O pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vetores foram um presente amável da DG Schatz eo pVSV-G, PRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vetores foram um presente amável da BR Cullen.

1. Amostras de preparação e células <ol><li> Realizar uma preparação de médio porte de DNA (midiprep) da superexpressão ou shRNA contendo construções e as embalagens retroviral vector pKat2 ou os vetores embalagem lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE e PRSV-Rev 25. Use 6 mg DNA para cada construção e ou mcg 4 de pKat2 (para infecções retrovirais) ou 1,5 mg de DNA para cada um dos pVSV-g, pMDLg / pRRE, e vetores PRSV-Rev embalagem (para infecções lentiviral). </li><li> Prepare BOSC 23 meios de comunicação. Para transfecção, use ambas as médias não emendada Dulbecco modificado Eagle (DMEM), bem como DMEM completo. Para fazer DMEM completo, adicionar 1% tampão HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (PGS), e 10% soro bovino recém-nascidos (NCS) para uma garrafa de DMEM. </li><li> Prepare Ramos mídia. Para a etapa de infecção, tornam completo RPMI-1640 (RPMI) pela adição de HEPES 1%, PGS 1% e 10% de soro fetal bovino (FBS) para uma garrafa de RPMI. Para a etapa única célula semeadura, make &quot;condicionados&quot; media crescendo células Ramos em RPMI completo para dois dias, girando as células para baixo a 400 X g por 4 minutos e filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,2 m em um frasco estéril. À semelhança de outros meios de comunicação completa, media condicionado é armazenada a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Dividido 3 x 10 6 BOSC 23 células em um prato de 100 mm em 10 mL DMEM completo no dia anterior transfecção de modo que as células serão a 50-60% da confluência dias de transfecção. Faça uma placa de células para cada vetor você planeja transfecting. É importante que as células não foram mantidas em cultura por muito tempo; usar células passagem baixo número ou células recém-descongeladas tanto para transfecção e infecção passos para garantir uma boa infecção. </li><li> Incluem controles para suas experiências. Para transfections e infecções, criar um controle negativo (células não infectadas ou untransfected) e um controle positivo (vírus que expressa GFP e puromicina resistência gene). Para shRNA exper knock-downiments, infectar um poço com uma embaralhada ou controle shRNA irrelevante. </li></ol> 2. Transfecting BOSC 23 células <ol><li> Aquecer a garrafas de DMEM e DMEM sem alterações, completa a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia da BOSC 23 células e substituir com 5 mL de DMEM completo. As células voltem ao a 37 ° C até o uso da incubadora no passo 2.6. </li><li> Aquecer a garrafa de FuGENE 6 em temperatura ambiente por 5 minutos e brevemente vortex (&lt;1 segundo). </li><li> Alíquota de 600 mL DMEM sem alterações, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Diluir 30 mL FuGENE 6 na 600 mL DMEM sem alterações, brevemente vortex (&lt;1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por cinco minutos. Tenha o cuidado de pipetar diretamente na mídia. Não deixe que os 6 FuGENE tocar os lados do tubo. </li><li> Adicionar 6 mg construir e ou 4 mg pKat2 (infecções retrovirais) ou 1,5 mg cada um dos pMDLg, pVSV-G / pRRE e PRSV-Rev (infecções lentiviral) para o DMEM / 6 FuGENE mix, vortex bri<html> efly (&lt;1 segundo), e depois deixe em temperatura ambiente por 25 minutos. </li><li> Adicione o DNA / DMEM / 6 FuGENE mix para o BOSC 23 células e retornar para a 37 ° C incubadora por 24 horas. </li><li> Após 24 horas, adicionar 5 mL DMEM completo para as células transfectadas e retornar para a 37 ° C incubadora por mais 24 horas. </li></ol> 3. Colheita partículas virais <ol><li> Colheita os 10 ml de mídia da transfectadas BOSC 23 células com uma seringa de 10 mL. </li><li> Anexar um 0,45 mM filtro para o final da seringa e do filtro da mídia em um tubo limpo de polipropileno de 15 mL. </li><li> Use a mídia viral imediatamente ou congelar como um alíquotas mL em 2 mL frascos criogênicos a -80 ° C. </li><li> Após a colheita os meios de comunicação viral, confirmam que a transfecção eficiente ocorreu nas células controle positivo por FACS. Isso também pode ser feito para todas as amostras se a construir contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1). </li></ol>ESIGNAÇÃO &quot;&gt; 4. Infectar células B <ol><li> ML de semente 2 de 2 x 10 5 células / mL Ramos células em RPMI completo em uma placa 6-bem 24 horas antes da infecção. Novamente, não se esqueça de usar células passagem