Os autores agradecem Victoria Carpenter por seus comentários críticos deste protocolo.

Parte I - RNAi mediada knockdown do gene na idade adulta do mosquito Aedes aegypti. Para visão geral experimento veja a Figura 1. 1. Síntese dsRNA <ol><li> Sintetizar dsRNAs específicas contra genes de dsRNAs de juros e controle. Nota: Sugerimos iniciadores em desenvolvimento para os fragmentos de PCR na gama de 300 a 500 pares de bases localizado na extremidade 3 &#39;do cDNA específico 2 e com a sequência de iniciador de T7 ligado na extremidade 5&#39; (5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 &#39;). Singularidade dos fragmentos deve ser confirmado por análise BLASTN 3. </li><li> Utilizar a Ambion Megascript T7 Kit de Transcrição de Alto Rendimento (Ambion, a tabela de reagentes) que utiliza-polimerase de T7 RNA para a reacção de transcrição para sintetizar ARNdc. Nota: Os reagentes semelhantes e kits estão disponíveis em outros lugares. </li><li> Para purificar ARNdc, precipitado com cloreto de lítio, seguindo as instruções com o kit de Megascript. </li><li> Depois purificatiónica, dissolver o sedimento ARNdc em água estéril. Para assegurar a viscosidade adequada para microinjecção, a concentração de ARNdc não deve exceder 2 ug / uL. </li></ol> 2. Preparação de injecção <ol><li> Um simples micro injector pode ser construído utilizando tubos, uma tesoura, uma agulha de metal, uma seringa de 1 ml, e uma 1 ml em plástico pipeta de ponta (ver Figura 2). O tubo deve ser cortado para ~ 40 cm de comprimento. Alternativamente, um injector automático de micro pode ser usado como Drummond Nanojet II 4. <ol><li> Cortar a ponta da seringa (cubo de agulha) em 2 ml marca escala e remover a cabeça do êmbolo de borracha a partir do êmbolo. </li><li> Faça um furo com uma agulha de metal na cabeça do êmbolo de borracha e coloque a cabeça do êmbolo de borracha de volta no centro da agulha. </li><li> Coloque o cubo da agulha em uma extremidade do tubo e colocar uma ponta de pipeta de 1 ml de plástico na outra extremidade, a qual será usada como a peça para a boca (alternativamente, um 10 ml syRinge pode ser usado para produzir a pressão de ar necessária para a injecção). </li></ol></li><li> Colocar uma agulha capilar de vidro, no furo na cabeça do êmbolo de borracha e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para líquido a fluir através dele. Nota: O tamanho óptimo da ponta da agulha tem de ser determinada empiricamente -, se a largura da agulha é demasiado grande isso irá resultar em trauma e uma elevada taxa de mortalidade de mosquito, se a largura da agulha é muito pequeno, será impossível para penetrar o exoesqueleto de mosquito. </li><li> Submergir a agulha de injecção na amostra ARNdc preparada e extrair a amostra de líquido para dentro da agulha de injecção por sucção o líquido para cima com a peça de boca (ou uma seringa). Nota: Este passo é idêntico para todos os reagentes líquidos que são injectados nos mosquitos, incluindo tampão PBS, que é utilizado in vivo no protocolo de ensaio de diurese (ver abaixo). </li></ol> 3. Coletar e Anestesie mosquitos <ol><li> Coleçãomosquitos de t com um aspirador alimentado por bateria para um frasco de coleta. Coloque uma tampa sobre o frasco de coleta e coloque o frasco em uma almofada limpa CO 2 para anestesiar os mosquitos. Nota: Como alternativa os mosquitos podem ser anestesiados em gelo. </li></ol> 4. Injeção de Mosquito <ol><li> Abra o frasco de coleta e colocar os mosquitos diretamente no bloco de CO 2 e esperar até os mosquitos são anestesiados. </li><li> Descarte todos os homens. </li><li> Alinhar os mosquitos no lado para permitir um acesso mais fácil para injecção. </li><li> Agarre mosquitos pelas pernas ou asas para evitar ferimentos. Você também pode usar um pincel fino ou pena para manipular os mosquitos. </li><li> Quando pronto para injectar o mosquito em primeiro lugar, suavemente suportar um lado do tórax com a pinça e inserir a ponta da agulha para o outro lado do tórax (Figura 2). É melhor injetar uma porção fina da cutícula e evitar empurrar a agulha paraó profundo no tórax. </li><li> Uma vez que a agulha está no lugar, soprar o líquido para dentro do mosquito. A quantidade desejada pode ser determinada através da monitorização do menisco de líquido na agulha. O número de milímetros necessárias para um volume específico pode ser determinada por cálculo do volume do cilindro da agulha capilar de vidro (πr 2 h). A quantidade eficaz de ARNdc que é tipicamente usada para injecção