Gostaríamos de agradecer as Dras. James Bowie e Salem Faham para fornecer conhecimentos técnicos e orientação sobre o método e bicelle Aviv Dr. Paz para discussões úteis. Reconhecemos Le Du para suporte experimental. Rachna Ujwal tem interesse financeiro em MemX Biosciences LLC, que, no entanto, não apoiar este trabalho. Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (RO1 GM078844).

Bicelle cristalização base é composta por quatro passos básicos (Figura 2): i) preparação de um lipídio bicelle formando: mistura anfifílico; ii) incorporação de proteína purificada no meio bicelle; iii) Os ensaios de cristalização (manualmente ou robotically) e iv) visualização de extração de cristal, e de congelamento. Essas etapas são descritas em detalhes abaixo 1. Preparação de Bicelles Bicelles pode se formar em uma variedade de lipídios: combinações anfifílico e em uma ampla faixa de concentrações. Portanto, uma composição baseada inicial sobre as condições anteriores de sucesso é recomendado (Tabela 1). A mistura de maior sucesso é o DMPC: CHAPSO bicelle formulação, que pode ser adquirido comercialmente como uma formulação pré-misturada ready-to-use (ver Tabela de Reagentes abaixo) ou preparadas em laboratório, conforme descrito. Para este exercício vamos preparar 1 ml de DMPC 35%: mistura CHAPSO na proporção 2,8:1 molar. <ol><li&gt; Pesar 0,26 g DMPC (Sr. 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (Sr. 630,9 g / mol) e adicione água deionizada para um volume final de 1,0 ml. <ul type="disc"><li> O percentual bicelle pode variar entre 10% -40% com uma DMPC: razão molar CHAPSO desde 2.6-3.0:1 (Tabela 1). </li><li> Nota: Quanto maior a concentração bicelle o mais difícil é para dissolver o lipídio, resultando em uma viscosidade mais elevada solução. No entanto, uma formulação bicelle concentrada pode ser vantajoso quando a concentração de proteína é baixo. </li></ul></li><li> Dissolvendo os lipídios para obter uma solução homogênea requer um esforço considerável, tornando este o passo mais demorado no método bicelle. Percorrer os seguintes passos até que o DMPC está completamente misturado: <ol><li> Aquecer a mistura para ~ 40 ° C em banho-maria ou uma incubadora e vortex de ~ 1 minuto. <ul type="disc"><li> Nota: Como mais ciclos são realizados, o aquecimento da mistura resultará em uma con gel-likecia o que torna difícil vortex. </li></ul></li><li> Arrefecer a mistura sobre o gelo e vortex por alguns minutos. Cooling ajuda a liquefazer a solução facilitando a vortex. <ul type="disc"><li> Nota: Como mais ciclos são realizados, a mistura pode tornar-se turva com o resfriamento. </li></ul></li><li> Repita os passos listados acima (1.2.1 e 1.2.2) até que o lipídio é completamente dissolvido. <ul type="disc"><li> Nota: Este processo pode demorar várias horas. Formação Bicelle é indicado pelas mudanças no comportamento de fase da DMPC: formulação CHAPSO. Após a conclusão, a mistura será um gel transparente em ou acima da temperatura ambiente e um líquido viscoso no gelo. </li></ul></li></ol></li><li> A mistura bicelle está pronto para usar e pode ser mantido a -20 ° C para armazenamento de longo prazo (até 5 anos). Devido ao risco de hidrólise do grupo cabeça de fosfolipídios, não é aconselhável para armazenar bicelles à temperatura ambiente por longos períodos. </li></ol> 2. Incorporação de proteína em bicelles A maioria das estruturas MP obtidos bicelles foram cristalizados em DMPC: CHAPSO bicelle concentração variando de 2 a 8% usando uma concentração de proteína de 8 a 12 mg / ml (Tabela 1). Se possível, as telas iniciais devem usar essas orientações e concentrações adicionais podem ser selecionados na fase de otimização. Em comparação com o método LCP, a incorporação de proteínas com bicelles é um processo simples (Figura 3), que deve ser feito no mesmo dia como ensaios de cristalização. <ol><li> Descongele o DMPC: CHAPSO mistura bicelle à temperatura ambiente até as mudanças de fase para um gel transparente. <ul type="disc"><li> Nota: Vários freeze-thaws não vai afetar o comportamento bicelle. </li></ul></li><li> Coloque a mistura em gelo para liquify e brevemente vortex para restabelecer uma fase bicelle homogênea. Quando colocado sobre o gelo a mistura torna-se turva. </li><li> From esse ponto em diante, manter a mistura bicelle e proteína purificada no gelo. Isto irá manter o bicelle em uma fase líquida tornando-o passível de pipetagem. </li><li> Adicione a mistura bicelle à proteína purificada detergente solubilizado em uma proporção de 1:4 (V / V). <ul type="disc"><li> Por exemplo: 100 mistura proteína-bicelle mL é obtido através da mistura de 80 mL de proteína com 20 bicelle mL. Se a concentração de