El pMSCV-AID-I-Thy1.1 y pKat2 vectores eran una especie de regalo de la Dirección General de Schatz y el pVSV-G, PRSV Ap-, y pMDLg / pRRE vectores eran una especie de regalo de BR Cullen.

<ol>
	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. 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No hay conflictos de interés declarado.

Como se mencionó anteriormente, los modelos de líneas celulares para la diversificación de anticuerpos se han convertido en un popular punto de partida para identificar nuevas proteínas que influyen en los diferentes pasos en la diversificación de anticuerpos. En este trabajo presentamos un método para el uso de la infección viral a las proteínas ya sea derribo o sobre-expresan en los Ramos de células B línea y luego examinar el impacto en SHM. Para estos estudios, que utilizan tan...

Reactivos sugiere - la mayoría de estos pueden ser sustituidos con productos similares de otros fabricantes. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th > Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td > 6-y claro TC tratados con placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-alejado TC-tratados placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 pocillos de poliestireno claro fondo plano TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-tratados placas de cultivo </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de jeringa Acrodisc, 0,45 m </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarosa </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > o similar </td></tr><tr><td> BD Falcon tubos redondos inferior de poliestireno </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > por FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 celdas </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 capaz de incubadora a 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modificado de Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (suero fetal bovino) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rata CD90/mouse CD90.1 anticuerpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfección reactivo </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solución tampón HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi ADN polimerasa </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo de lisogenia - Luria) en polvo </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISIÓN TRC ARNhc acciones glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> ARNhc vectores </td></tr><tr><td > NCS (suero de ternera recién nacido) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solución buffer fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluye a 1x en el agua </td></tr><tr><td > PE-α humana de anticuerpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solución) </td><td > Gemini Bio-Productos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimetrina bromuro) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > PureYield plásmido sistema Midiprep </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 pg / mL en el agua </td></tr><tr><td > QIAquick gel extracción kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (AR 1) las células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > Superíndice II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq ADN polimerasa </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA kit de clonación </td><td > In vitrogeneración </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Asistente de purificación de ADN genómico SV sistema </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml en DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

Las células B comienzan su vida con los anticuerpos de baja afinidad generado por V (D) J recombinación. Sin embargo, al detectar un patógeno, la variable (V) la región de una inmunoglobulina (Ig) del gen se encuentra mutado aproximadamente 100.000 veces más que el resto del genoma a través de hipermutación somática (SHM), resultando en una alta afinidad 1,2 anticuerpos. Además, la recombinación de cambio de clase (CSR) produce anticuerpos con diferentes funciones efectoras dependiendo del tipo de respuesta inmune que se necesita para un patógeno en particular. Tanto la RSE y SHM se inician por la citidina deaminasa inducida por activación (AID), que desamina residuos de citosina en el ADN para producir uracilos. Estos uracilos son procesados ​​por las formas propenso a errores de las vías de reparación, con el tiempo provocando mutaciones y recombinación 3.1. Nuestra actual comprensión de los detalles moleculares de SHM y RSE provienen de una combinación de estudios en ratones, las células primarias, las líneas celulares, y el F-Cellexperimentos de REE. Modelos de ratones siguen siendo el estándar de oro con nocauts genética que muestra un papel crítico para la reparación de muchos factores (por ejemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1, y de la polimerasa η) 4-10. Sin embargo, no todos los genes se prestan a los estudios de octavos de final. Por ejemplo, golpes de gracia de varios de doble filamento romper las proteínas de reparación son embrionariamente letal o poner en peligro el desarrollo de células B 14/11. Por otra parte, a veces la función específica de una proteína en SHM o CSR pueden estar enmascarados por más defectos global causado por el golpe de gracia. Además, puesto que los experimentos en ratones pueden ser largos, alterando la expresión de genes individuales en las líneas celulares se ha convertido en un primer paso cada vez más popular para la identificación y caracterización de genes candidatos 15-18. Ramos - un linfoma de Burkitt línea celular que constitutivamente se somete a SHM - ha sido una popular línea celular modelo para estudiar SHM 18-24. Una de las ventajas de las células de Ramos es que tienen una semi-construido en práctica-Cuantitativa medida de SHM. Las células de tipo salvaje expresa IgM y, como recogen las mutaciones, algunas de las mutaciones eliminar la expresión de IgM. Por lo tanto, analizando la pérdida de IgM mediante el escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona una rápida lectura para el nivel de SHM. Una medición más cuantitativa de la SHM se puede obtener por secuenciación directa de los genes de anticuerpos. Dado que las células Ramos son difíciles de transfectar, producimos derivados estables que han aumentado o reducido la expresión de un gen individual al infectar las células con las construcciones retrovirales o lentiviral que contienen un casete de sobreexpresión o una corta horquilla de ARN (siRNA), respectivamente. Aquí se describe la forma en que infectan a las células Ramos y luego utilizar estas células para investigar el papel de genes específicos en el SHM (Figura 1).

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K vistas.  Duke University. Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.