저자는이 프로토콜의 그녀 비판적 의견 빅토리아 카펜터 감사드립니다.

부 전 - 성인 Aedes aegypti 모기에 RNAi - 중재 유전자 최저. 실험 개요는 그림 1을 참조하십시오. 1. dsRNA 합성 <ol><li> 관심과 제어 dsRNAs의 유전자에 대한 구체적인 dsRNAs을 합성. 주 : 우리는 3 &#39;특정 cDNA 2 월말과 5 부착된 T7 뇌관 시퀀스로&#39;에서 끝 (5&#39;-TAA 전술 GAC TCA CTA 위치한 300-500 기본 쌍의 범위에서 PCR 단편을 위해 개발 primers를 추천 TAG GG-3 &#39;). 파편의 특이 사항은 BLASTN 분석 3 확인하여야한다. </li><li> dsRNA를 합성하기위한 전사 반응을 T7 RNA 중합 효소를 활용 Ambion Megascript T7 높은 항복 전사 키트 (Ambion, 시약 표)를 사용합니다. 참고 : 유사한 시약 및 키트 다른 곳에서 사용할 수 있습니다. </li><li> dsRNA를 정화하려면 Megascript 키트와 지침에 따라 염화 리튬으로 침전. </li><li> purificat 후이온, 멸균 물 속에서 dsRNA 펠릿를 해산. microinjection에 대한 적절한 점도를 보장하기 위해 dsRNA 농도 2 μg / μl를 초과해서는 안됩니다. </li></ol> 2. 사출 준비 <ol><li> 간단한 마이크로 주입기는 튜브, 가위, 금속 바늘, 1 ML의 주사기, 그리고 한 ML 플라스틱 피펫 팁을 (그림 2 참조)을 사용하여 건설 수 있습니다. 튜브는 길이 ~ 40cm로 절단한다. 또한, 자동화된 마이크로 주입기는 그러한 Drummond Nanojet II 4로 사용될 수 있습니다. <ol><li> 이 ML 눈금 표시에서 주사기의 팁 (바늘 허브)를 잘라 플런저에서 고무 플런저 헤드를 제거합니다. </li><li> 고무 플런저 머리와 장소 다시 바늘 허브의 고무 플런저 머리에 금속 바늘을 사용하여 펀치 구멍. </li><li> 튜브의 한쪽 끝을에 바늘 허브를 놓고 마우스 피스 (또는 10 ML 싸이로 사용됩니다 다른 쪽 끝을에서 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 배치ringe)는 주사에 필요한 공기 압력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 고무 플런저 머리에있는 구멍에 유리 모세관 바늘을 놓고 너비는 액체를 통해 흐를만큼 큰 수 있도록 바늘의 팁을 끊다. 참고 : 바늘 끝의 최적 크기는 경험적으로 결정되어야한다 - 바늘 너비가 너무 작은 경우 바늘의 너비 이것이 외상과 높은 모기 사망률집니다 너무 큰 경우, 그것은 침투하기가 불가능합니다 모기 외골격. </li><li> 준비된 dsRNA 샘플에서 잠수함 주입 바늘과 마우스 피스 (또는 주사기)로 액체를 빨아하여 주사 바늘로 액체 샘플을 그립니다. 참고 :이 단계는 (아래) 생체내의 이뇨 분석 프로토콜에서 사용되는 PBS 버퍼를 비롯하여 모기에 주입되는 모든 액체 시약에 대해 동일합니다. </li></ol> 3. 모기를 수집하고 마취 <ol><li> Collec수거 유리병에 배터리 구동 흡인기로 하지마 모기. 수거 유리병 이상의 모자를 놓고 모기를 마취하기 위해 깨끗한 CO 2 패드에 병을 놓습니다. 참고 : 또한 모기가 얼음위에 anesthetized 될 수 있습니다. </li></ol> 4. 모기 분사 <ol><li> 수거 유리병을 열고 직접 CO 2 패드에 모기를 넣고 모기가 anesthetized 때까지 기다립니다. </li><li> 모든 남성 폐기하십시오. </li><li> 주사를 더욱 쉽게 액세스할 수 있도록 측면에 모기를 줄입니다. </li><li> 부상을 피하기 위해 다리 또는 날개에 의한 모기를 잡아. 당신은 또한 훌륭한 화필이나 모기를 조작하기 위해 깃털을 사용할 수 있습니다. </li><li> 첫 모기를 주입하기 위해 준비가되면 부드럽게 포셉와 흉부의 한쪽을 지원하며 흉부 반대편 (그림 2)로 바늘의 끝부분을 삽입합니다. 그것은 표피의 얇은 부분에 주입하고 바늘을 밀어 피하는 것이 좋습니다흉부에 깊이를 O. </li><li> 바늘이 곳에되면 모기에 액체를 폭파. 원하는 금액은 바늘의 액체 초승달 모양을 모니터에 따라 결정됩니다. 특정 볼륨에 필요한 mm의 갯수는 유리 모세관 바늘 (πr 2 시인데)의 실린더 부피를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 일반적으로 주사에 사용되는 dsRNA의 효과적인 금액은 1 μg이다. </li><li> 액체는 모기에 주입되면 바늘을 조심스럽게를 철회. 흉부의 외부에 대형 액체 비말 형태 않으면 모기는 폐기되어야합니다. 그리곤, 다음날 모기와 함께이 과정을 반복합니다. </li></ol> 5. 모기 복구 및 저장 <ol><li> 주입 후 저장 용기에 모기를 놓습니다. 예를 들어, 한 파인트 왁스는 메쉬가 마분지 뚜껑으로 안전 커버와 골판지 컵 (수프 컵) 정렬했습니다. 뚜껑이 노출되는 덮고 메쉬에 맞을 부분이 있습니다. 