Agradecemos a National Science Foundation (CHE-0847145), eo Henry Dreyfus Professor Scholar-Programa de Prêmios para generosamente apoio a esta pesquisa. Gostaríamos de reconhecer especificamente Christine Davis, Diretor de Microscopia e Imagem do Departamento de Biologia da Universidade de Richmond por sua assistência com transversal de imagem. Um agradecimento especial é dada aos drs. T. Leopold, Case Kanters R., D. Kellogg, R. Miller, e W., bem como, Russ Collins, Phil Joseph, Carolyn Marks, Mandy Mallory e John Wimbush - todos eles fazem iniciação científica possível na Universidade de Richmond. Um pessoal muito obrigado é dado a todos os atuais, passados ​​e futuros pesquisadores de graduação no Laboratório de Pesquisa Leopold.

1. Monocamada Hexanethiolate Protected Síntese Clusters de Ouro Hexanethiolate funcionalizados monocamada clusters de ouro protegidas (PPM) são sintetizados na sequência de um 1-hexanethiol 02:01 (C6) a razão molar de ouro para produzir uma estrutura média de Au 225 (C6) 75. 4-9 modificações específicas para a reação Brust, como tratamentos tipo de ligante específico, tiol-to-ouro proporções, temperatura e taxa de entrega de reação, ou pós-síntese, 9-11 pode render uma grande variedade de PPM com tamanhos variados e núcleo funcional grupos de proteção, respectivamente. aproximada 4 O MPC ( média) composições de PPM funcionalizados com diversos grupos alkanethiol pode ser determinada por prótons (1 H) a análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de iodo-decomposto amostras. <ol><li> Dissolver 1,1 g de brometo de tetraoctylammonium (TOABr) em 30 mL de tolueno com ventilação apropriada capa fume. </li><li> Dissolver 0,38 g borohidreto de sódio (NaBH 4) em ~ 20 mL de água de 18 mohms ultrapurificada (UP H 2 O) e deixe esfriar sobre gelo por pelo menos 30 min. </li><li> Dissolver 0,31 g de hidrogênio tetrachloroaurate (HAuCl 4) em ~ 20 mL de H 2 O UP e transferir quantitativamente a mistura de solução para a solução TOABr-tolueno usando um adicional de ~ 5 mL de H 2 O UP, a fim de transferir a fase aquosa ouro solução para a solução não aquoso. Mexa rigorosamente enquanto tampados levemente por 30 min para que o laranja queimado aquosa e clara fases não aquoso está misturando bem. </li><li> Transferência de ambos os aquosa clara e laranja queimado fases não aquoso para um funil de separação. Descartar a camada (inferior) aquosa e decantar a camada (de cima) não aquoso para um balão limpo. </li><li> Adicionar C6 em uma proporção de 2:1 com HAuCl 4 a solução não aquoso. Agitar por 30 min para formar uma Au (I) de polímeros, como detectado por uma mudança de cor de laranja avermelhado para uma solução clara, amarelo quase incolor. </li><li> Transfira a mistura de reação a um banho de gelo isolado e frio de 0 ° C por pelo menos 30 min com agitação. </li><li> Quantitativamente e rapidamente adicionar o NaBH 4 refrigerados solução para a mistura de reação, a fim de reduzir Au (I) a um dourado metálico na presença de tióis, instantaneamente formando uma solução de PPM preto grosso em cima disso. Mexa reação durante a noite a 0 ° C. </li><li> Transfira a mistura de reação a um funil de separação, descarte a camada (inferior) aquosa para um copo de resíduos, e rotativos evaporar a camada (de cima) não aquoso tolueno à secura quase completo deixando uma lama preta pesada no frasco. </li><li> Precipitar o PPM, acrescentando acetonitrila e permitindo a sentar-se durante a noite. </li><li> Coletar PPM por filtração a vácuo utilizando uma frita de vidro de média porosidade com acessórios de borracha e do lado da armada frasco com aspirador e lave com uma quantidade abundante de acetonitrila. </li><li> Permitir PPM para o ar seco, pesar produtos, caracterizam-se por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e análise de RMN, e armazenar tampado para uso futuro. Obter imagens TEM a gota-casting PPM dissolvido em tolueno para formvar / filme de carbono suporte em malha de cobre (400 mesh) e operar o aparelho TEM a 80-100 kV. O tamanho do núcleo média pode ser estimada utilizando software de análise de imagem, tais como Imagem J (freeware). </li></ol> 2. Vídeo de montagem: ditiol-linked Assembléia Film MPC para Eletroquímica monocamada Protein O substrato é o primeiro ouro eletroquimicamente limpos e modificados com um SAM C6 antes de imergir na alternando soluções de ditiol moléculas de ligação e PPM C6 modificado para tornar-se um &quot;ciclo de queda&quot;, que é repetida várias vezes para finalmente formar uma ditiol-linked montagem cinematográfica MPC . Conforme descrito em estudos prévios, o plasmídeo 2 original para o aeruginosa Pseudomonas azurin proteína (AZ) foi dado graciosamente pelo Dr. Corey Wilson, da Universidade Rice e AZ foi fornecido como um pó purificado e liofilizado pela Universidade de Richmond professor, Dr. Jonathan Dattelbaum, que foi posteriormente reidratados com 4,4 mM tampão fosfato de potássio (KPB, pH = 7.0, μ = mM 10) para criar uma solução M 10/05 conforme verificado