baixo número ou células recentemente descongelada para garantir a boa infecção. </li><li> Se usar alíquotas de vírus congelados, descongele a mídia viral rapidamente a 37 ° C. </li><li> Misture 1 mL de mídia viral com 3 mL de 10 polibrene mg / mL. A concentração final de polibrene deverá ser de 10 mcg / mL em um volume total de 3 mL. </li><li> Adicione a mistura de vírus / polibrene para as células e misture bem por pipetagem. Como mencionado anteriormente, um bem deve ser usado como um controle não infectados; adicionar 1 mL RPMI completo e 3 mL polibrene a este bem, em vez de vírus de 1 mL. Certifique-se de infectar um bem com um controle pareado negativo. Nós também infectar um bem com um vetor contendo GFP, para determinar a eficiência de infecção por FACS. </li><li> Centrifugar a placa de 6 poços em 3000 X g por 90 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Devolver a placa paraa 37 ° C incubadora por 48 horas. </li><li> Após 48 horas, girar as células infectadas em um tubo de polipropileno de 15 mL a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Remova a mídia por aspiração, certificando-se de não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em RPMI fresco. </li><li> Confirmar a eficiência de infecção na amostra de controlo positivo por FACS. Como antes, você pode fazer isso para todas as suas amostras, se a construção contém quer um (GFP, por exemplo) ou um marcador fluorescente na superfície celular (por exemplo, Thy1). </li><li> Iniciar seleção de células (se for o caso). Nosso shRNA contendo construções contêm um cassete de resistência puromicina. Nós selecionamos as células infectadas shRNA Ramos com 0,25 mcg / mL puromicina. Nós encontramos que os derivados de células Ramos, por vezes mostram alterações suscetibilidade a puromicina e, portanto, realizamos matar curvas para otimizar a concentração de puromicina para cada derivado. Também tratar células controle não infectadas com puromicina para confirmar que a seleção é eficaz. </li></ol> &lt;class = p &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Semeadura única célula Semeadura só pode ser realizada de duas maneiras: por FACS classificação ou manualmente. <ol><li> FACS: Use um classificador FACS com um adaptador de placa para celular sementes 1 / bem em uma placa de 96 poços pré-cheia com 100 mL de 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Este método dá um monte de clones celulares mais simples por placa. </li><li> Manualmente: Contagem das células. Diluir uma alíquota de células a 10 células / mL em 40% RPMI/40% condicionado media/20% FBS. Use 10 mL de células diluída para cada placa semeada. Diferentes clones irá mostrar recuperação variável nesta fase, portanto, é útil a criação de várias chapas em diferentes concentrações (variando de 3 a 20 células / mL). Use aquele que produz conseqüências menos para evitar clones resultantes de várias células). Use uma pipeta multicanal para sementes de placas de 96 poços com 100 mL de células diluída. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 2 semanas. </li><li> Verificação individual poços under ao microscópio para confirmar a presença de células um dia após a semeadura. Células individuais podem ser difíceis de encontrar devido à necessidade de se concentrar na profundidade correta. Focalizando os números bem impresso na parte inferior da placa de 96 poços deve ajudar. Células são mais fáceis de encontrar quando semeado pela classificador FACS pois a maioria dos poços tem uma célula. </li><li> Após 2 semanas, colônias de crescimento pode ser mal visto pelo olho nu, olhando para as placas de baixo. Eles são muito mais fáceis de ver sob o microscópio. Colônias tendem a crescer ao longo das bordas das colônias mais bem e normalmente em uma placa de crescer ao longo da mesma borda em poços diferentes. Mark poços com crescimento celular robusta e transferência das células para placas de 24 poços em 1 mL RPMI e retornar para a 37 ° C incubadora. </li><li> Manter as células em 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células / mL. Troque a mídia girando as células a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente e remover a mídia, conforme necessário. Substituir com 1 mL RPMI fresco. </li><li> Depois de várias days de crescimento, a transferência das células para uma placa de 6 poços e continuar crescendo em um 37 ° C incubadora. </li><li> Após 3 semanas, analisar os clones para a perda de IgM (como descrito abaixo). </li><li> Continuar a crescer as células para mais 2 semanas e depois analisar os clones novamente no