Este laboratório tem sido apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada, e da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá (MSSC). GSTs foi o destinatário de uma Studentship Doutorado da MSSC. Somos gratos a Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) para muitas discussões úteis e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a Biotium por sua generosa oferta de NucView adicionais 488 caspase-3.

1. Descongelamento e cultura de células <ol><li> Obtenção de estoque de congelados imortalizado N19-oligodendroglial células do tempo de armazenamento de nitrogênio líquido termo. </li><li> Frasco contendo células mergulhar a 37 ° C banho-maria até que a suspensão celular é completamente descongelado. </li><li> Adicionar 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado de Médio Eagle) com glicose alta suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma placa de cultura de 10 cm. </li><li> Adicione o celular suspensão gota a gota, à placa, e agite suavemente e rock a placa de Petri para dispersar as células uniformemente. </li><li> Células de cultura a 34 ° C / 5% da incubadora de CO 2. </li><li> Após 4 horas, media aspirado de placas para remover qualquer DMSO restante (dimetilsulfóxido), que tinha sido usado como crioprotetor, e substituir por novas mídias (7 mL DMEM alta glicose meio suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina) . </li></ol> 2. Células Passaging <ol><li> Em 70-80%confluência (4-7 dias de crescimento), aspirado de mídia a partir de células. </li><li> Adicionar 1 mL de tripsina 0,25% ao prato. Pipeta de tripsina para separar células (cerca de 5 minutos). </li><li> Faça as diluições apropriadas para as condições experimentais e passagem de uma placa adicional de 10 centímetros para futuros experimentos com uma densidade de células não menos que 0,1 x 10 6 células / ml. </li></ol> Nota: Você deve passar suas células pelo menos duas vezes após o descongelamento antes de usá-los para experiências. 3. Contagem e cultivo de células <ol><li> Às células placa de live-célula de imagem, trypsinize como descrito anteriormente. </li><li> Remover cerca de 30 mL de células e contagem usando um hemocitómetro. </li><li> Coloque uma lamela de vidro sem revestimento em uma placa de 6 bem. Adicionar células para o bem, a uma densidade de 0,1 x 10 6 células / mL em 2 mL de fenol livre de DMEM alta glicose mídia, suplementado com 10% de SFB e 1% de penicilina / estreptomicina, em 34 ° C / 5% CO 2. </li><li> Permitircélulas a crescer durante a noite (16-20 h) em 34 ° C / 5% CO 2 antes de transfecção. </li></ol> 4. Transfecção <ol><li> Combine 100 L de soro de mídia livre, 0,5-4 mg DNA plasmidial purificado e 4 mL FuGENE HD (Roche). Vortex cuidadosamente para misturar. </li><li> Vortex novo brevemente e permitir que o DNA ao complexo por 5 min à temperatura ambiente, e depois adicionar FuGENE mistura DNA HD diretamente para as células em cultura. Incline a placa delicadamente para misturar. </li><li> Cultura as células para um adicional de 48 h em 34 ° C / 5% CO 2 antes do tratamento ou experimentação. </li></ol> 5. Células preparando para o Live-Cell Imaging (LCI) <ol><li> Ligue o Chamlide LCI caixa de controle ao vivo de células instrumento, pelo menos, 1 h antes que você queira iniciar o seu experimento. A caixa de controle também regula a temperatura ea umidade dentro do Chamlide LCI, e regula o fluxo do pré-misturados 5% CO 2. </li></ol> Nota: É aconselhávelligar a caixa de controle até 3 h antes dos experimentos início para garantir que todo o palco atinge 34 ° C. Esta etapa irá reduzir a deriva focal, que é causada por fluxulation e expansão térmica da fase de metal como se aquece, durante o exame. <ol start="2"><li> Trabalhando em um fluxo-capa, spray na câmara de cultura Chamlide magnético do tipo, e uma pinça, com etanol 70% e deixe secar por 5 minutos. </li><li> Remover as células da incubadora e confirmar que eles são saudáveis. Eles devem aparecer aderente e bem espalhado sobre a lamínula de vidro com processos de membrana numerosos. Células que estão estressados ​​de transfecção não são adequados para a experimentação, e terá um número reduzido de extensões de processos, e muitas vezes têm um núcleo de formato irregular. </li><li> Incline a placa 6-bem e retire a lamela com pinça. Rapidamente coloque o lado célula lamínula para cima no tabuleiro inferior da câmara de cultura. Não permita que a lamela para secar. </li><li> Anexar o magnético principalcorpo da câmara de cultura e adicionar 500 mL de mídia a partir da placa 6-bem original para o topo da lamela. Re-utilizar esta mídia vai diminuir a quantidade de estresse colocado sobre as células causados ​​por mudanças ambientais, e também pode ser útil para avaliar extracelular fatores secretados. </li><li> Coloque a tampa de vidro na câmara de cultura. </li><li> Use uma KimWipe pulverizadas com etanol 70% para remover qualquer material residual do fundo da lamela, o que interfere com a microscopia. </li><li> Coloque a câmara de cultura nos 34 ° C / 5% incubadora de CO 2 por 30 min. Esta etapa irá assegurar que a câmara se aquece a 34 ° C para reduzir o deslocamento da lamínula como o metal se aquece. </li></ol> 6. Configurações de microscópio Imagens foram adquiridas aqui, usando um microscópio Leica DMIRE2 invertido com uma lente relay personalizado e habitação de emissão roda de filtros de cartucho de carregamento de rodas múltiplas (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). <ol><li> Brightfield - Lâmpada para 2,5 V e tempo de exposição a 240 ms. </li><li> Red Fluorescent Protein (RFP) - Ganho fixado em 140 para 200 ms. </li><li> Proteína Verde Fluorescente (GFP) - Ganho fixado em 140 para 500 ms. </li><li> Nosso microscópio tem uma lâmpada regulável em vez de um disco de fiação para controlar a quantidade de luz disponível para as células. Corremos nossos experimentos com a luz em 90% da intensidade máxima da lâmpada. </li></ol> 7. Tratamento das células com indutores da apoptose e 488 NucView Caspase-3 de substrato <ol><li> É importante preparar grandes estoques de indutores de apoptose antes do tempo e congelá-los em alíquotas, de modo que as concentrações será consistente entre experimentos. </li><li> O NucView 488 substrato é sensível à luz. Preparar alíquotas de 15 mL para reduzir tubos de congelamento / descongelamento, e armazenar a -20 ° C coberto com papel alumínio. Trabalhar com a iluminação da sala ambiente tão baixa quanto possível para reduzir a exposição do NucVsubstrato iew 488 à luz, antes da sua utilização. </li><li> Recuperar a câmara de cultura rapidamente da incubadora para que as células