pela análise visível (UV-Vis) ultravioleta. <ol><li> Monte o sanduíche célula eletroquímica (echem) na seguinte ordem de baixo para cima: placa retentora primeiro Lucite, substrato de ouro como eletrodo de trabalho, entre em contato bronze elétrica para eletrodo de ouro de trabalho, primeira junta de borracha, Viton o-ring que define a área do eletrodo (0,32 cm 2), vidro corpo celular, junta de borracha segundo, e placa retentora segundo Lucite. Toda a célula é mantida unida por barras roscadas e apertados cuidadosamente porcas. A célula é equipado com um eletrodo de referência adquirida comercialmente, que abriga um barril de vidro com 1 M KCl saturado, Ag / AgCl fio de referência e um fio de Pt eletrodo auxiliar. </li><li> Eletroquimicamente ª limpae substrato de ouro através da realização de voltametria cíclica (CV) nas janelas potencial 0,2-0,9 V, 0,2-1,2 V, e 0,2-1,35 V (versus Ag / AgCl, KCl) a 100 mV / s em uma solução de 0,1 MH 2 SO 4 e KCl 0,01 M. </li><li> Medir a corrente de carga do substrato de ouro limpo nuas realizando CV em &quot;condições normais&quot;, incluindo uma janela de potencial de 0,1-0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em KPB KPB Descartar. 1 e enxágüe sucessivamente com UP H 2 O, etanol (EtOH), UP H 2 O e EtOH. </li><li> Expor o substrato limpo de ouro para ~ 300 mL de solução 5 mM em EtOH C6 e deixe descansar durante a noite para formar um ordenado C6 SAM. Eliminar a solução C6 a partir da célula e lave sucessivamente, com EtOH, UP H 2 O, EtOH, e UP H 2 O. </li><li> Medir a corrente de carga do SAM em condições normais. Descartar KPB e enxaguar, sucessivamente, com UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O e EtOH. A corrente de carga deve ser marcadamente diminuído de que a medição de ouro nua (passo 2.3) 1. </li><li> Expor o SAM substrato de ouro modificado para ~ 300 mL de 5 mM de 1,9-nonanedithiol solução (NDT) em EtOH e deixe descansar por 1 hora para interdisperse NDT ligando moléculas dentro do SAM C6. Eliminar a solução NDT e lave sucessivamente e cuidadosamente com EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, e cloreto de metileno (CH 2 Cl 2). </li><li> Expor o substrato de ouro para uma solução de MPC CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) com agitação por lentamente borbulhando com gás N 2 para 1 hr. Se necessário, substitua evaporou solução MPC com mais CH 2 Cl 2. Esta é a ancoragem da camada MPC da montagem cinematográfica. Eliminar a solução MPC e novamente lavar sucessivamente com CH 2 Cl 2, H 2 O UP, e KPB. </li><li> Medir a corrente de carga da camada de MPC em condições normais. Descartar KPB e enxaguar, sucessivamente, com UP H 2 O e CH 2 Cl 2. </li><li> Expor o substrato de ouro para ~ 300 mL de solução 5 mM de NDT CH 2 Cl 2, com agitação por lentamente borbulhando com gás N 2 para 20 min. </li><li> Descartar NDT e enxaguar abundantemente com CH 2 Cl 2. Repita os passos 2.7 e 2.8 para depositar a camada MPC segundo da montagem cinematográfica. </li><li> Para depositar camadas adicionais MPC, as medidas 2.9 e 2.10 são repetidas. Com cada camada adicional MPC um aumento correspondente na corrente de carga é observado. </li><li> Após o filme em rede MPC está completa, lavar o substrato modificado com filme KPB. Proteína AZ é adsorvido na montagem de filmes MPC injetando ~ 150 mL de solução de M ~ 5-10 AZ de KPB na célula sanduíche echem e permitindo a sentar-se cobertas e refrigeradas por pelo menos 1 hr. </li><li> Remover a célula echem do frigorífico e deixe-o voltar à temperatura ambiente próximo. Enxaguar com KPB, recarga de celular com echem KPB, e KPB bolha com gás N 2 para 10 min. </li><li> Estudos de proteínas monocamada eletroquímica são executadas como CV na janela de potencial de -0,25 V a 0,25 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em KPB. </li></ol> 3. Vídeo de montagem: ditiol-linked Assembléia Film MPC para rastreamento óptico Antes de crescimento filmes MPC para avaliação óptica, secções lâmina de vidro são pré-lavadas com solução de Piranha (CUIDADO! 02:01 concentrada H 2 SO 4 e H 2 O 2) e tratados com (3-mercaptopropyl)-trimetoxissilano (3-MPTMS ). 1-2 filmes MPC são, então, montado sobre estes slides de vidro modificado usando o &quot;dip ciclo&quot; técnica como já descrito acima. <ol><li> Enxágüe a 3-MPTMS lâmina de vidro modificado com CH 2 Cl 2 e colocá-lo em uma solução de MPC CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) para 1 hr enquanto agitando em agitador em baixa velocidade. Isso completa a camada de MPC da primeira Assembleia filme de ancoragem PPM ao endgroups mercaptanos do silano. Enxaguar abundantemente com o slide CH 2 Cl 2, e seque com gás N 2. Tome um espectro UV-Vis (400-1000 nm) do slide, e lave novamente com CH 2 Cl 2. </li><li> Coloque o slide em uma solução de NDT 5 mM de CH 2 Cl 2 para 1 hora, enquanto agitação em um agitador em baixa velocidade. Lavar a lâmina com CH 2 Cl 2. </li><li> Coloque o slide em uma solução de MPC durante 1 hr, enquanto agitação em um agitador em baixa velocidade. Isso completa a camada MPC segundo da montagem cinematográfica. Enxaguar abundantemente com o slide CH 2 Cl 2, seque com gás N 2, e ter um espectro UV-Vis (400-1000 nm) do slide. A absorbância em todo o espectro deve ser crescente como camadas adicionais MPC são adsorvidos à montagem do filme. </li><li> Para depositar camadas adicionais MPC, steps 3,2-3,3 são repetidas. </li></ol> 4. Caracterização da monocamada Protected Assembléias Ouro Film Cluster por Microscopia Eletrônica de Transmissão Seccional Cruz TEM seções transversais são preparados por reincorporação rosto en filmes incorporado. 