1. Preparação do paciente <ol><li> Os pacientes são encaminhados pelo Departamento de Oncologia Médica para a excitabilidade nervosa base teste antes do início de quimioterapia. </li><li> Aptidão paciente para testes excitabilidade deve ser determinada. Os pacientes devem ser excluídos se eles têm uma história ou evidência de base neurofisiológica de neuropatia periférica, receberam tratamento de quimioterapia ou neurotóxicos existem contra-indicações para o teste de excitabilidade. </li></ol> 2. Axonais Procedimentos excitabilidade <ol><li> Realizar protocolos de excitabilidade sensorial e motora do nervo mediano, usando as semi-automatizados QTracS sistema computadorizado (Instituto de Neurologia, Queen Square, UK), um isolado linear bipolar estimulador de corrente constante (Digitimer, Welwyn Garden City, Reino Unido) e um amplificador ( Sapphire IIA, Medelec, UK). </li><li> Prepare a superfície da pele no punho e antebraço com um gel abrasivo ou almofada para reduzir a peleresistência, seguido pela aplicação de um álcool. </li><li> Preparar o local de gravação para gravações de motores com não-polarizáveis ​​eletrodos colocados sobre o ventre do músculo abdutor do polegar de brevis e um eletrodo de referência 4cm distais para gravar composto de motor potenciais de ação (MCs). </li><li> Preparar o local de gravação para gravações sensoriais - através de eletrodos colocados anel nas articulações proximal e distal para gravação e eletrodos de referência, respectivamente, para captação de potenciais compostos de ação sensoriais (CSAPs). </li><li> Coloque uma placa eletrocirúrgica terra neutro na palma da mão, com gel condutor. </li><li> Ruído elétrico na configuração de gravação deve ser removido, tanto quanto possível, utilizando uma farsa 50/60 Hz Ruído eliminador (Quest Scientific Instruments, North Vancouver, Canadá). </li><li> Estimular o nervo mediano no punho. Local de estimulação deve ser selecionada como o local de menor limiar, usando um eletrodo bipolar reposicionável e, posteriormente, um não-peletrodo olarizable. </li><li> O eléctrodo de ânodo deve ser colocado 10 cm proximal a partir do eléctrodo estimulante sobre o osso. </li><li> Monitorar a temperatura no local da estimulação durante todo o ensaio e assegurar que a temperatura é maior do que 32 ° C. </li></ol> 3. Axonais Protocolos excitabilidade <ol><li> Gravar uma curva de resposta a estímulos por incrementalmente aumentando o estímulo até que a resposta é máxima e não aumentar quando a intensidade de estímulo é ainda maior. </li><li> A amplitude de destino para o acompanhamento limiar é ajustado automaticamente a 30% -40% da amplitude máxima, correspondente à área de inclinação mais acentuada na curva de resposta a estímulos. </li><li> De acordo com a método de Bostock et al., 1998, mudanças no limiar corrente necessária para atingir o alvo de amplitude são rastreadas em linha. </li><li> Grave parâmetros excitabilidade múltiplos, incluindo limiar electrotonus (TE), ciclo de recuperação (RC) eo limiar de corrente (I / V) a relaçãotal como descrito no Kiernan et al., 2000 e et Kiernan ai., 2001. </li><li> Limiar electrotonus é avaliada usando correntes 100ms subliminares de polarização, com polarização conjunto de corrente de ± 40% de limiar de controlo (Fig. 1). A mudança na corrente limiar necessária para manter a amplitude de resposta alvo, tanto após des-e hiper-polarização é gravado. Limiar electrotonus fornece uma avaliação de condutâncias internodais e potenciais de membrana, com respostas na direcção hiperpolarizante no final do pulso de polarização (90-100 ms) fortemente associada com o potencial de membrana. </li><li> O ciclo de recuperação é avaliada utilizando um paradigma de pulso emparelhado (Fig. 2), com um estímulo de condicionamento inicial supramáxima seguida, a intervalos diferentes por um estímulo de teste (a partir de 2,5 ms a 200 ms). Após o estímulo supramáximo, é mais difícil de gerar uma resposta subsequente, denominado «refratariedade &#39;, reflectindo a inactivação de tensão-gated canais de Na +. Após o período refractário, um período de facilitação conhecido como superexcitability ocorre. </li><li> Atual limite-relação é avaliada através de correntes de polarização de 200 ms, que variam em intensidade de 50% para -100% do limiar. </li></ol> 4. Paciente <ol><li> Utilizando estas técnicas, os pacientes são avaliados de forma aguda e longitudinalmente através tratamento de quimioterapia. Para avaliar a neurotoxicidade aguda, a paciente retorna para pós-quimioterapia de avaliação no prazo de 48 horas após receber tratamento. </li><li> Para examinar a neurotoxicidade crónica, as avaliações de tomadas antes da infusão de quimioterapia são comparados longitudinalmente entre os ciclos de tratamento. </li><li> Além de testes de excitabilidade axonal, escalas de classificação convencionais clínicos devem ser usados ​​para avaliar a quimioterapia neurotoxicidade induzida, incluindo o National Cancer Institute - Common Criteria de eventos adversos Neuropatia subescala sensorial, neuropatia Pontuação