ponto de tempo de 5 semanas. </li></ol> 6. Análise: a perda de IgM (3 semanas e 5 semanas) <ol><li> Alíquota de 5 x 10 5 células de cada poço em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e girar as células para baixo em 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. Utilização de células de cada um dos e controle de shRNA-knock-down poços, bem como uma amostra para um controle sem mácula. </li><li> Lave as células em 1 ml de PBS e depois girar novamente a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender em 50 mL de PBS (controle sem mácula) ou PBS + diluição 1:20 da PE-anticorpo marcado IgM α-humano. Incubar no gelo por 1 hora. </li><li> Spin the células para baixo a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar os cells duas vezes com 1 mL de PBS e girar para 400 X g por 4 minutos cada vez que a temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em 100 mL de PBS. Transferência de células ressuspenso manchado a um tubo FACS. </li><li> Analisar as células usando uma máquina FACS. </li><li> Compare o percentual de IgM - células dos controles contra o shRNA knocked-down células. Como observado anteriormente, a perda de IgM medida pelo FACS é uma medida semi-quantitativa confiável de SHM em células Ramos. </li></ol> 7. Análise: Confirmar knock-down por RT-PCR quantitativa (5 semanas) <ol><li> Alíquota de 3 x 10 6 células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare RNA a partir da alíquota de células. Usamos TRIzol de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Prepare cDNA a partir do RNA prep. Nós usamos 2 mg RNA e Sobrescrito II de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Realizar uma PCR quantitativa usando o cDNA para confirmaçãom knock-down. Usamos GAPDH como controle, normalização e do kit SYBR qPCR FAST em um volume de 10 L de reação total. </li></ol> 8. Análise: o seqüenciamento genômico (5 semanas) <ol><li> Alíquota de 5 x 10 6 células de cada poço e spin down a 400 X g por 4 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Isolar DNA genômico a partir dessas células. Nós usamos o Assistente de genômica SV kit de purificação de DNA de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> PCR amplificar o DNA genômico para os genes Ig V 19 (Tabela 1) e quaisquer outros genes de interesse usando o KAPA DNA polimerase HiFi. Usamos essa polimerase por causa de sua baixa taxa de erros, mas qualquer de alta fidelidade da polimerase PCR deve ser aceitável. </li><li> Gel purificar a produtos de PCR em um gel de agarose 1% utilizando o kit de extração QIAquick gel. </li><li> Alguns polimerases adicionar um único resíduo de (A) desoxiadenosina para termina o 3 &#39;dos ​​produtos de PCR, enquanto outros não. Estes 3 &#39;A cauda são necessários para o TOPO TAetapa de clonagem. O KAPA polimerase HiFi não deixa três &#39;A cauda. A cauda dos produtos PCR por incubação de 25 mL de gel-purificada produto de PCR com 3 tampão de reação 10x Taq mL, 1 mL 10 mM dNTPs, e uma unidade de Taq polimerase a 72 ° C por 30 minutos. </li><li> Clone os produtos gel de PCR purificados usando o kit TOPO TA Cloning. Transformar os produtos da reação para o TOPO E. desde coli DH5α-T1 R células competentes e placa de LB / ágar placas contendo 100 mg / mL ampicilina e suplementado com 1,6 mg de X-gal de acordo com recomendações do fabricante. </li><li> Enviar colônias individuais para o seqüenciamento. </li><li> Realizar análises para determinar a seqüência de tipos e locais de mutações. </li></ol> 9. Resultados representativos: Como observado anteriormente, usamos um vetor viral de controle positivo que expressa tanto GFP, bem como um gene puromicina-resistência. Se costuma ver 50-75% de células GFP + dois diasapós transfecção. Em nossa infecções, nós tipicamente ver as células 50-70% são GFP + dois dias após a infecção, mas antes da seleção. Após a seleção estiver completa,&gt; 95% das células são + GFP. Como experimentos representante, vamos mostrar os efeitos da superexpressão de AID ou derrubar um fator de reparo em células Ramos. Especificamente, nós transfectadas um vetor retroviral para superexpressão AID ligados através de um sítio para IRES Thy1.1 juntamente com o vetor retroviral embalagem pKat2 BOSC em 23 células. Vírus contendo-media foi filtrado e então usado para infectar as células Ramos. Ambos tipo selvagem (WT) e superexpressão AID (AID oi) células foram semeadas única célula e cresceu durante 3 semanas, altura em que eles foram analisadas para expressão gênica por qRT-PCR (Figura 2) e para a perda de IgM por FACS (Figura 3 ). Para a