2, 12 Isto é feito pela primeira anexar um filme MPC montado sobre uma lâmina de vidro de 3 MPTMS modificado em um microscópio, limpa padrão slides usando resina epóxi Embed 812 para permitir a melhor comportamento durante o procedimento abaixo. Tenha cuidado com o calor aplicado como temperaturas mais elevadas vão decompor o PPM dentro do filme. <ol><li> Mix Embed 812 resina epóxi e deixe engrossar por pelo menos 12 hr. </li><li> Preencher um &quot;00&quot; cápsula beem com resina epóxi e inverter em cima da amostra filme MPC (preparado na seção 3). Colocar pressão sobre a cápsula, para que uma bolha sobe ao topo da cápsula, criando uma vedação entre a resina epóxi e amostra de filme MPC. Permitem polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 ° C e depois esfriar os slides montado em temperatura ambiente. </li><li> Calor montado slides por 20 seg em uma placa de alumínio fundido quente a 200 ° C, a fim de facilitar a remoção do bloco com cara de filme anexado MPC en. </li><li> Cortar a amostra contendo o filme fora do bloco de cápsula Beem usando viu um joalheiro. </li><li> Re-incorporar a parte removida em um molde de silicone plana com o lado filme MPC-se de frente para o interior do silício também. Preencha o silício bem com resina epóxi à temperatura ambiente e deixar polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 ° C. Arrefecer a amostra à temperatura ambiente. </li><li> Obtenção de cortes finos amostra de 60-80 nm em um ultramicrótomo Leica UCT usando uma faca de diamante para cortar seções perpendiculares ao fio da navalha. </li><li> Coloque fatias seções sobre formvar / filme de carbono suporte em malha de cobre (400 mesh) e tirar imagens de TEM preparadas seções transversais das assembléias filme MPC. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" /> Figura 1 camada dupla cobrança de monitoramento atual do MPC crescimento de filmes para um total de 5 ciclos de imersão (alternando a exposição ao MPC e soluções NDT). Corrente de carga aumentou sistematicamente com cada ciclo de imersão, acrescentando que &quot;camadas&quot; de MPC ao filme (Fig. 2). Os voltamogramas cíclicos foram obtidos utilizando uma janela de potencial de 0,1-0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em 4,4 mM tampão fosfato de potássio (pH = 7,0 μ, MM = 10). Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" /> Figura 2 (a) Representação esquemática da proteína AZ adsorvido para uma assembléia filme ditiol-linked MPC. (B) voltamograma cíclico típico para AZ adsorvido por MPC filme de montagem coletados por meio de uma janela de potencial de -0,25 a 0,25 V (versus Ag / AgCl, KCl) digitalizada a 100 mV / s em 4,4 mM tampão fosfato de potássio (pH = 7.0, μ = 10 mM). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" /> Figura 3 Representante monitoramento UV-Vis do espectro de um crescimento de filmes ditiol-linked MPC numa lâmina de vidro de 3 MPTMS modificado. Um ciclo de mergulho consiste em uma exposição da lâmina de vidro para NDT solução linker seguiu uma exposição à solução de MPC. Cada subseqüentes resultados mergulho no crescimento da espessura do filme e um aumento de absorbância simultâneas. Como o número de ciclos de mergulho aumenta, a superfície de banda plasmon é gradualmente definida em ~ 520 nm. Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" /> Figura 4 microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de análise de imagem seccional cruzada de um conjunto de filmes ditiol-linked MPC. Detalhe: TEM imagem típica de hexanethiolate PPM funcionalizados utilizados na montagem do filme. Análise TEM determinada uma média de diâmetro do núcleo de ouro do PPM ser ~ 2 nm usando análise J imagem. Reproduzido com permissão do ML Vargo, Gulka CP, Gerig JK, Manieri CM, Dattelbaum JD, Marks CB, Lawrence NT, Trawick ML, e Leopold MC, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Eletroquímica monocamada de proteína é uma técnica eficaz usada para estudar as interações entre proteínas redox e sintéticos plataformas de adsorção. A eficácia desta estratégia, no entanto, depende da capacidade de adsorção engenheiro de uma interface com um alto grau de controle de nível molecular. As plataformas baseadas em MPC criado por este protocolo representam plataformas especificamente projetados que são capazes de proporcionar um ambiente mais homogêneo de proteína adsorção 3 e...