total e patient-referida avaliação dos resultados. </li></ol> 5. Análise e Interpretação <ol><li> Para identificar a neurotoxicidade aguda, os resultados são comparados de pré-tratamento e pós-quimioterapia. Para avaliar o desenvolvimento de alterações longitudinais em função dos nervos, os resultados são comparados através de tratamento. Parâmetros essenciais para a avaliação incluem refratariedade, superexcitability, a extensão da alteração limiar em electrotonus limiar (hiperpolarizante 90-100 ms), além de parâmetros convencionais, tais como amplitude de pico e de latência. </li><li> Para avaliar a mudança global nos parâmetros de excitabilidade de todo o tratamento, uma pontuação excitabilidade composto é calculado. A mudança de três parâmetros - refratariedade superexcitability, e limiar electrotonus (hiperpolarizante 90-100 ms) - é resumida a partir inicial para tratamentos finais para dar um marcador global de mudança. </li></ol> 6. Os resultados representativos Exemplos de resultados excitabilidade em um tapinhaient tratada com oxaliplatina são fornecidos. Imediatamente a infusão pós-oxaliplatina, alterações agudas na excitabilidade tanto sensorial e motora desenvolvem, sugestiva de o desenvolvimento de um funcional canalopatia + Na 10 -13. No entanto, as alterações significativas nos parâmetros de excitabilidade múltiplas desenvolve progressivamente ao longo do tratamento de oxaliplatina apenas em axónios sensoriais, com axónios do motor não afectados (Fig. 3), reflectindo danos sensorial generalizada axonal e mudança potencial de membrana. Este padrão corresponde à expressão clínica dos sintomas em neurotoxicidade induzida por oxaliplatina crônica. Mudanças na excitabilidade axônios sensitivos precede reduções na amplitude pico avaliada utilizando técnicas convencionais de condução do nervo, e sugerem que as técnicas de excitabilidade axonal pode fornecer uma ferramenta de avaliação sensível para a neurotoxicidade induzida por oxaliplatina cedo. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3439/3439fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; Threshold electrotonus, retratando formas de onda em resposta a subliminar prolongada corrente de polarização (100 ms), com direção hiperpolarizante plotados no quadrante inferior (azul) e direção despolarizante plotados no quadrante superior (vermelho). Abaixo é o estímulo aplicado a forma de onda para gerar a resposta electrotonus limiar. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3439/3439fig2.jpg" /> Figura 2. Ciclo de recuperação da excitabilidade, demonstrando a sequência característica de alterações na sequência de excitabilidade condução do impulso, com um período de excitabilidade reduzida (refratariedade) até 3 ms após um estímulo supramáximo, seguido por um período de aumento da excitabilidade (superexcitability) atingindo um máximo de 5 -7 ms e, subsequentemente, a excitabilidade reduzida (subexcitability). O protocolo de estímulo emparelhado pulso paradigma é inserido. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3439/3439fig3.jpg" /> Figora 3. mudanças excitabilidade em axônios sensitivos oxaliplatina pacientes tratados, com valores basais mostradas em gravações negras e pós-tratamento mostrados em branco, após 4-6 meses de tratamento com oxaliplatina. Essas mudanças são pensados ​​para refletir dano axonal generalizado e mudança potencial de membrana. Um retrato da excitabilidade set-up dentro do ambiente oncológico é mostrado à esquerda. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3439/3439fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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	<li>Hausheer, F. H., Schilsky, R. L., Bain, S., Berghorn, E. J., Lieberman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+management,+and+evaluation+of+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy.">Diagnosis, management, and evaluation of chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> Semin. Oncol. 33, 15-49 (2008).</li><li>Park, S. B., Krishnan, A. V., Lin, C. S., Goldstein, D., Friedlander, M., Kiernan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+chemotherapy-induced+neurotoxicity+and+the+potential+for+neuroprotective+strategies.">Mechanisms underlying chemotherapy-induced neurotoxicity and the potential for neuroprotective strategies.</a> Curr. Med. Chem. 15, 3081-3094 (2008).</li><li>Park, S. B., Lin, C. S., Krishnan, A. 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D., Ubiali, E., Catalano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+reduced+gluthathione+on+oxaliplatin-based+chemotherapy+in+advanced+colorectal+cancer:+a+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Neuroprotective effect of reduced gluthathione on oxaliplatin-based chemotherapy in advanced colorectal cancer: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial.</a> J. Clin. Oncol. 20, 3478-3483 (2002).</li><li>Lehky, T. J., Leonard, G. D., Wilson, R. H., Grem, J. L., Floeter, M. 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Não temos nada a divulgar.