é de 1 ug. </li><li> Uma vez que o líquido é injectado mosquito, cuidadosamente retrair a agulha. Se um formas líquidas grandes gotículas do lado de fora do tórax, o mosquito deve ser descartado. Em seguida, repita esse processo com o mosquito que vem. </li></ol> 5. Recuperação Mosquito e Armazenamento <ol><li> Após a injecção, colocar os mosquitos em um recipiente para armazenagem. Por exemplo, uma cera de forrado pint copos de papelão (copos de sopa) com malha de recobrimento protegido com a tampa de cartão. A tampa tem uma parte cortada para a malha que cobre a ser exposto. Uma vez que todo o mosquitoes são colocados no recipiente, colocar o recipiente numa câmara de ambiente controlado, após a incubação e fornecer os mosquitos com uma fonte de alimento, tal como 20% de sacarose bolas de algodão embebidas colocados em cima da cobertura de malha. Antes de realizar o ensaio in vivo de diurese, privar os mosquitos dsRNA com injeção de uma fonte de água por 12 horas para normalizar o estado de hidratação de cada mosquito. </li><li> A eficiência de ARNdc mediada knockdown do gene pode ser variável. Silenciamento gênico pode começar um dia após a injeção e pode durar até 6 dias após a injecção 4. O tempo ideal para atingir knockdown gene máxima tem de ser determinada empiricamente para cada gene utilizado. Geralmente, temos que esperar 3 dias após a injeção do dsRNA antes de prosseguir. </li></ol> Parte II - In vivo ensaio diurese em adulto do mosquito Aedes aegypti Nota: Este protocolo foi desenvolvido pelos autores eutilizado para RNAi mediada knockdown de proteínas Aquaporin no mosquito da febre amarela Aedes aegypti 1. Para evitar a variabilidade entre os mosquitos individuais, mosquitos devem ser analisadas em grupos. Por razões técnicas, recomendamos grupos de 5 mosquitos por tratamento - há uma quantidade limitada de tempo para realizar a medição de peso antes de mosquitos começam a excretar urina após a injeção. 6. Coletar e Anestesie mosquitos <ol><li> Antes da coleta dos mosquitos, registrar o peso de um frasco coleção vazia com uma tampa com uma balança de precisão analítica. Este frasco vai ser utilizado para todas as medições subsequentes. </li><li> Collect 5 mosquitos fêmeas para dentro do frasco de recolha pesados ​​com um aspirador. Coloque a tampa sobre o frasco de coleta e deixá-lo sentar-se no bloco de CO 2 por alguns segundos para anestesiar os mosquitos. </li></ol> 7. Pesagem inicial <ol><li> Tome tele medição de peso inicial dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtraindo o peso do frasco de recolha vazio com tampa. </li><li> Abrir o frasco de recolha e colocar os mosquitos directamente sobre a almofada de 2 CO após a gravação do peso dos mosquitos. Se os mosquitos estão começando a acordar durante as medições de peso, definir o frasco no bloco de CO 2 por alguns segundos antes de abri-lo e colocar os mosquitos no teclado. </li></ol> 8. Preparação de injecção <ol><li> Configure o injector micro seguindo as instruções dadas no protocolo knockdown RNAi mediada por gene. </li><li> Colocar uma agulha capilar de vidro, no injector micro e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para liquid para fluir. </li><li> Agulha submergir o em tampão PBS e desenhar o tampão para dentro da agulha de injecção, a quantidade desejada a utilizar para este protocolo é de 1,25 ul de PBS para cada mosquito. Nota: Este montante imita a quantidade média de plasma sanguíneo que é absorvido por um mosquito fêmea 5. </li></ol> 9. Injeção de Mosquito <ol><li> Alinhe-se os mosquitos para permitir um acesso mais fácil com o injector micro. </li><li> Uma vez que a agulha está no lugar, fundir tampão PBS para o mosquito. </li><li> Uma vez que o líquido é injectado no mosquito, uma gotícula pode formar no lado de fora do tórax. Este gotícula tem de ser cuidadosamente removido antes do passo seguinte. </li><li> Repita este processo de injeção com o mosquito que vem. Com a experiência, a taxa de sobrevivência do mosquito será quase 100% após a injeção. </li></ol> 10. Os mosquitos de pesagem <ol><li> Após a injeção, coloque delicadamente os mosquitos no vidro de coletae cap. Fazer a medição de peso primeiro dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtrair o peso do frasco de recolha vazio com tampa. Nota: os mosquitos começam a excretar urina dentro de 2 minutos após a remoção do bloco de anestesia CO 2, por isso é importante para fazer a medição de peso antes de começar a excretar. </li><li> Coloque mosquitos em um