일단 모든 MOsquitoes가 컨테이너에 배치되며, 인큐베이션위한 환경 제어 챔버에 컨테이너를 놓고 같은 메쉬 커버의 상단에 배치 20 % 자당 젖었 면화 공 같은 음식 소스와 모기를 제공하고 있습니다. 생체내의 이뇨 분석에를 수행하기 전에, 각 모기의 수화 상태를 표준화하기 위해 12 시간 동안 물 소스의 dsRNA-주입 모기를 빼앗다. </li><li> dsRNA - 중재 유전자 최저의 효율이 변수가 될 수 있습니다. 유전자 입을은 주입 후 1 하루를 시작할 수 있으며 주사 후 4 육일까지 지속될 수 있습니다. 최대 유전자 최저를 달성하기위한 최적의 시간은 사용하는 모든 유전자에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 우리가 진행하기 전에 일반적으로, 우리는 dsRNA 주입 후 삼일 정도 기다리십시오. </li></ol> 파트 II - 생체내의 이뇨 분석에서는 Aedes aegypti 모기 성인에서 참고 :이 프로토콜은 작성자에 의해 개발되었으며황열병의 모기의 aquaporin 단백질의 RNAi - 중재 최저 사용은 aegypti 1 Aedes. 개별 모기 사이의 다양성을 방지하려면 모기는 그룹에서 분석되어야한다. 기술적인 이유로 치료를 당 5 모기 그룹을 권장합니다 - 모기가 주사 후에 소변 나물을 시작하기 전에 첫 번째 체중 측정을 수행하는 시간을 제한 금액이 있습니다. 6. 모기를 수집하고 마취 <ol><li> 모기를 수집하기 전에 분석 정밀 밸런스를 사용하는 모자와 빈 컬렉션 유리병의 무게를 기록합니다. 이 유리병은 모든 후속 측정에 사용됩니다. </li><li> 흡인기로 무게 수집 유리병에 5 암컷 모기를 수집합니다. 수거 유리병 위에 뚜껑을 놓고하고 모기를 마취하는 데 몇 초 동안 CO 2 패드에 앉자. </li></ol> 7. 초기 무게 측정 <ol><li> T를 타고정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기 그는 초기 체중 측정. </li><li> 모기의 무게와 뚜껑으로 수집 병을 복용하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 빼는 방법으로 다섯 모기 그룹의 무게를 계산합니다. </li><li> 수거 유리병을 열고 모기의 무게를 기록 후 직접 CO 2 패드에 모기를 놓습니다. 모기가 무게를 측정하는 동안 깨어하기 시작한다면, 그것을 열고 패드에 모기를 삽입하기 전에 몇 초 동안 CO 2 패드에 유리병을 설정합니다. </li></ol> 8. 사출 준비 <ol><li> RNAi - 중재 유전자 최저 프로토콜에 주어진 지시에 따라 마이크로 주입기를 설정합니다. </li><li> 마이크로 분사기의 유리 모세관 바늘을 놓고 바늘의 팁을 끊다 때문에 너비가 liq 충분히 크다을 통해 흐를하는 UID. </li><li> 잠수함 PBS 버퍼에 바늘과 주사 바늘로 버퍼를 그려,이 프로토콜에 사용할 원하는 금액은 각 모기에 대한 PBS의 1.25 μl입니다. 참고 :이 금액은 여성 모기 오에 의해 함락되는 혈장의 평균 금액을 모방한 것이었 지요. </li></ol> 9. 모기 분사 <ol><li> 마이크로 주입기로 쉽게 접근할 수 있도록 모기를 줄입니다. </li><li> 바늘이 곳에되면 모기에 PBS 버퍼를 날려요. </li><li> 액체는 모기에 주입되면, 비말은 흉부의 외부에 형성하고 있습니다. 이러한 비말은 신중하게 다음 단계 전에 제거되어야한다. </li><li> 다음은 모기와 함께 사출 과정을 반복합니다. 경험을 바탕으로 모기 생존율은 주사 후 거의 100 %가 될 것입니다. </li></ol> 10. 무게 모기 <ol><li> 주사 후에는 부드럽게 수집 유리병에 모기 배치그리고 모자. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 5 모기의 첫 번째 체중 측정을 가져가라. </li><li> 뚜껑과 모기와 수집 유리병의 무게를 복용하여 5 모기 그룹의 무게를 계산하고 뚜껑이있는 빈 컬렉션 유리병의 무게를 뺍니다. 참고 : 모기가 CO 2 마취 패드에서 제거 후 2 분 이내에 소변을 만들어내는 시작할 것이다, 그래서 그들이 나물을 시작하기 전에 체중 측정을하는 것이 중요합니다. </li><li> 그들은 소변을 만들어내는 시작됩니다 작은 용기에 모기를 놓습니다. </li></ol> 11. 두 번째 이후 무게 측정 참고 : 모기의 무게 측정이 30 분 간격으로 복용해야하지만, 이것은 배설 속도에 따라 짧은 이상 간격을 조정할 수 있습니다. <ol><li> 30 분 후에, grou를 수집뚜껑과 같은 컬렉션 유리병에 흡인기 5 모기 P. 정밀 밸런스에 모자와 모기를 포함하는 컬렉션 유리병을 배치하여 모기의 다음 체중 측정을 가져가라. </li><li> 측정 후, 다음 30 분 동안 동일한 지주 용기에 모기를 놓습니다. </li><li> 시간을 원하는 금액에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol> 12. 