proteína é de 15 mg / ml ea concentração bicelle é de 35%, isto dará uma mistura de proteínas bicelle-incorporada com uma concentração de proteína de 12 mg / ml e uma concentração bicelle de 7%. </li></ul></li><li> Misture com cuidado pipetando o conteúdo cima e para baixo até que a solução torna-se clara e homogênea. <ul type="disc"><li> Nota: Se surgirem bolhas, um giro rápido (30-60 segundos, 13000 rpm, 4 ° C) com uma centrífuga de mesa pode ajudar a removê-los. </li></ul></li><li> Incubar a mistura sobre o gelo por pelo menos 30 min para promover a incorporação completa de proteínas into bicelles. A mistura de proteínas bicelle está agora pronto para ensaios de cristalização. </li></ol> 3. Criação de ensaios de cristalização Técnicas de cristalização de lipídios outras como a LCP exige equipamento especializado, devido à alta viscosidade do meio, mas o comportamento de fase única de bicelles permite aplicação em praticamente todos os formatos de cristalização qualquer padrão, incluindo robótica (Figura 3). Ensaios de cristalização pode ser realizada em qualquer suspensão ou estar usando formatos padrão de queda telas disponíveis no mercado. <ol><li> Se a criação de bandejas manualmente ou usando um robô de cristalização, manter a mistura de proteína bicelle-on ice. Isto irá manter o frio mistura protéica bicelle e garantir que a viscosidade da solução é mínima. </li><li> Ensaios de cristalização Manual - Com uma pipeta padrão, a mistura de proteína bicelle pode ser misturado com uma solução reservatório da mesma maneira como realizar normalmenteed para proteínas de membrana solúvel ou detergente solubilizado. <ul type="disc"><li> Nota: Mantenha a mistura proteína-bicelle em gelo durante os ensaios. </li></ul></li><li> Ensaios de cristalização robótico - Temos adaptados estes ensaios para o robô cristalização Mosquito, mas, em princípio (seguir as mesmas precauções) a técnica deve ser compatível com todos os robôs de cristalização. As dicas a seguir irão garantir que a mistura de proteína bicelle mantém-se fresco e com precisão pipetado pelo robô: <ol><li> Precool a placa segurando a mistura proteína-bicelle, colocando-o no gelo. </li><li> Pipeta a mistura proteína-bicelle na placa e continuar a manter a placa de gelo. Esta placa deve ser o último item a ir no robô antes de começar a correr. </li><li> Set-up na bandeja do reservatório e tampas de cristalização na plataforma 3 e 5, respectivamente, do robô mosquito. </li><li> Coloque a placa contendo proteínas bicelle mistura na plataforma 4do robô mosquito. Isso garante a mistura de proteína bicelle é o último a ser pego pelo robô e é liberada imediatamente. </li><li> Para evitar um aquecimento e aumento da viscosidade, não misture o reservatório com a mistura de proteínas bicelle. </li><li> Ao realizar várias telas, retornou imediatamente a placa bicelle proteína para o gelo para o resfriamento, logo que uma corrida seja concluída. </li></ol></li><li> Volume da gota e ratio (proteína: reservatório) pode ser escolhida como para ensaios de cristalização convencional. Por exemplo, ensaios de cristal inicial usando o robô Mosquito pode ser configurada usando 0,25 mL de proteína: mistura bicelle mais 0,25 mL reservatório. </li><li> Incubar os ensaios de cristal em uma câmara a 20 ° C. Temperatura é uma boa triagem e parâmetro de otimização, porque o comportamento de fase de bicelles é dependente da temperatura. <ul type="disc"><li> Temperaturas mais elevadas induzem a fase lamelar 12 (Figura 1), que tem a vantagem de pré-organizaçãoa proteína em camadas. Temperaturas abaixo de 20 ° C pode ser selecionado, mas você não deve ir abaixo de 4 ° C uma vez que este pode causar os lipídios para precipitar durante longos períodos de tempo. </li></ul></li><li> Da mesma maneira como ensaios de cristalização tradicionais, ensaios bicelle deve ser monitorado em uma base regular para a aparência de cristal e de crescimento. Recomendamos para verificar as bandejas no 1 º e 3 º dia pós-instalação seguido por inspeção semanal. </li><li> Otimização de cristal pode ser realizado através de métodos de rotina usado em cristais detergente baseada incluindo o rastreio de grade, o rastreio aditivo, alterando etc temperaturas Além disso, a porcentagem bicelle e relação proteína: bicelle pode ser variada. Além disso, bicelles pode ser dopado com lipídios específicos que possam ser necessárias para a estabilidade da proteína ou função. </li></ol> 4. Visualização de extração de cristal, e de congelamento Desde os ensaios de cristal com a mistura de proteína bicelle-<html> tem uma viscosidade semelhante à proteína-detergente gotas, visualização e extração de cristal é rotina e é realizado