não estão expostos a uma redução na temperatura. Coloque a câmara de cultura para a câmara ambiental do microscópio, e usar grampos para manter a câmara de cultura de movimento. Neste ponto, você também deve dim as luzes da sala. </li><li> Ligue o pré-misturados 5% de CO 2 tanque com regulador dual. </li><li> Usando a objetiva de 10x, foco para encontrar células no monitor do computador usando microscopia de campo brilhante. Nota: você gostaria de usar a maior abertura numérica no objectivo com a ampliação desejada para reduzir o tempo de exposição. </li><li> Entregar indutores de apoptose das células (no nosso caso 80 mM de potássio, glutamato ou 100 mM), um dos seguintes métodos podem ser usados. Nós usaremos a entrega de 80 mM de potássio como um exemplo, utilizando KCl dissolvido como um concentrado 10x no nosso meio de cultura típica. <ol><li> Media Exchange by perfusão lenta e local: - Use uma bomba peristáltica para a mídia de troca na câmara de cultura com novas mídias contendo 80 mM de potássio. - Uma final da tubulação vai entregar 10 mL de um estoque de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol, ea outra extremidade do tubo irá remover a mídia da câmara. - Você quer trocar um pelo menos 10x de mídia para garantir que o material deixado na câmara tem a concentração correta de potássio. - Depois de mídia é trocado, adicionar 3 mL de substrato NucView 488 para a mídia na câmara. Pipeta para misturar. </li><li> Adição direta de 80 mM K + e NucView 488 substrato para a mídia na câmara de cultura: - Prepare uma solução estoque de 10x de 80 mM de potássio dissolvido em DMEM livre de fenol. - Adicionar 3 mL de substrato NucView 488-50 mL de potássio mM 10x 80. Pipeta para misturar. Adicionar a 500 mL de fenol livre de DMEM em câmara de cultura. Nota: este método épreferida se você estiver interessado em manter ou avaliação do crescimento ou outros fatores secretados que podem estar presentes na mídia original. Nós descobrimos que o 488 NucView substrato é estável em cultura de células para experimentos com duração até 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-célula de imagem <ol><li> Clique no canal vermelho para mostrar células transfectadas. </li><li> Selecionar e salvar em torno de uma dúzia de quadros onde há várias células transfectadas, e salvar estes &quot;pontos estágio XY&quot;. Dependendo da quantidade de memória de computador, você pode ser limitado ao número de pontos de estágio que você será capaz de adquirir. </li><li> Ter as imagens de microscópio de captura (em brilhante campo canal, vermelho, e canal verde) nestes estágios salvos pontos a cada 6 minutos. </li><li> Qualquer coloração verde que é visível durante as fases iniciais dos experimentos provavelmente indica células que já estão em apoptose, devido normalmente a transfecção e / ou estresse ambiental. Apoptosis devido a tratamentos experimentais serão detectados em um ponto no tempo no final do experimento. </li></ol> 9. Análise estatística <ol><li> Para cada experimento, o programa de microscópio para adquirir pontos XY múltiplos para reunir um grande conjunto de dados de forma eficiente. Cada experimento é realizado em duplicata ou triplicata, e os dados são compilados a partir de experiências separadas realizadas em dias diferentes. De cada conjunto de dados, analisamos até 15 campos de ver e comparar a proporção de células caspase-negativos para caspase-células positivas (número total de células no campo de visão / número total de caspase-células positivas). </li><li> As medições gravadas de cada conjunto de dados são agrupados em um conjunto amostra maior, e depois são comparados entre si utilizando uma tabela ANOVA (p = 0,05). Nós mostramos os erros padrão da média (SEM) de cada experimento, e então comparar a diferença de meios através da realização de um teste de Tukey comparação das médias (p = 0,05) para determinar which tratamentos são significativamente diferentes umas das outras. </li></ol> 10. Resultados representante Nós descrevemos um experimento para ilustrar como o NucView 488 substrato pode indicar um aumento da taxa de apoptose de N19-OLG culturas de células após um tratamento com uma alta concentração de potássio extracelular. O N19-células foram transfectadas com RFP, e eram tratadas com 3 mL NucView 488 substrato (controle), ou 3 mL NucView 488 substrato e 80 mM [K +] (o tratamento). As células foram monitorados e as imagens foram adquiridas ao longo de um curso de tempo 12 h, que é adequado para estudos envolvendo insultos neurológicos (Figura 1A). Em condições de controle, não foram observadas quantidades significativas de apoptose em relação ao 80 mM [K +] culturas tratadas (caixa de hash), que apresentou cerca de 45% de morte celular após 12 h (Figura 1B). O sinal de fundo verde observard nas condições de controle indica as células que estão apoptose sem a adição de potássio extracelular. Praticamente nenhuma das células no controle de apoptose exibem experimentar o ponto de tempo de 12 h, embora em outras situações os experimentos podem ser obrigados a longo prazo. As imagens foram adquiridas usando uma objetiva de 10x. Bar = 100 mm. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Figura 1. (A) A 12 h experimento tempo de curso do N19 culturas OLG 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho), juntamente com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde). Culturas eram tratados com uma concentração final de 80 mM [K +] (painéis à esquerda), ou nenhum tratamento como controle (painéis à direita). Imagens foram obtidas em intervalos de 6 min e ativação significativa da caspase-3 (sinal verde) pode ser observard em culturas tratadas com 80 mM [K +] dentro do núcleo das células (caixa de hash) em comparação com o experimento de controle. (B) Percentagem de caspase-3 células (calculado pela divisão do número total de células no campo de visão por o número total de caspase-células positivas). Em comparação com condições de controle, observou-se em torno de 45% a morte das células seguintes K +-tratamento por 12 h. SVideo 1. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo e imagens de uma forma de três imagem fundida, após o tratamento com 80 mM [K +]. SVideo 2. A 12 h experimento tempo de curso do N19-OLG culturas 48 h pós-transfecção expressar RFP-MBP (canal vermelho) com 3 mL de substrato NucView 488 (canal verde), juntamente com brilhante-campo images e uma imagem de três vias mescladas. Nenhum tratamento foi aplicado para as culturas e N19-OLGs pode ser visto através da migração campo do microscópio em contraste com a cultura de células tratadas com 80 mM [K +] (compare com SVideo 1).