결정 모기 배설 속도 <ol><li> 5 모기의 그룹으로 주입되었다 액체의 총 금액이 즉시 주사 후 체중에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다. </li><li> 특정 시점에서 모기의 그룹에 의해 배설되었다 소변의 양은 특정 시점에서 모기의 무게에서 모기의 초기 무게를 빼는 방법으로 계산 할 수 있습니다. </li><li> 특정 시점에서 배설 율은 divi하여 계산할 수액체 주입 (표 1)의 총 금액하여이 시점에서 배설 소변 딩 금액입니다. </li></ol> 13. 대표 결과 유전자 최저 RNAi - 중재 및 생체내의 이뇨 분석에서이 Aedes aegypti 모기 이뇨의 aquaporins의 효과를 연구하기 위해 한센 실험실에서 사용되었습니다. Aedes aegypti Malpighian tubules로 표현되는 세 aquaporins는 모기 1 제어할 비해 배설 속도에 상당한 효과를 무너 뜨 렸어되었다. 그림 4는 이뇨 분석은 Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus 사이에 배설 률을 비교하는 데 사용되었습니다 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다 서로 다른 온도에서. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 10 모기 EA의 RNAi / 이뇨 분석의 흐름도 5. 그룹채널은 특정 유전자에 대한 dsRNA을 주사하고 십 모기 오천 그룹은 통제 dsRNA로 주입된다. PBS 200 μm의 HgCl 2 주입 모기의 또 다른 그룹은 긍정적인 컨트롤로 사용됩니다. 이 모기는 주입하기 전에, 3 시간 삼십분 간격의 주입 후에 무게가있다. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. RNAi - 중재 유전자 최저 및 생체내의 이뇨 분석의 간단한 미세 주입 장치. A. 유리 모세관 바늘은 주사에 사용. 회색 삼각형은 모기에 액체 주입의 양을 표시하는 바늘에 그려진 mm 단위로 나타냅니다. B. 한 ML의 주사기는 마이크로 주입기을 만드는 데 사용. 흰색 삼각형 바늘 허브를 대표하고 검정색 삼각형은 주사기의 플런저에 연결된 고무 플런저 머리를 나타냅니다. C. 관은에 마우스 피스를 장착하는 데 사용주입기. microinjection 장치의 마우스 피스로 사용됩니다 D. 한 ML 일회용 피펫 팁 (파란색 팁). E. AD 부품을 통합 microinjection 장치. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 최적 모기 주입 사이트. A. 여성 Aedes aegypti 모기는 흉부에 큰 비늘 사이에 유리 모세관 바늘로 주입. 검은 막대는 크기 비교를위한 1mm를 나타냅니다. 암컷 모기 흉부의 그림 B.와 흰 반점은 모기 외골격의 하얀 비늘을 나타냅니다. 주사 바늘은 피어스 반점 사이에 모기가 주사하는 동안 사망률을 최소화해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 온도의 영향Culex quinquefasciatus 및 Aedes aegypti의 이뇨에 진짜야가. 이뇨 분석은 서로 다른 온도에서, 모기, Aedes aegypti 및 Culex quinquefasciatus의 두 종족으로 수행되었다. 주사 후 첫 시간 동안 배설 율은 퍼센트에 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 그룹 </td><td> 타라 (G) </td><td> 주입하지 (G) </td><td> 주입 후 (G) </td><td> 1 시간 게시물 주입 (G) </td><td> 평균 중량 (MG) </td><td> 양을 주입 (μl) </td><td> 금액 배설 (μl) </td><td> % 배설 </td></tr><tr><td> 일 </td><td> 7.5938 </td><td> 7.6057 </td><td> 7.6104 </td><td> 7.6096 </td><td> 2.38 </td><td> 0.94 </td><td> 0.16 </td><td> 17.0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7.8252 </td><td> 7.8349 </td><td> 7.8415 </td><td> 7.8403 </td><td> 1.94 </td><td> 1.32 </td><td> 0.24 </td><td> 18.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.8896 </td><td> 7.9026 </td><td> 7.9077 </td><td> 7.906 </td><td> 2.6 </td><td> 1.02 </td><td> 0.34 </td><td> 33.3 </td></tr></tbody></table> 생체내의 이뇨 분석 결과 표 1. Aedes aegypti 4.에서 Aedes aegypti 모기 암컷으로 수행한 생체내의 이뇨 분석에서 ° C.의 원시 데이터

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. 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우리는 공개 할게 없다.