como tradicional set-ups. <ol><li> Visualização: Em contraste com a mídia LCP que muitas vezes exige alta qualidade de iluminação com luz normal e polarizada para detecção de cristal, a visualização não seja dificultado pela bicelles. Gotas de cristal colorido, bem como incolor proteína pode ser facilmente analisados ​​usando microscópios padrão e nenhum equipamento especial é necessário. </li><li> Bicelles, como qualquer outro meio lipídico, tendem a produzir uma alta porcentagem de falsos positivos. Um microscópio UV ajuda muito na diferenciação de proteínas a partir de cristais de sal (Figura 4). </li><li> Extração e congelamento: a extração de cristal e congelamento é relativamente simples e não requer a dissolução da mídia bicelle circundante. Além disso, a fase bicelle próprio fornece alguns moderada crio-proteção. </li></ol> 5. Resultados representativos: <html> nt &quot;&gt; Geralmente, leva 2-3 dias para aparecer e cristais para aproximadamente uma semana ou mais para que cresçam ao seu tamanho máximo. Este foi o caso de bacteriorodopsina e canal de ânion do mouse voltagem-dependentes 1 (mVDAC1) cristais de 4,8 . Para outras proteínas da membrana que pode levar várias semanas para o crescimento de cristal, por isso é importante continuar a acompanhar os ensaios de cristal muito além das primeiras semanas. Tal como com outros meios de comunicação lipídico, bicelles tendem a formar formas que podem aparecer a ser cristalina. Também foi observado que elas conduzem a uma maior percentagem de sal e cristais de detergente. A UV-microscópio que detecta a fluorescência de triptofano pode significativamente ajudar a eliminar tais não-proteico de falsos positivos. A Figura 4 mostra as formas de lipídios, sal e cristais de proteínas como vistas à luz visível e UV para ajudar a distinguir os diferentes resultados que podem ser observadas. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Bicelle esquemática. Bicelles são compostos de uma molécula de lipídio bicamada formando como DMPC (azul) e um anfifílico como CHAPSO (verde), que protege as bordas hidrofóbicas da bicamada. Como a temperatura é aumentada, como disc-bicelles passar por uma transformação de fase em uma chapa perfurada 12 lamelar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxograma para o método de cristalização bicelle delineando os quatro passos básicos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Figura 3. Ensaios Cristal esquemática set-up. Proteínas purificadas detergente solubilizado de membrana podem ser diretamente misturado com bicelles no gelo simplesmente pipetagem o conteúdo juntos. Após incubar a mistura proteína / bicelle no gelo para ensaios ~ 30 minutos, a cristalizaçãopode ser configurado com qualquer formato standard, incluindo robótica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Figura 4. Visualização de ensaios de cristal. Imagem visível (painel superior) e de imagem UV (painel inferior) de (A) da agulha em forma de cristais observados em uma condição-sal apenas. Ausência de fluorescência pode ser detectada a partir dos cristais, uma indicação de falso positivo. (B) Rod-shaped cristal formado em uma condição MPD. O cristal de fluorescência fraca, mas foi encontrado para ser não-proteico usando difração de raios X. (C) Crystal observadas cerca de quatro semanas após a criação de testes. A fluorescência sob luz UV forte confirma que é um cristal de proteína. <table border="1"><tbody><tr><td> Não. </td><td> Proteína </td><td> Fonte </td><td> Formulação Bicelle </td><td> Proteína Concentratiem </td><td> Detergente 1 </td><td> Resolução (Å) </td><td> Referência </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorodopsina 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2,0 </td><td> Faham e Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1,8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenérgicos / complexo Fab </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltagem-dependentes canal anion 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2,3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, NM 5% </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1,9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Protease rombóide </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2,6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Glucoside nonil </td><td> 1,7 </td><td> Vinothkumar de 2011 </td></tr></tbody></table> Um detergente usado para purificação de proteínas de membrana 2 Native lipídios das membranas roxo pode ser realizada ao longo durante a depuração Tabela 1. Resumo das condições de cristalização de estruturas de proteínas de membrana resolvidos usando bicelles.

