com os neurônios em uma fatia aguda. Lapso de tempo imagens de YFP marcado neurônios destino mapeados foram adquiridos a cada 30 minutos durante um tempo total de 5 horas e 30 min em um microscópio Zeiss Axio Observer (CE objetivo PlnN 10x / 0,3). Cortes foram incubados em estufa BOD (incubadora XLS1 Pecon) a 37 ° C e é fornecido com 5% de CO 2 durante a criação de imagens. A posição inicial das células é marcado com setas vermelhas; posições de migração são marcadas com asteriscos vermelhos.

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	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

O método de cultura organotípicas fatia aqui apresentada fornece um sistema para o curto prazo in vitro de análise de desenvolvimento de neurônios dopaminérgicos e suas rotas migratórias e projeção no mesencéfalo ventral embrionárias. Descobrimos que há uma série de etapas críticas do protocolo que deve ser cuidadosamente atendidos, a fim de obter fatias que permitem o desenvolvimento normal dos neurônios do mesencéfalo ventral dopaminérgicos. O passo mais crítico é a dissecação do cérebro ...

Tabela de reagentes e equipamentos específicos <table border="1"><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Com L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> preparar ações de 200mm e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure agarose LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Insere Millicel </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-prato de 35 mm, de baixa </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Gilete </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl cola </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Dia Colher perfurada 15 mm de diâmetro </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps 5 Dumoxel </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Anticorpos utilizados para reações imunoistoquímicas: <table border="1"><tr><td&gt; Nome do anticorpo </td><td> Companhia </td><td > Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Hidroxilase anti-tirosina coelho </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Rato anti-tirosina hidroxilase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Rato anti-BrdU </td><td> BD PharMingen </td><td> 555627 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr><tr><td> De coelho anti-caspase 3 clivada </td><td> Tecnologia de sinalização celular </td><td> 9661 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr><tr><td> Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Donkey anti-mouse IgG-Cy3 </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 715-165-150 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

O mouse é um organismo excelente modelo para estudar o desenvolvimento do cérebro dos mamíferos, devido à abundância de dados moleculares e genéticos. No entanto, o cérebro do rato em desenvolvimento não é adequado para fácil manipulação e de imagem in vivo desde o embrião de rato é inacessível e opaco. Culturas fatia organotípicas de cérebros embrionárias são, portanto, amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento do cérebro de camundongos in vitro. Ex-vivo de manipulação ou o uso de camundongos transgênicos permite a modificação da expressão do gene para que subpopulações de células neuronais ou gliais podem ser rotulados com proteínas fluorescentes. O comportamento de células marcadas podem então ser observadas utilizando lapso de tempo de imagem. Lapso de tempo de imagem tem sido particularmente bem sucedido para estudar comportamentos de células que sustentam o desenvolvimento do córtex cerebral na tarde estágios embrionários 1-2. Embrionárias sistemas fatia organotípicas cultura em regiões do cérebro fora da parte frontal do cérebro são Establis menos bemhed. Portanto, a riqueza de dados time-lapse imagem descrevendo a migração celular neuronal é restrito a parte frontal do cérebro 3,4. Ainda não é conhecido, se os princípios descobertos para o cérebro dorsal são verdadeiras para áreas do cérebro ventral. Ventral do cérebro, os neurônios são organizados em grupos neuronal ao invés de camadas e muitas vezes eles têm que se submeter complicadas trajetórias migratórias para chegar a sua posição final. Mesencéfalo ventral não é apenas um sistema bom modelo para o desenvolvimento cerebral ventral, mas também contém populações neuronais tais como neurônios dopaminérgicos que são relevantes nos processos de doença. Enquanto a função e degeneração de neurônios dopaminérgicos tem sido investigada em grande detalhe no adulto e envelhecimento cerebral, pouco se sabe sobre o comportamento desses neurônios durante a sua diferenciação e fase de migração, 5. Descrevemos aqui a geração de culturas fatia do dia embrionário (E) do mesencéfalo ventral de rato 12,5. Estes cult fatiamentos são potencialmente adequado para o monitoramento do desenvolvimento dos neurônios dopaminérgicos durante vários dias in vitro. Destacam-se os passos críticos na geração de fatias do cérebro nesses estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e discutir as condições necessárias para manter o desenvolvimento normal de neurônios dopaminérgicos in vitro. Também apresentam resultados de experimentos de tempo de imagem lapso. Nesses experimentos, mesencéfalo ventral de precursores (incluindo precursores dopaminérgicos) e seus descendentes foram rotulados de uma forma de mosaico usando um Cre / loxP baseada induzível sistema de mapeamento destino 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

organotypic-slice-cultures-embryonic-ventral-midbrain-system-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

17.8K visualizações.  University of Bonn. Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurociência

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...