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Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Embora este não é o único produto fluorogênico disponíveis para a detecção de apoptose, existem várias vantagens significativas para usar o NucView 488 substrato. Um dos principais benefícios é a capacidade de acompanhar a apoptose em células vivas em tempo real, enquanto a maioria dos produtos alternativos, ou requerer a lise celular ou ter permeabilidade celular pobres. Outros benefícios incluem a alta sensibilidade para caspase-3, o reconhecimento de alta permeabilidade celular, baixa citotoxicidade, e nenhuma interferência com a progressão da apoptose. O substrato também tem fluorescência de fundo baixo até que ele é clivado e entra no núcleo, o que elimina fluorescência de fundo. A seqüência de caspase-3 reconhecimento contém 3 cargas negativas e o corante DNA-binding tem uma carga positiva 2. O DEVD-NucView 488 molécula, portanto, tem uma carga líquida negativa, o que impede a ativação e ligação do corante ao DNA em células caspase onde não está ativo. Maintaining consistência entre experimentos é necessário para ser capaz de estabelecer comparações significativas entre repetições. Um dos principais parâmetros para manter consistente é a densidade de células, como ela afeta a taxa de transfecção. Obtenção de taxas de transfecção alta em imortalizado N19-OLG culturas de células é mais difícil do que com outras linhagens de células comuns, tais como HeLa ou HEK293, e é altamente dependente de densidade, em nossa experiência 12, 13. Nossos melhores eficiências de transfecção para estas células têm sido obtidos com Fugene HD (Roche) e são normalmente cerca de 15%, mas pode chegar a mais de 30%, dependendo da construção. Contagem de células cuidado ajudará na obtenção de taxas de transfecção consistente. Também é importante para expor as células de diferentes tratamentos para o mesmo grau de estresse ambiental, particularmente quando se mede as taxas de apoptose. Especificamente, o comprimento de tempo durante o qual as células são expostas a reagentes de transfecção, ou a quantidade de exposição à luz, são importantes variáveis ​​ambientaisveis a considerar, e deve permanecer constante em experimentos. Para nossas aplicações, descobrimos que a recolha de um grande número de campos de visão fornece uma amostra suficientemente grande para fazer comparações estatisticamente significativa [Ibidem].