사용되는 RNAi 프로토콜은 캘리 포니 아주 리버 사이드 6,7 대학에서 알렉산더 Raikhel의 연구실에서 개발 Garver 및 Dimopoulos 사에 의해 출판 프로토콜과 비슷했습니다. 이 비디오 프로토콜에 표시된 실험적 접근 방법은 생체내 환경에의 곤충 이뇨에 관련된 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 곤충, Malpighian의 tubules의 배설 기관은 이뇨를위한 &#39;단순&#39;모델 시스템으로...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 고수익 키트 </td><td> Ambion 주식 회사 </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 버퍼 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 한 ML 플라스틱 피펫 팁 </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> 블루 팁 </td></tr><tr><td> 한 ML의 주사기 </td><td> Becton, 디킨스와 회사 </td><td> 309,602 </td><td></td></tr><tr><td> 가위 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 금속 바늘 </td><td> 캐롤라이나 체액 </td><td> 654,307 </TD&gt; <td> 크기 5 </td></tr><tr><td> 패드 들아 </td><td> Genesee 과학 </td><td> 789,060 </td><td></td></tr><tr><td> 배터리 구동 흡인기 W / 컬렉션 유리병 </td><td> UPMA 실험실 </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 파인 팁 포셉 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,095 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 모세관 바늘 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> 스테레오 해부 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> 분석 정밀도의 균형 </td><td> Mettler 톨레도 </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 84,097 </td><td></td></tr><tr><td> 1 파인트들이 줄지어 종이 컵 닦았단 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> 제조 수프 컵 </td></tr><tr><td> 메쉬 네트 </td><td> 지역 업체 </td><td></td><td> 플라스틱 플라이 거즈 </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

이 비디오 프로토콜은 곤충에서 특정 유전자를 분해하고 배설 률을 측정하는 소설 bioassay를 수행하기위한 효과적인 기법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충의 이뇨 과정의 이해를 얻는 데 사용하며 단일 혈액 식사에서 액체의 엄청난 양의 걸릴 수있는 혈액 먹이를 arthropods의 이뇨의 연구에 특히 유용합니다. 생체내의 이뇨 분석에서와 결합된 이러한 RNAi - 중재 유전자 최저는 Aedes aegypti 모기 이뇨 1 aquaporin 유전자의 RNAi-매개 최저의 효과를 연구하기 위해 한센병 연구소에 의해 개발되었다. 프로토콜은 두 부분의 설정은 다음과 같습니다 첫 번째 데모는 간단한 모기 분사 장치를 구성하는 방법과 RNAi - 중재 유전자 최저에 대한 모기의 흉부에 dsRNA를 준비하고 주입하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 데모를 결정하는 방법을 보여줍니다생체내의 bioassay에를 사용하여 모기의 배설 속도.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를 결합<em&gt; 생체내에서</em관심있는 유전자의 효과 최저를 공부하기&gt; 이뇨 분석은 모기 유체 배설에 있습니다.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

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Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.4K 조회수.  New Mexico State University. 이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를 결합 생체내에서 이뇨 분석은 모기 유체 배설에 있습니다.