pequeno recipiente onde eles começarão a excretar urina. </li></ol> 11. Segundo e subsequentes medidas de peso Nota: As medidas de peso dos mosquitos devem ser tomadas em intervalos de 30 minutos, mas este pode ser ajustado para intervalos mais curtos ou mais longos, dependendo taxas de excreção. <ol><li> Após 30 minutos, recolher o group de 5 mosquitos com um aspirador para o frasco mesma coleção com tampa. Fazer a medição de peso próximo dos mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Após a medição, colocar os mosquitos no recipiente mesma exploração para os próximos 30 minutos. </li><li> Repetir este processo para um período de tempo desejado. </li></ol> 12. Taxa de excreção de determinar Mosquito <ol><li> A quantidade total de líquido que foi injectado no grupo de 5 mosquitos pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso imediatamente após a injecção. </li><li> A quantidade de urina, que foi excretada pelo grupo de mosquitos em um ponto de tempo específico pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso dos mosquitos no ponto de tempo específico. </li><li> A taxa de excreção, num ponto de tempo específico pode ser calculado por diviDing a quantidade de urina excretada, neste ponto do tempo pela quantidade total de líquido injectado (Tabela 1). </li></ol> 13. Os resultados representativos RNAi mediada knockdown do gene e in vivo ensaio diurese têm sido utilizados pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de aquaporinas em Aedes aegypti diurese mosquito. Três aquaporinas que são expressas em Aedes aegypti Malpighian túbulos foram derrubados com efeitos significativos sobre a taxas de excreção comparados para controlar mosquitos 1. A Figura 4 mostra resultados representativos de uma experiência em que o ensaio de diurese foi utilizado para comparar taxas de excreção entre Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a temperaturas diferentes. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma do ensaio RNAi / diurese. 5 grupos de 10 mosquitos each são injectados com ARNdc de um gene específico e de outros cinco grupos de dez mosquitos são injectados com o controle de ARNdc. Outro grupo de mosquitos injectados com 200 uM HgCl 2 em PBS é usado como um controlo positivo. Estes mosquitos são pesados ​​antes da injecção, e após a injecção, em trinta minutos de intervalo durante 3 horas. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Um dispositivo de injeção simples micro para o knockdown do gene RNAi mediada e ensaio in vivo de diurese. A. As agulhas capilares de vidro utilizado para injecção. O triângulo cinza representa os incrementos de milímetro desenhadas na agulha para indicar a quantidade de líquido injectado no mosquito. B. 1 seringa ml usado para construir o injector micro. O triângulo branco representa o cubo da agulha e do triângulo preto representa a cabeça do êmbolo de borracha ligado ao êmbolo na seringa. C. O tubo usado para prender o porta-voz parao injector. D. 1 ml ponta de pipeta descartável (ponta azul), que é utilizado como o bocal do dispositivo de microinjecção. E. O dispositivo microinjeção que incorpora partes AD. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Local da injecção óptima do mosquito. A. Fêmea Aedes aegypti injectados com uma agulha capilar de vidro entre as escalas grandes no tórax. A barra preta indica 1 mm para comparação de tamanho. B. Um desenho do tórax mosquito fêmea e as manchas brancas representam as escamas brancas no exoesqueleto de mosquito. A agulha de injeção deve furar o mosquito entre os pontos para minimizar a taxa de mortalidade durante a injeção. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Efeitos da temperaturasas de Culex quinquefasciatus e diurese Aedes aegypti. O ensaio de diurese foi realizada com duas espécies de mosquitos, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, a temperaturas diferentes. A taxa de excreção durante a primeira hora após a injecção é dada em percentagem. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> TARA (G) </td><td> não injectada (G) </td><td> após a injecção (G) </td><td> 1h após a injecção (G) </td><td> peso médio (mg) </td><td> quantidade injectada (Ul) </td><td> quantidade excretada (Ul) </td><td> % Excretado </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2,6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Aedes aegypti em resultados do ensaio in vivo diurese. Dados brutos de ensaio in vivo de diurese realizada com Aedes aegypti fêmea mosquitos a 4 ° C.