Neuropatia induzida por quimioterapia é um efeito colateral grave do tratamento do cancro, que podem afectar o curso do tratamento e produzir longa duração deficiência paciente. Há uma falta de medidas de avaliação sensível e objetiva para mensurar especificamente a disfunção do nervo em pacientes tratados de quimioterapia. O desenvolvimento clínico de técnicas de excitabilidade axonal forneceu informações úteis e preditivos para a avaliação da quimioterapia neurotoxicidade induzida. Ao fornecer informações sobre a função do canal de íons, potencial de repouso, e função da membrana axonal, estas técnicas permitem insights sobre os processos fisiopatológicos subjacentes disfunção axonal em pacientes com câncer tratados com quimioterapia. Além disso, as técnicas de excitabilidade axonais têm demonstrado ser viável na configuração oncologia clínica, e um único teste pode ser completado em 5-10 minutos. Em pacientes tratados com oxaliplatina, técnicas de excitabilidade axonais fornecerum biomarcador sensível que permite a identificação precoce de pacientes em risco de neurotoxicidade grave. Em comparação com estudos de condução nervosa convencionais que identificam oxaliplatina danos nervosos causados ​​por apenas após a perda axonal já ocorreu, estudos excitabilidade axonal fornecer marcadores preditivos de disfunção do nervo antes da perda axonal. Como tal, os estudos de excitabilidade axonais podem ser utilizados para fornecer a avaliação da função do nervo em ensaios clínicos de potenciais estratégias neuroprotectores, para determinar a eficácia neuroprotectora objectivamente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamentos e Materiais </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Programa QTracS </td><td> Digitimer, Instituto de Neurologia, Queen Square, UK </td></tr><tr><td> DS5 isolado linear bipolar estimulador de corrente constante </td><td> Digitimer </td></tr><tr><td> Sapphire Amplificador IIA </td><td> Medelec </td></tr><tr><td> Farsa 50/60 Hz Ruído eliminador </td><td> Busca Scientific Instruments </td></tr><tr><td> Não-polarizáveis ​​eletrodos </td><td> Unomedical </td></tr><tr><td> Electrosurgical neutro placa Terra </td><td> Unomedical </td></tr></tbody></table>