coloração FACS, as células foram incubadas com tanto diluída 1:20 PE-rotulados α-humano de anticorpos IgM, assim como 1:400 diluídos FITC marcado CD90/mouse α rat-CD90.1 (Thy1.1) de anticorpos. Em um experimento separado, contendo um ou outro um lentivírus shRNA irrelevantes (controle) ou um shRNA contra um fator de reparo de alta fidelidade DNA esperado para proteger contra SHM foram feitas em BOSC 23 células, e depois infectados em um clone de células AID oi Ramos. Mais uma vez, a expressão do gene (Figura 4) e perda de IgM (Figura 5) foram analisados ​​em clones única célula depois de 3 semanas. Desde que o fator de reparação é pensada para fornecer proteção contra mutações durante SHM, vemos um aumento na perda de IgM e SHM na ausência do fator. Se tivéssemos knocked-down um fator envolvido na geração de SHM mutações associadas, teríamos visto uma diminuição na perda de IgM em seu lugar. Como esperado, a nossa qRT-PCR resultados mostram um aumento significativo na expressão AID após a infecção de células com um vetor de superexpressão AID (Figura 2), enquanto os níveis do fator de queda de reparo de DNA na presença de um shRNA dirigidas contra esse fator (Figura 4 ). Porque clon individuaises podem variar, você poderá ver alguma variação nos níveis de expressão do gene. Porque a expressão do gene pode variar, é necessário para confirmar a expressão em cada clone você está pensando em analisar mais. ShRNAs diferentes contra o mesmo gene pode ter efeitos diferentes sobre a expressão gênica, bem, então você deve tela shRNAs vários para determinar qual tem o maior impacto. Knockdown também pode ser confirmado a nível de proteínas por immunoblotting. Da mesma forma, clones individuais podem variar muito em níveis de perda de IgM. Alguns clones poderiam demonstrar um &quot;jackpot&quot; efeito, onde uma mutação IgM ocorreu em uma das divisões celulares mais antigos - por exemplo, você verá&gt; perda de IgM 50%, simplesmente porque uma das células ficou IgM - no estágio de duas células. A influência desses clones é minimizada pelo cálculo da mediana para vários clones única célula. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de transinfecção perfeição, e análise de perda de IgM. Veja o texto para mais detalhes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" /> Figura superexpressão AID 2. Células em Ramos. WT e células AID oi Ramos foram clonados e única célula cultivada por três semanas, em que a expressão ponto AID em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" /> Figura 3. Aumento da perda de IgM em células oi AID, em comparação com as células WT. IgM de superfície foi medida por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado para WT e células oi AID. (A) Representante FACS enredo de um clone WT e um clone AID oi. A AID superexpressão vector tem AID ligados à Thy1.1 através de um site IRES, assim Thy1.1 expressão é usada como um substituto para a expressão AID. (B) A determinação quantitativa da perda de IgM em WT e vários clones AID oi. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" /> Figura 4. Knockdown de um fator de reparo em células oi AID. Células foram infectadas com a shRNA um controle irrelevante (controle) ou o nosso shRNA de interesse (shRNA), e única célula semeado. Após 3 semanas, expressão gênica em clones individuais foi medida por qRT-PCR. Expressão GAPDH foi utilizado para a normalização. WT foi definido como 1. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" /> Figura 5. IgM perda Maiorem células AID oi com níveis knocked-down de um fator de reparo. IgM de superfície em vários clones foi medido por FACS no ponto de tempo três semanas, ea porcentagem de perda de IgM foi calculado em células AID superexpressão ainda. O valor médio é indicado. * Indica valor de p = &lt;0,01, calculado como um estudante uni-caudal t-teste. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Seqüências tabela 1 Primer para a genes de Ig 19:. Cμ a região constante, a cadeia pesada região V (V H), ea luz da cadeia região V (V L).

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Como discutido anteriormente, os modelos de celular da linha de diversificação de anticorpos se tornaram um popular ponto de partida para identificar novas proteínas que influenciam diferentes etapas durante a diversificação de anticorpos. Apresentamos aqui um método para usar infecção viral às proteínas ou knock-down ou superexpressam na linha de Ramos de células B e em seguida, examinar o impacto sobre a SHM. Para esses estudos, utilizamos tanto WT Ramos e células AID oi</...