Tabela de reagentes e equipamentos específicos <table border="1"><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th></tr><tr><td> NucView Kit 488 Caspase-3 Ensaio para células vivas </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE reagentes de transfecção HD </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Modificado Dulbecco Eagle Medium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 milímetros vidro lamela </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnética câmara de cultura para 25 milímetros lamela </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart cultura de tecidos 10 pratos centímetros </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon de 6 pratos bem a cultura de tecidos </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

O sistema nervoso central podem experimentar uma série de tensões e traumas neurológicos, que podem ter vários efeitos adversos que acabará por levar a uma redução da população neuronal e função. Axônios danificado pode liberar moléculas excitatório glutamato, incluindo potássio, ou na matriz extracelular, que por sua vez, pode produzir mais insulto e prejuízo para as células da glia de apoio, incluindo astrócitos e oligodendrócitos 8, 16. Se o insulto persistir, as células sofrem morte celular programada (apoptose), que é regulado e ativado por um número de bem estabelecida cascatas de transdução de sinal 14. Apoptose e necrose do tecido pode ocorrer após lesão cerebral traumática, isquemia cerebral e convulsões. Um exemplo clássico de regulação por apoptose é a família de cisteína-dependente aspartato-proteases dirigidas, ou caspases. Proteases ativadas, incluindo caspases também têm sido implicados na morte celular em resposta a neuro crônicadoenças degenerativas incluindo Alzheimer, Huntington, esclerose múltipla e 4, 14, 3, 11, 7. Neste protocolo, descrevemos o uso do 488 NucView substrato caspase-3 para medir a taxa de apoptose caspase-3 mediada em imortalizado N19-oligodendrócitos culturas (OLG) celular 15, 5, após a exposição a diferentes tensões extracelular, tais como altas concentrações de potássio ou glutamato. A linhagem celular imortalizada condicionalmente-N19-OLG (representando o progenitor O2A) foi obtido de Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, e tem sido utilizado anteriormente para estudar os mecanismos moleculares de mielina expressão gênica e transdução de sinal de liderança OLG a diferenciação (por exemplo, 6, 10). Nós encontramos essa linha de células para ser robusto com respeito a transfecção com exógenos proteína básica de mielina (MBP) constrói soldados a qualquer RFP ou GFP (vermelho ou verde proteína fluorescente) 13,12. Aqui, as culturas celulares N19-OLG foram tratados com cloreto de potássio 80 mM glutamato de sódio ou 100 mM para imitar vazamento axonal na matriz extracelular para induzir a apoptose 9. Usamos um bi-funcionais substrato caspase-3 contendo uma DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 subunidade reconhecimento e um corante DNA-binding 2. O substrato rapidamente entra no citoplasma onde é clivado pela intracelular caspase-3. O corante, NucView 488 é liberado e entra no núcleo da célula onde se liga DNA e fluoresce verde a 488 nm, sinalizando apoptose. Uso do 488 caspase-3 NucView substrato permite viver de células de imagem em tempo real 1, 10. Neste vídeo, nós também descrever a cultura e transfecção de células imortalizadas N19-OLG, bem como técnicas de live-célula de imagem.

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando o<em&gt; NucView</em&gt; Caspase-3 488 substrato. Esta técnica é aplicável para ensaios de morte celular programada em tempo real em uma variedade de tipos de células e tecidos.

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K visualizações.  University of Guelph. Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando o NucView Caspase-3 488 substrato. Esta técnica é aplicável para ensaios de morte celular programada em tempo real em uma variedade de tipos de células e tecidos.

Vídeo: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analisando a atividade Neural e conectividade usando dados de EEG intracraniano com SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Despolarização Seletiva Assistida por Microfluídica das Mitocôndrias Axonais

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Revelando a ultraestrutura mitocondrial em neurônios usando microscopia STED

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Autor em destaque: Decodificando o envelhecimento mitocondrial 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...