<table border="1"><tr><th> Nome do reagente e equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Brometo de Tetraoctylammonium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 294136 </td></tr><tr><td> Borohidreto de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 213462 </td></tr><tr><td> Hidrogênio tetrachloroaurate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 254169-5G </td></tr><tr><td> 1-Hexanethiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 234192 </td></tr><tr><td> Microscópio Eletrônico de Transmissão </td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td> Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear </td><td> Bruker Avance </td><td> 300 MHz </td></tr><tr><td> Formvar carbono / filme de suporte em malha de cobre (400 mesh) </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> FCF400-Cu </td></tr><tr><td> Substrato de ouro </td><td> Evaporado metal Films Corp </td><td> Personalizado </td></tr><tr><td> Ag / AgCl eletrodo de referência </td><td> Microeletrodos, Inc. </td><td> MI-401F </td></tr><tr><td> Potentiostats </td><td> CH Instruments, Inc. </td><td> CHI650A, CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9-Nonanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N29805 </td></tr><tr><td> (3-mercaptopropyl)-trimetoxissilano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 175617 </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro Visível ultravioleta </td><td> Agilent </td><td> 8453 </td></tr><tr><td> Incorporar resina epóxi 812 </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot; cápsula Beem </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 70000-B </td></tr><tr><td> Silicon molde plana </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 70900 </td></tr><tr><td> Faca de diamante </td><td> Diatome </td><td> 21 ULE, S12801 </td></tr></table>