nerve excitability assessment in chemotherapy-induced neurotoxicity

Induzida por quimioterapia neurotoxicidade é uma consequência grave do tratamento do cancro, que ocorre com alguns dos 1,2 quimioterapias mais comumente utilizado. Induzida por quimioterapia neuropatia periférica produz sintomas de dormência e formigamento nos membros e podem evoluir para dificuldades com habilidades motoras finas e pé, levando ao comprometimento funcional. Além de produzir sintomas perturbadores, neuropatia induzida por quimioterapia pode limitar o sucesso do tratamento levando a uma redução da dose ou cessação do tratamento precoce. Os sintomas neuropáticos podem persistir a longo prazo, deixando danos permanentes do nervo em pacientes com um prognóstico outra boa 3. Como a quimioterapia é utilizada mais frequentemente como uma medida preventiva, e aumentar as taxas de sobrevivência, a importância de neurotoxicidade de longa duração e significativa irá aumentar. Não há opções estabelecidas neuroprotetoras ou tratamento ea falta de métodos de avaliação sensíveis. Adequado doavaliação iate de neurotoxicidade será crucial como fator prognóstico e como parâmetros adequados para futuros estudos de neuroproteção. Os métodos atuais para avaliar a gravidade da neuropatia induzida por quimioterapia utiliza escalas de classificação clínico-base que tenha sido demonstrada sensibilidade falta para mudar e inter-observador objetividade 4. Os estudos de condução convencionais nervosas fornecer informações sobre potencial de ação composto amplitude e velocidade de condução, que são relativamente não-medidas específicas e não fornecer a introspecção em função do canal de íon ou potencial de repouso da membrana. Assim, estudos prévios demonstraram que estudos de condução de nervos convencionais não são sensíveis às alterações precoce em quimioterapia neurotoxicidade induzida 4-6. Em comparação, os estudos de excitabilidade nervosas utilizar técnicas de rastreio de limiar que têm sido desenvolvidos para permitir a avaliação de canais iónicos, bombas e permutadores in vivo em grandes mielinizados axónios humanos7-9. Técnicas de excitabilidade nervosas foram estabelecidas como uma ferramenta para examinar o desenvolvimento e severidade da induzida por quimioterapia neurotoxicidade 10-13. Que compreende um certo número de parâmetros de excitabilidade, estudos excitabilidade nervosas pode ser usado para avaliar a neurotoxicidade aguda resultante infusão imediatamente a seguir e para o desenvolvimento de neurotoxicidade, crónica cumulativa. Técnicas de excitabilidade nervosa são viáveis ​​na prática clínica, a cada teste que requer apenas 5 -10 minutos para completar. Equipamento de excitabilidade do nervo é prontamente disponíveis comercialmente, e um sistema portátil, foi concebida de modo a que os pacientes podem ser testados in situ na configuração centro de infusão. Além disso, estas técnicas podem ser adaptados para utilização no quimioterapias múltiplas. Nos pacientes tratados com a oxaliplatina quimioterapia, principalmente utilizado para o cancro colo-rectal, as técnicas de excitabilidade nervosas proporcionar um método para identificar pacientes umat-risco de neurotoxicidade antes do início da neuropatia crónica. Estudos excitabilidade nervosa revelaram o desenvolvimento de uma aguda canalopatia Na + em axónios do motor e sensorial 10-13. É importante ressaltar que pacientes que demonstraram mudanças na excitabilidade no início do tratamento foram, posteriormente, mais propensos a desenvolver moderada a severa neurotoxicidade 11. No entanto, através de tratamento, marcantes mudanças longitudinais foram identificados apenas em axónios sensoriais que eram capazes de prever o resultado clínico neurológico em 80% dos pacientes 10. Estas alterações demonstrou um padrão diferente aos observados agudamente, após infusão de oxaliplatina, e muito provavelmente reflectem o desenvolvimento de dano axonal significativa e de mudança potencial de membrana em nervos sensoriais que se desenvolve longitudinalmente, durante o tratamento de oxaliplatina 10. Alterações significativas desenvolvidas durante o tratamento precoce, antes de qualquer redução de medidas convencionais de função do nervo, sugerindo que a exparâmetros citability pode fornecer um biomarcador sensível.

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Nerve Excitability Assessment in Chemotherapy-induced Neurotoxicity

Este resumo descreve um novo método para avaliar o desenvolvimento de neurotoxicidade em pacientes que receberam tratamento de quimioterapia. Enquanto os métodos de avaliação convencionais são limitados em sua capacidade de detectar precocemente alterações em função dos nervos, as técnicas de excitabilidade nervosa fornecer a identificação precoce de pacientes em risco de neurotoxicidade grave e insights sobre a fisiopatologia.

Avaliação do nervo Excitabilidade em induzida por quimioterapia Neurotoxicidade

Chemotherapy-induced neurotoxicity is a serious consequence of cancer treatment, which occurs with some of the most commonly used chemotherapies1,2. ...

nerve-excitability-assessment-in-chemotherapy-induced-neurotoxicity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.0K visualizações.  University of New South Wales. Este resumo descreve um novo método para avaliar o desenvolvimento de neurotoxicidade em pacientes que receberam tratamento de quimioterapia. Enquanto os métodos de avaliação convencionais são limitados em sua capacidade de detectar precocemente alterações em função dos nervos, as técnicas de excitabilidade nervosa fornecer a identificação precoce de pacientes em risco de neurotoxicidade grave e insights sobre a fisiopatologia.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Neurociência

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Avaliação da função neuromuscular Usando percutânea Estimulação Elétrica Nervosa

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and latency detect chronic axon loss and demyelination, respectively. Axonal excitability techniques &#34;by threshold tracking&#34; expand upon these measures by providing information regarding the activity of ion channels, pumps and exchangers that relate to acute function and may precede degenerative events. As such, the use of axonal excitability in animal models of neurological disorders may provide a useful in vivo measure to assess novel therapeutic interventions. Here we describe an experimental setup for multiple measures of motor axonal excitability techniques in the rat ulnar nerve.
The animals are anesthetized with isoflurane and carefully monitored to ensure constant and adequate depth of anesthesia. Body temperature, respiration rate, heart rate and saturation of oxygen in the blood are continuously monitored. Axonal excitability studies are performed using percutaneous stimulation of the ulnar nerve and recording from the hypothenar muscles of the forelimb paw. With correct electrode placement, a clear compound muscle action potential that increases in amplitude with increasing stimulus intensity is recorded. An automated program is then utilized to deliver a series of electrical pulses which generate 5 specific excitability measures in the following sequence: stimulus response behavior, strength duration time constant, threshold electrotonus, current-threshold relationship and the recovery cycle.
Data presented here indicate that these measures are repeatable and show similarity between left and right ulnar nerves when assessed on the same day. A limitation of these techniques in this setting is the effect of dose and time under anesthesia. Careful monitoring and recording of these variables should be undertaken for consideration at the time of analysis.