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A.+gambiae).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae).</a> J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+1+Development,+Nutrition,+and+Reproduction.">Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).</li><li>Pannabecker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+the+Malpighian+Tubule.">Physiology of the Malpighian Tubule.</a> Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).</li><li>Dow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+Malpighian+tubule+function+from+functional+genomics.">New insights into Malpighian tubule function from functional genomics.</a> Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).</li><li>Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Malpighian+tubule+from+functional+genomics.">Insights into the Malpighian tubule from functional genomics.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).</li><li>Lawson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VectorBase:+a+data+resource+for+invertebrate+vector+genomics.">VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics.</a> Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).</li><li>Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanisms+of+diuresis+in+Malpighian+tubules+of+insects.">Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects.</a> J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li><li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter:+hormonal+control+of+diuresis.">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li><li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

O protocolo utilizado RNAi foi desenvolvido no laboratório de Alexander Raikhel da Universidade da Califórnia Riverside 6,7 e é semelhante a um protocolo publicado por Garver e Dimopoulos 4. A abordagem experimental mostrado neste protocolo de vídeo pode ser usado para estudar os genes envolvidos na diurese de insectos em uma configuração em in vivo. Os órgãos excretores dos insetos, os túbulos de Malpighi, têm atraído o interesse de gerações de pesquisadores como um sistema m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit de Alto Rendimento </td><td> Ambion, Inc. </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de plástico </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml de plástico pipeta </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Azul ponta </td></tr><tr><td> 1 ml da seringa </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agulha de metal </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Tamanho 5 </td></tr><tr><td> Fly pad </td><td> Genesee Científico </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentado por bateria aspirador frasco w / coleção </td><td> UPMA Labs </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Belas pinça de ponta </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas capilares de vidro </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção Stereo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Balança de precisão analítica </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Um litro encerado copos de papelão forradas </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> Fabricados copos de sopa </td></tr><tr><td> Rede de malha </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> gaze mosca plástico </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Este protocolo vídeo demonstra uma técnica eficaz para knockdown um determinado gene em um inseto e realizar um bioensaio romance para medir a taxa de excreção. Este método pode ser usado para obter uma melhor compreensão do processo de diurese em insectos e é especialmente útil no estudo da diurese no sangue de alimentação-artrópodes que são capazes de assumir uma grande quantidade de líquido em uma farinha de sangue única. Este gene knockdown RNAi mediada combinado com um ensaio in vivo de diurese foi desenvolvido pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de RNAi mediada knockdown de genes Aquaporin sobre Aedes aegypti diurese mosquito 1. O protocolo é configurado em duas partes: a primeira demonstração ilustra como a construção de um dispositivo de injeção simples mosquito e como preparar e injetar dsRNA para o tórax de mosquitos para RNAi mediada knockdown do gene. A demonstração segundo ilustra como determinartaxas de excreção em mosquitos usando um bioensaio in vivo.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio diurese para estudar a knockdown efeitos dos genes de interesse tem sobre a excreção de fluido do mosquito.

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.4K visualizações.  New Mexico State University. Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com um In vivo Ensaio diurese para estudar a knockdown efeitos dos genes de interesse tem sobre a excreção de fluido do mosquito.

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Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

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Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

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Biologia

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

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Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

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Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissecção das glândulas salivares e intestino médio de Ae. aegypti mosquitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Sistema de cultura de órgão de gordura corporal em Aedes Aegypti, um vetor de vírus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...