synthesis, assembly, and characterization of monolayer protected gold nanoparticle films for protein monolayer electrochemistry

Nanopartículas de ouro coloidal protegidos com ligantes alkanethiolate chamados clusters monocamada protegidos ouro (PPM) são sintetizados e, posteriormente, incorporados em conjuntos de cinema que servem como plataformas de adsorção de proteínas eletroquímica monocamada (PME). PME é utilizada como sistema modelo para estudar propriedades eletroquímicas de proteínas redox, confinando-os a uma plataforma de adsorção em um eletrodo modificado, que também serve como um parceiro redox para transferência de elétrons (ET) reações. Estudos têm demonstrado que as assembleias de nanopartículas de ouro filme desta natureza prever um ambiente mais homogêneo adsorção de proteínas e promover ET sem dependência distância em comparação com os sistemas mais tradicionais modificados com alkanethiol monocamadas auto-organizadas (SAM). 1-3 Neste artigo, PPM funcionalizados com ligantes hexanethiolate são sintetizados usando uma reação Brust modificado 4 e caracterizados com espectroscopia visível (UV-Vis) ultravioleta, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e prótons (1 H) de ressonância magnética nuclear (RMN). MPC filmes são montados na SAM interfaces de eletrodo de ouro modificado usando um &quot;mergulho ciclo&quot; método de camadas alternadas MPC e ditiol moléculas de ligação. Crescimento de filmes em eletrodo de ouro é rastreada eletroquimicamente medindo mudanças para a camada dupla corrente de carga do sistema. Filmes análogos montados em lâminas de vidro modificado silano permitem a monitoração óptica de crescimento de filmes e análise transversal TEM fornece uma espessura estimada. Durante a montagem de filmes, manipulação de protecção ligante MPC, bem como o mecanismo de ligação interpartículas permitir a filmes em rede, que são facilmente adaptáveis, para fazer a interface com a proteína redox ter mecanismo de adsorção diferentes. Por exemplo, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) pode ser adsorvida hidrofobicamente para ditiol-linked filmes de PPM hexanethiolate e citocromo c (cyt c) pode ser imobilizada eletrostaticamente em um ácido carboxílico modificado MPC camada interfacial. Neste relatório, vamos nos concentrar sobre o protocolo de filmes para o sistema AZ exclusivamente. Investigações envolvendo a adsorção de proteínas em plataformas MPC modificado sintéticos podem ajudar a entender as interações entre biomoléculas e materiais sintéticos, e, conseqüentemente, auxiliar no desenvolvimento de sistemas de biosensor, os sistemas de ET, modelagem e materiais sintéticos biocompatíveis. 5-8

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colóides de ouro Alkanethiolate estabilizado conhecidos como clusters monocamada protegidas (PPM) são sintetizados, caracterizados, e montada em filmes finos como uma interface para a adsorção eletroquímica proteína monocamada de proteína redox simples, como<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Azurin (AZ) e citocromo<em&gt; C</em&gt; (Cyt<em&gt; C</em&gt;).

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K visualizações.  University of Richmond. Colóides de ouro Alkanethiolate estabilizado conhecidos como clusters monocamada protegidas (PPM) são sintetizados, caracterizados, e montada em filmes finos como uma interface para a adsorção eletroquímica proteína monocamada de proteína redox simples, como Pseudomonas aeruginosa Azurin (AZ) e citocromo C (Cyt C).

Vídeo: Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Bioengenharia

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the cognitive powers of the brain with comparable efficiency and density. To date, silicon-based three-terminal transistors and two-terminal memristors have been widely used in neuromorphic circuits, in large part due to their ability to co-locate information processing and memory. Yet these devices cannot achieve the interconnectivity and complexity of the brain because they are power-hungry, fail to mimic key synaptic functionalities, and suffer from high noise and high switching voltages. To overcome these limitations, we have developed and characterized a biomolecular memristor that mimics the composition, structure, and switching characteristics of biological synapses. Here, we describe the process of assembling and characterizing biomolecular memristors consisting of a 5 nm-thick lipid bilayer formed between lipid-functionalized water droplets in oil and doped with voltage-activated alamethicin peptides. While similar assembly protocols have been used to investigate biophysical properties of droplet-supported lipid membranes and membrane-bound ion channels, this article focuses on key modifications of the droplet interface bilayer method essential for achieving consistent memristor performance. Specifically, we describe the liposome preparation process and the incorporation of alamethicin peptides in lipid bilayer membranes, and the appropriate concentrations of each constituent as well as their impact on the overall response of the memristors. We also detail the characterization process of biomolecular memristors, including measurement and analysis of memristive current-voltage relationships obtained via cyclic voltammetry, as well as short-term plasticity and learning in response to step-wise voltage pulse trains.

Soft, low-power, biomolecular memristors leverage similar composition, structure, and switching mechanisms of bio-synapses. Presented here is a protocol to assemble and characterize biomolecular memristors obtained from insulating lipid bilayers formed between water droplets in oil. The incorporation of voltage-activated alamethicin peptides results in memristive ionic conductance across the membrane.

Montagem e caracterização de Biomolecular Memristors consiste em membranas de lipídios dopado com canal iônico

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...