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Axonal excitability techniques provide a powerful tool to examine pathophysiology and biophysical changes that precede irreversible degenerative events. This manuscript demonstrates the use of these techniques on the ulnar nerve of anesthetized rats.

Na Vivo Medida eletrofisiológica do nervo Ulnar rato com teste de excitabilidade Axonal

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and faster. It creates low spatial frequency/high temporal frequency bright stimuli and records cortical activity initiated primarily by afferents in the magnocellular ON pathway. This pathway contains neurons with larger volumes and axonal diameters, and it is preferentially damaged in early glaucoma, which can result in visual field loss. The study presented here uses standard operative procedures (SOP) of icVEP to obtain reliable results. It can detect visual function loss using a signal-to-noise ratio (SNR) corresponding to the defects of retinal nerve fiber layer (RNFL) in early stage open-angle glaucoma (OAG). A setting of 10 Hz and condition of 15% positive-contrast (bright) are selected to differentiate OAG patients and control subjects, with each check containing eight runs. Each run persists for 2 s (for 20 total cycles). A flowchart is constructed, which consists of pupil size and intraocular pressure over a 30 min rest period before each examination. Additionally, the testing order of eyes is performed to obtain reliable electroencephalographic signals. VEPs are recorded and analyzed automatically by software, and SNRs are derived based on a multivariate statistic. An SNR of &#8804; 1 is considered abnormal. A receiver-operating-characteristic (ROC) curve is applied to analyze the accuracy of group classification. Then, the SOP is applied in a cross-sectional study, showing that icVEP can detect glaucomatous visual function abnormality in the central visual field in the form of SNR. This value also correlates with the thickness thinning of RNFL and produces high classification accuracy for early stage OAG. Thus, it serves as a useful and objective diagnostic technology for the early detection of glaucoma.

The isolated-check visual evoked potential (icVEP) method is implemented here to assess the magnocellular ON pathway that is initially damaged in glaucoma. The study shows standard operative procedures using icVEP to obtain reliable results. It is proved to serve as a useful objective diagnosing technology for the early detection of glaucoma.

Avaliação do glaucoma de ângulo aberto em estágio inicial em pacientes por um potencial visual evocado por verificação isolada

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

Avaliação multifatorial do comportamento motor em ratos após lesão unilateral do esmagamento do nervo ciático

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Assessing Corticospinal Excitability During Goal-Directed Reaching Behavior

Reaching is a widely studied behavior in motor physiology and neuroscience research. While reaching has been examined using a variety of behavioral manipulations, there remain significant gaps in the understanding of the neural processes involved in reach planning, execution, and control. The novel approach described here combines a two-dimensional reaching task with transcranial magnetic stimulation (TMS) and concurrent electromyography (EMG) recording from multiple muscles. This method allows for the noninvasive detection of corticospinal activity at precise time points during the unfolding of reaching movements. The example task code includes a delayed response reaching task with two possible targets displayed &#177; 45&#176; off the midline. Single pulse TMS is delivered on the majority of task trials, either at the onset of the preparatory cue (baseline) or 100 ms prior to the imperative cue (delay). This sample design is suitable for investigating changes in corticospinal excitability during reach preparation. The sample code also includes a visuomotor perturbation (i.e., cursor rotation of &#177; 20&#176;) to investigate the effects of adaptation on corticospinal excitability during reach preparation. The task parameters and TMS delivery can be adjusted to address specific hypotheses about the state of the motor system during reaching behavior. In the initial implementation, motor evoked potentials (MEPs) were successfully elicited on 83% of TMS trials, and reach trajectories were recorded on all trials.

Reaching is a fundamental skill that allows humans to interact with the environment. Several studies have aimed to characterize reaching behavior using a variety of methodologies. This paper offers an open-source application of transcranial magnetic stimulation to assess the state of corticospinal excitability in humans during reaching task performance.

Avaliando a excitabilidade corticoespinhal durante o comportamento de alcance direcionado a objetivos

Reaching is a widely studied behavior in motor physiology and neuroscience research. While reaching has been examined using a variety of behavioral ...