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	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Bicelles são uma mídia única lipídico que oferecem um ambiente bicamada-like nativa, enquanto se comportando como se solubilizados pelos detergentes. Esta propriedade dá bicelles uma vantagem distinta sobre outros métodos de lipídios baseados em cristalização, pois não há curva de aprendizagem ou equipamento especializado necessário para esta técnica. Uma vez bicelles estão disponíveis, seja comercial ou preparados em laboratório, eles podem estar diretamente misturado com proteína purificada e deste po...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Proteínas da membrana (MPs) desempenham um papel fundamental em muitos processos fisiológicos como o bombeamento de moléculas específicas através da bicamada de membrana de outra forma impermeável que circunda todas as células e organelas. Alterações na função do resultado MPs em muitas doenças e distúrbios humanos, portanto, uma compreensão complexa das suas estruturas continua a ser um objectivo fundamental para a pesquisa biológica. No entanto, a determinação da estrutura de deputados continua a ser um desafio significativo, muitas vezes decorrentes de sua hidrofobicidade. MPs têm substancial regiões hidrofóbicas embutido dentro da bicamada. Detergentes são freqüentemente usados ​​para solubilizar estas proteínas a partir da bicamada gerando uma micela da proteína-detergente que podem ser manipulados de forma semelhante como proteínas solúveis. Tradicionalmente, os ensaios de cristalização continuar usando uma mistura de proteína-detergente, mas eles muitas vezes resistem a cristalização ou produzir cristais de má qualidade. Estes problemas surgem devido aoincapacidade de detergente para imitar a bicamada adequadamente, resultando em pouca estabilidade e heterogeneidade. Além disso, os escudos de detergente a superfície hidrofóbica do MP reduzindo a área de superfície disponível para contatos de cristal. Para contornar esses inconvenientes MPs pode ser cristalizada na mídia lipídico, que mais de perto simula seu ambiente endógeno, e recentemente se tornou uma técnica de novo para a cristalização MP. Fase cúbicos lipídico (LCP) é uma bicamada lipídica tridimensional penetrado por um sistema interligado de canais aquosa 1. Embora monoolein é o lipídio de escolha, lipídios relacionados, tais como monopalmitolein e monovaccenin também têm sido usados ​​para fazer LCP 2. MPs são incorporados ao LCP onde difusa em três dimensões e núcleos de cristal feed. A grande vantagem da LCP é que a proteína permanece em um ambiente mais natural, mas o método tem uma série de desvantagens técnicas, incluindo Visc altaosity (exigindo aparelhos especializados) e dificuldades na visualização e manipulação de cristal 3,4. Devido a estas dificuldades técnicas, utilizamos outro meio lipídico para a cristalização-bicelles 5,6 (Figura 1). Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico formado pela mistura de um lipídio fosfatidilcolina (DMPC) com um anfifílico (CHAPSO) ou um lipídio de cadeia curta (DHPC). Dentro de cada disco bicelle, as moléculas de lipídios gerar uma bicamada, enquanto a linha de moléculas anfifílico as bordas apolar fornecendo propriedades benéficas de ambas as bicamadas e detergentes. Importante, abaixo de sua temperatura de transição, proteína bicelle-misturas têm uma viscosidade reduzida e são manipulados de forma semelhante como detergente solubilizado MPs, fazendo bicelles compatível com robôs de cristalização. Bicelles tem sido utilizado com sucesso para cristalizar proteínas de membrana várias 5,7-11 (Tabela 1). Esta coleção crescentede proteínas demonstra a versatilidade do bicelles para cristalizar o alfa helicoidal e deputados folha beta a partir de fontes procariotas e eucariotas. Devido a estes êxitos e da simplicidade de alto rendimento, implementação bicelles deve ser parte do arsenal cada cristalógrafo proteína membrana. Neste vídeo, descrevemos a metodologia bicelle e fornecer um protocolo passo a passo para a criação de estudos de alto rendimento cristalização de MPs purificada usando a robótica padrão.

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico que mantêm as proteínas da membrana (MPs) dentro de uma bicamada lipídica, mas têm comportamento de fase única que facilita high-throughput screening por robôs de cristalização. Esta técnica, com sucesso, produziu uma série de alta resolução de estruturas de ambas as fontes procariotas e eucariotas. Este vídeo descreve os protocolos para gerar a mistura bicelle lipídico, incorporando MPs na mistura bicelle, a criação de cristalizações ensaios (manualmente, assim como robotically) e cristais de colheita do meio.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.6K visualizações.  University of California Los Angeles. Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico que mantêm as proteínas da membrana (MPs) dentro de uma bicamada lipídica, mas têm comportamento de fase única que facilita high-throughput screening por robôs de cristalização. Esta técnica, com sucesso, produziu uma série de alta resolução de estruturas de ambas as fontes procariotas e eucariotas. Este vídeo descreve os protocolos para gerar a mistura bicelle lipídico, incorporando MPs na mistura bicelle, a...

Vídeo: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...