Reagentes sugerido - a maioria destes pode ser substituído por produtos similares de outros fornecedores. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th > Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td > 6-bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 poços de poliestireno com fundo transparente plana TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 milímetros TC tratados com placas de cultura </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de seringa Acrodisc, 0,45 mM </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL em água </td></tr><tr><td > BD FACSCanto citômetro de fluxo II </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ou similar </td></tr><tr><td> BD Falcon poliestireno rodada tubos de fundo </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > para FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 células </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > Incubadora de CO 2 capazes de 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (soro fetal bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rato CD90/mouse CD90.1 anticorpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE Reagente Transfection 6 </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solução tampão HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA DNA polimerase HiFi </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo lisogenia - Luria) Pó </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSÃO TRC shRNA estoque glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> vetores shRNA </td></tr><tr><td > NCS (recém-nascido soro bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solução tampão fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluída em água para 1x </td></tr><tr><td > PE α-humano de anticorpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solução) </td><td > Gémeos Bio-Produtos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polibrene (Hexadimetrina brometo) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL em água </td></tr><tr><td > PureYield Sistema Midiprep Plasmid </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mcg / mL em água </td></tr><tr><td > QIAquick extração de gel kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 médio </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA polimerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning kit </td><td > Invitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Assistente de Genomic SV sistema de purificação de DNA </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / mL em DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

Células B começam sua vida com os anticorpos de baixa afinidade gerada pela recombinação V (D) J. No entanto, após a detecção de um patógeno, a variável região (V) de um gene de imunoglobulina (Ig) é mutante aproximadamente 100.000 vezes mais do que o resto do genoma através hipermutação somática (SHM), resultando em alta de 1,2 anticorpos de afinidade. Além disso, a recombinação classe switch (CSR) produz anticorpos com diferentes funções efetoras, dependendo do tipo de resposta imune que é necessário para um determinado patógeno. Ambos RSE e SHM são iniciadas pela ativação induzida citidina desaminase (AID), que deaminatos resíduos citosina no DNA para produzir uracils. Estes uracils são processados ​​por formas propenso a erros de vias de reparo, acabou levando a mutações e recombinação 1-3. Nossa compreensão atual dos detalhes moleculares da SHM ea RSE vêm de uma combinação de estudos em camundongos, células primárias, linhas de células, e células-fexperimentos ree. Modelos de ratos permanecem o padrão-ouro com nocautes genética mostrando papéis críticos para reparar muitos fatores (por exemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerase η) 4-10. No entanto, nem todos os genes são passíveis de estudos nocaute. Por exemplo, nocautes de várias cadeias duplas proteínas de reparo estão embrionariamente quebrar letal ou prejudicar o desenvolvimento das células B 11-14. Além disso, por vezes, a função específica de uma proteína em SHM ou CSR pode ser mascarada por mais defeitos global causado pelo nocaute. Além disso, desde experimentos em camundongos pode ser demorado, alterando a expressão de genes individuais em linhas de celular tornou-se um passo cada vez mais popular primeiro a identificar e caracterizar genes candidatos 15-18. Ramos - uma linha de células de linfoma de Burkitt que constitutivamente sofre SHM - tem sido um modelo de celular da linha popular de estudo SHM 18-24. Uma vantagem das células Ramos é que eles têm uma semi built-in conveniente-Quantitativa medida da SHM. Células de tipo selvagem expressar IgM e, como eles peguem mutações, algumas das mutações knock out expressão IgM. Portanto, dosagem de perda de IgM por fluorescência-ativado de varredura de células (FACS) fornece uma rápida leitura para fora para o nível de SHM. A medida mais quantitativa da SHM pode ser obtida diretamente seqüenciamento dos genes dos anticorpos. Como as células Ramos são difíceis de transfecção, que produzem derivados estáveis ​​que têm aumentado ou abaixado expressão de um gene individual por infectar as células com construções retroviral ou lentiviral que contêm um cassete de superexpressão ou um curto hairpin RNA (shRNA), respectivamente. Aqui, descrevemos como nos infectar as células Ramos e depois usar essas células para investigar o papel de genes específicos em SHM (Figura 1).

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.

Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K visualizações.  Duke University. Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...